Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phí Thị Cẩm Miện NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phí Thị Cẩm Miện NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Trung Thành DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin CT Công thức CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA indol-3-acetic acid MS Murashige Skoog, 1962 LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa P - 0,5 (Leant Significant Difference) ND Nước dừa αNAA α-naphthylacetic acid MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Lan Kim tuyến 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Đặc điểm phân bố 11 1.2 Nhân giống Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 13 1.2.1 Nhân giống hạt 13 1.2.2 Nhân giống 13 1.2.3 Phương pháp giâm 14 1.2.4 Nhân giống in vitro 14 1.2.4.1 Cơ sở khoa học