Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây bán chi liên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Tuấn Phong NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY BÁN CHI LIÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội , 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Tuấn Phong NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY BÁN CHI LIÊN Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440112.02 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đỗ Thị Việt Hương Hà Nội , 2018 LỜI CẢM ƠN Luận văn thạc sỹ khoa học thực phịng thí nghiệm Hóa DượcKhoa Hóa học- Đại học Khoa Học Tự Nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Việt Hương người giao đề tài, quan tâm, hướng dẫn, tận tình em suốt thời gian làm luận văn Em xin chân thành cảm ơn tất thầy giáo anh chị phịng nghiệm hóa dược bảo, hướng dẫn tận tình để em hồn thành luận văn Cuối em xin gửi lời cảm đến gia đình em, bạn bè ngừơi bên em động viên giúp đỡ em thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2018 Học viên Nguyễn Tuấn Phong MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Khái quát bán chi liên (Scutellaria barbata) 1.1.1.Đặc điểm thực vật Bán chi liên, loài Elschotzia, họ Lamiaceae 1.1.1.1 Hoa bán chi liên 1.1.1.2 Lá bán chi liên 1.1.1.3 Rễ bán chi liên 1.1.1.4 Thân bán chi liên 1.1.2 Nguồn gốc phân loại 1.1.2.1 Nguồn gốc bán chi liên 1.1.2.2 Phân loại 1.1.3 Chế biến bảo quản 1.2 Dược tính cơng dụng 1.2.1 Tác dụng trị liệu 1.2.2 Những nghiên cứu khoa học bán chi liên 1.3 Thành phần hóa học 11 1.3.1 Các hợp chất Flavonoid 11 1.3.2 Hợp chất Alkaloids 14 1.3.3 Polysaccharide 15 1.3.4 Diterpenes 15 1.3.5 Triterpenoids 15 1.3.6 Tinh dầu 16 1.3.7 Các hợp chất khác 16 1.4 Hoạt tính sinh học bán chi liên 17 1.4.1 Khả chống oxi hóa 17 1.4.1.1 Tổng Flavonoid 18 1.4.1.2 Tổng phenolic 18 1.4.2 Hoạt tính ức chế enzim -Glucosidase 20 1.5 Giới thiệu tổng quát bệnh tiểu đường 21 1.5.1 Tổng quan bệnh tiểu đường 21 1.5.2 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Scutellaria 22 1.5.3 Tình hình nghiên cứu nước 25 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 27 2.2 Thực nghiệm 27 2.1.1 Ngâm chiết mẫu nghiên cứu 27 2.2.2 Sắc kí khí khối phổ (GC/MS) 28 2.2.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 28 2.2.4 Sắc ký cột thường (CC) 29 2.2.5 Phân tích cặn chiết sắc ký cột thường 29 2.2.6 Khảo sát số số hóa học hoạt tính sinh học 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Chiết lớp chất từ mẫu thực vật bán chi liên 35 3.2 Khảo sát dịch chiết sắc ký khí khối phổ GC/MS nhằm dự đốn chất mong muốn 3.2.1 Khảo sát định tính dịch chiết n-hexan (HS) hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 3.2.2 Khảo sát định tính dịch chiết diclometan (DS) hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 3.3 Khảo sát cặn chiết sắc ký lớp mỏng TLC nhằm tìm hệ dung mơi tách thích hợp 3.4 Nhận dạng hợp chất phân lập từ phần chiết hệ thống sắc ký khí khối phổ GC/MS 37 37 41 45 46 3.4.1 Nhận dạng hợp chất phân lập từ phần chiết diclometan (DS) 46 3.4.2 Nhận dạng hợp chất phân lập từ phần chiết etylacetat (ES) 48 3.5 Khảo sát số số hóa học hoạt tính sinh học 51 3.5.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 51 3.5.2 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 51 3.5.3 Khảo sát bắt gốc tự DPPH 53 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cây bán chi liên Hình 1.2: Hoa bán chi liên Hình 1.3: Lá bán chi liên Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo Scutebartine A 14 Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo acid scutellaric 15 Hình 2.1: Mẫu bán chi liên khơ 27 Hình 2.2: Sơ đồ phân tách phân đoạn dịch chiết diclometan 30 Hình 2.3: Sơ đồ phân tách phân đoạn phần chiết etyl acetat 31 Hình 3.1: Sơ đồ điều chế phần chiết từ mẫu bán chi liên 36 Hình 3.2: Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết n-hexan (HS) 37 Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn chiết DS 41 Hình 3.4: Sắc ký mỏng TLC dịch chiết 46 Hình 3.5a: Sắc ký đồ khảo sát hợp chất DS-tt hệ thơng GC/MS 47 Hình 3.5b: Phổ khối hợp chất DS-tt 47 Hình 3.6a: Sắc lý đồ phân đoạn ES 48 Hình 3.6b: Phổ MS hexandecanoic acid 48 Hình 3.6c: Cơng thức cấu tạo hexadecanoic acid 49 Hình 3.7a: Phổ 1H-NMR hexadecanoic acid 50 Hình 3.7b: Phổ 13C hexadecanoic acid 50 Hình 3.8: Đồ thị thể khả ức chế enzym- α-glucosidase nồng độ phần chiết Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khả bắt gốc tự DPPH dịch chiết ES, DS, HS so với mẫu acid Ascorbic 52 54 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các hợp chất Flavanoid từ bán chi liên Bảng 1.2: Khả ức chế độ hoạt động enzym α-glucosidase Flavonoid phân lập từ chi Scutellaria Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxi hóa bán chi liên Bảng 3.1: Hiệu suất dịch chiết bán chi liên 11 23 32 35 Bảng 3.2: Kết phân tích GC-MS cặn chiết n-hexan 38 Bảng 3.3: Thành phần hợp chất có dịch chiết DS 42 Bảng 3.4: Kết khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 51 Bảng 3.5: Kết khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 52 Bảng 3.6: Kết khảo sát khả bắt gốc tự DPPH 53 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CC Sắc ký cột thường DS Phần chiết diclometan bán chi liên DMSO Dimethyl Sunfoxit ES Phần chiết etyl axetat bán chi liên HS Phần chiết n-hexan bán chi liên GAE Đương lượng axit gallic (mg) GC/MS Phương pháp sắc ký khối phổ IC50: Nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động enzyme -glucosidase LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nước Việt Nam nằm vùng nhiệt đới điều kiện khí hậu nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hết điều kiện thổ nhưỡng đặc trưng thích hợp cho nhiều lồi thực vật có giá trị tồn phát triển Đó nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo Từ thời xa xưa xã hội loài người khai thác nguồn tài nguyên để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu nhiên liệu cho sống thường ngày Bán chi liên loại cỏ đa niên mọc tự nhiên nước ta coi vị thuốc quý-thần dược dùng điều trị nhiều bệnh, đặc biệt bệnh ung thư Cây thuốc gần gũi quanh sống ngày tác dụng đem lại cho y học khơng nhỏ.Do tính chất sử dụng rộng rãi, nên nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu thực vật hóa học, nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng lồi Tuy nhiên nghiên cứu thành phần hóa học, cơng dụng vị thuốc q cịn chưa đầy đủ không đồng số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu rộng tác dụng loài có nước, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bán chi liên Việt Nam” từ đưa hướng khai thác ứng dụng lồi đời sống Mục đích  Xây dựng quy trình chiết thích hợp để điều chế phần chiết từ bán chi liên  Khảo sát thành phần hóa học hợp chất có phần chiết bán chi liên  Khảo sát hoạt tính sinh học phần chiết bán chi liên diclometan lại thấp 2.7 lần so với cặn chiết etylacetate Đồng thời chất đối chứng Acarbose có IC50 183 g/ml, chất đối chứng dùng hầu hết thí nghiệm khảo sát khả ức chế độ hoạt động enzym α-glucosidase, thí nghiệm khảo sát này, ba phần chiết có IC50 nhỏ so với chất đối chứng, chứng tỏ dịch chiết có hoạt chất kiểm sốt enzyme alpha-glucosidase Đây kết khả quan để tiến hành thí nghiệm định hướng điều trị tiểu đường Như ba phần chiết dược liệu bán chi liên có tiềm cao cho tác dụng điều trị bệnh tiểu đường type II Điều với thuốc Đông y theo kinh nghiệm dân gian sử dụng bán chi liên cho việc điều trị bệnh tiểu đường 3.5.3.Khảo sát bắt gốc tự DPPH Khảo sát hoạt tính mẫu nồng độ 0.03 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml Kết khảo sát khả bắt gốc tự thể hình 3.9 bảng 3.6 Bảng 3.6: Kết khảo sát khả bắt gốc tự DPPH Nồng độ (mg/ml) 0.03 0.06 0.125 0.25 0.5 1.0 % HTCO mẫu ES 40.6 63.7 73.9 77.1 79.7 % HTCO mẫu DS 36.4 46.8 60.1 65.1 69.8 % HTCO mẫu HS 28.4 36.5 50.8 56.2 60.3 % HTCO ascorbic 44.7 70.1 81.3 84.6 87.5 53 Đồ thị biểu diễn khả bắt gốc tự DPPH dịch chiết (Bảng 3.9) 100 90 80 70 60 HTCO mẫu ES 50 HTCO mẫu DS 40 HTCO mẫu HS % HTCO ascobic 30 20 10 0.03 0.06 0.125 0.25 0.5 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khả bắt gốc tự DPPH dịch chiết ES, DS, HS so với mẫu acid Ascorbic Khảo sát khả băt gốc tự DPPH nồng độ khác từ 0,03 mg/ml đến mg/ml với chất mẫu so sánh acid asscobic (là hợp chất có khả bắt gốc tự tốt) Có thể thấy khả bắt gốc tự DPPH dịch chiết có kết khả quan Nhìn vào đồ thị ta thấy khả bắt gốc tự dịch chiết etyl acetat (ES) tốt dịch chiết, nồng độ mg/ml dịch chiết ES cho kết 79,7% so với chất mẫu 87,5% Giá trị IC50 mẫu ES 0.09 (mg/ml), mẫu DS 0.15 (mg/ml), mẫu HS 0.24 (mg/ml) mẫu so sánh acid ascorbic khoảng 0.07 (mg/ml) Do giá trị IC50 thấp khả bắt gốc tự chống lại khả oxi hóa cao, cho nên, qua số liệu ta khẳng định, khả bắt gốc tự dịch chiết etyl acetat tốt nhất, cao so với dịch chiết lại (DS HS) 54 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu bán chi liên (Scutellaria barbata), thu kết sau: Đã xây dựng quy trình điều chế phần chiết từ bán chi liên theo độ phân cực tăng dần dung môi chiết Kết thu ba phần chiết: phần chiết n-hexan (HS), diclometan (DS) etyl acetat (ES) với hiệu suất phần chiết (so với lượng nguyên liệu khô) tương ứng là: 1,853%, 2,253% 10,7% Đã khảo sát thành phần hóa học hợp chất có phần chiết n-hexan (HS) diclometan (DS) phương pháp sắc ký khí khối phổ Kết phân tích phát 21 hợp chất có mặt phần chiết HS 21 hợp chất có phần chiết DS, hợp chất:Globulol, 15-OH-lactone chlorophyll a, Hydroxychlorophyll b, Pheophytin a chiếm thành phần Đã phân tách hai hợp chất từ cặn chiết diclometan (DS) etyl acetat (ES) Dựa vào phổ khối lượng hợp chất thu đồng thời so sánh với phổ khối lượng thư viện phổ hệ thống sắc ký nhận biết hợp chất phân lập từ cặn chiết DS Globutol hợp chất phân lập từ cặn chiết ES Hexandecanoic acid Đã xác định số hóa học hoạt tính sinh học từ dịch chiết bán chi liên Việt Nam:  Tổng hàm lượng phenolic tổng hàm lượng flavonoid dịch chiết ethanol là: 70,77mg/g CK và25,72 mg/g CK  Kết khảo sát khả ức chế enzym α-glucosidase cho thấy phần chiết ES có tác dụng ức chế mạnh phần chiết HS DS với IC50 là: 28.46 µg/ml, 76.6µg/ml, 126 µg/ml 55  Kết khảo sát khả bắt gốc tự DPPH phần chiết ES, DS, HS cho thấy cặn chiết dịch chiết ES cho kết tốt , sau đến cặn chiết dịch chiết DS cuối cặn chiết dịch chiết HS với giá trị IC50 là: 0.09 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.24mg/ml 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] TS Võ Văn Chi (2015), “ Bài thuốc hay từ thuốc quý ”, Nhà xuất Y học, tr.600-612 [2] Đỗ Thị Lan Hương (2015), “ Đặc điểm hình thái, giải phẫu lịai thuẫn râu ”, tr.173-179 [3] Hà Thị Bích Ngọc (2012),“ Điều tra, nghiên cứu số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2”, tr – [4] “ Trung tâm liệu thực vật Việt Nam”, [Online], Available: http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir Tiếng Anh [5] Banjarnahor S D S and Artanti N.(2014), “Antioxidant properties of flavonoids extracted from some Vietnamese medicinal plants”,Med J Indones., vol 23, no 4, pp 239–244, [6] Benalla W and Bnouham M (2010),“ Antindiabetic medicinl plant as a source of alpha Glucosidase inhibitors”,Curr Diabetes Rev, vol.6, no 4, pp 247-254 [7] Blois M (1958), “Antioxidant detrminations by use of a stable free radical”, Nature, vol 181, pp 1199-1202 [8] Brearley T.A and Vaidya B.N (2014), “Antioxidant properties of flavonoid extracted from some Vietnamese medicinal plant ”, vol.23, no.4, pp.239-244 [9] Chen H., Yan X., Lin W., Zheng L., and Zhang W.(2004), “A new method for screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to marine microorganisms”, Pharm Biol., vol 42, no 6, pp.416-421 57 [10] Constantin R.P., Constantin J., Pagadigorria C.L., Ishii-Iwamoto E.L., Bracht A., et al (2010),“The actions of fisetin on glucose metabolism in the rat liver”, Cell Biochem Funct, Vol 28, pp 149–58 [11] Dai Z.J et al.(2013), “Protective Effects of Scutellaria Barbata against Rat Liver Tumorigensis”, Asian Pacific J.Cancer Prev., vol 14, no 1, pp.261-265 [12] Dewanto V., Wu X., Adom K., and Liu R.H.(2002), “Thermal Processing Enhances the Nutritional Value of Tomatoes by Increasing total Antioxidant activity”, J Agric Food Chem., vol 50, pp.3010-3015 [13] Fu Z, Gilbert ER, Pfeiffer L, Zhang Y, Fu Y, Liu D (2012), “Genistein ameliorates hyperglycemia in a mouse model of nongenetic type diabetes”, Appl Physiol Nutr Metab, Vol 37, pp 480–8 [14] Gong T.et al(2015)., “Inhibition of Tumor Growth and Immunomodulatory Effects of Flavonoids and Scutebarbatines of Scutellaria barbata D Don in Lewis-Bearing C57BL / Mice”,Evid - Based Complement Altern Med., vol 2015 [15] Hakamata W., Kurihara M., Okuda O., Nishio T., and Oku T.(2009), “Design and screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological information”, Curr Top Med Chem., vol 9, no 1, pp 3–12 [16] Hakkinen SH, Karenlampi SO, Heinonen IM, Mykkanen HM, Torronen AR (1999), “Content of the flavonolsquercetin, myricetin, and kaempferolin 25 edible berries”, J Agric Food Chem, Vol 47, pp 2274–79 [17] Khan T.et al(2002)., “Pharmacological activities of crude acetone extract and purified constituents of Salvia moorcraftiana Wall”,Phytomedicine, vol 9, no 8, pp 749–752 [18] Lin J.et al(2014)., “Scutellaria Barbata D Don Inhibits Colorectal Cancer Growth via Suppression of Multiple Signaling Pathways”,Integr Cancer Ther., vol 13, no 3, pp 240–248 58 [19] Lin J.et al(2014)., “Sensitisation of ovarian cancer cells to cisplatin by flavonoids from Scutellaria barbata”, Nat Prod Res., vol 28, no 10, pp 683– 690 [20] Niu C et al (2015), “Scutellarin protects against the liver injury induced by diosbulbin B in mice and its mechanism”, J.Ethanopharmacol, vol 164, pp 301-308 [21] Ong KC, Khoo HE (2000), “Effects of myricetin on glycemia and glycogen metabolism in diabetic rats”, Life Sci, Vol 67, pp 1695-705 [22] Park SA, Choi MS, Cho SY, Seo JS, Jung UJ, Kim MJ, et al (2006), “Genistein and daidzein modulate hepatic glucose and lipid regulating enzyme activities in C57BL/Ks J-db/db mice”, Life Sci, Vol 79, pp 1207-1230 [23] Sae-Kwang Ku and Jong-Sup Bae (2015), “Baicalin, baicalein and wogonin inhibits high glucose-induced vascular inflammation in vitro and in vivo”, BMB Rep, Vol 48, pp 519-524 [24] Sunil Kumar, Smita Narwal, Om Prakash.(2011), “α-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes”, Pharmacogn Rev, Vol 5, pp 19-29 [25] Vinayagam V., Xu B.(2015), “Antidiabetic properties of dietary flavonoids: a cellular mechanism review”, Nutr Metab (Lond), Vol 12, pp 60-101 [26] Wei L.et al(2012)., “Scutellaria barbata D Don inhibits tumor angiogenesis via suppression of hedgehog pathway in a mouse model of colorectal cancer”,Int J Mol Sci., vol 13, no 8, pp 9419–9430 [27] Wei L.et al(2013)., “Scutellaria barbata D Don induces G1/S arrest via modulation of p53 and Akt pathways in human colon carcinoma cells”,Oncol Rep., vol 29, no 4, pp 1623–1628 [28] Wu T.et al (2015), “Neo -clerodane diterpenoids from Scutellaria barbata with activity against Epstein-Barr virus lytic replication”,J Nat Prod., vol 78, no 3, pp 500–509 59 [29] Yang X K., Xu M Y., Xu G S., Zhang Y L., and Xu Z X (2014), “In Vitro and in Vivo Antitumor Activity of Scutebarbatine A on Human Lung Carcinoma A549 Cell Lines”,Molecules, vol 19, no 7, pp 8740–8751 [30] Yao H.et al (2011), “Chromatographic Fingerprint and Quantitative Analysis of Seven Bioactive Compounds of Scutellaria barbata”,Planta Med., vol 77, no 04, pp 388–393 [31] Ye C.L and Huang Q (2012),“Extraction of polysaccharides from herbal Scutellaria barbata D.Don ( Ban-Zhi-Lian) and their antioxidant activity “, Vol.89, no.4, pp.1131-1138 [32] Yu J., Lei J., Yu H., Cai X., and Zou G.(2004), “Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Scutellaria barbata”,Phytochemistry, vol 65, no 7, pp 881–884 [33] Zhang L.et al (2014), “Chloroform fraction of Scutellaria barbata D Don promotes apoptosis and suppresses proliferation in human colon cancer cells”,Mol Med Rep., vol 9, no 2, pp 701–706 [34] Zhu Y., Wang Z.Q., et al (1996), “Scutebarbatine a, a new neoclerodane-type diterpenoid alkaloid from scutellaria barbata”,Article in Chinese Chemical Letters, vol 5, pp 30-31 60 PHỤ LỤC 61 MS – Hexandecanoic acid 62 H-NMR - Hexandecanoic acid 63 13 C-NMR - Hexandecanoic acid 64 65 DEPT90 - Hexandecanoic acid 66 DEPT125 - Hexandecanoic acid 67 ... quy trình chi? ??t thích hợp để điều chế phần chi? ??t từ bán chi liên  Khảo sát thành phần hóa học hợp chất có phần chi? ??t bán chi liên  Khảo sát hoạt tính sinh học phần chi? ??t bán chi liên CHƯƠNG...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Tuấn Phong NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY BÁN CHI LIÊN Chuyên ngành: Hóa hữu Mã... đồng số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu rộng tác dụng lồi có nước, chúng tơi chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bán chi liên Việt Nam” từ đưa hướng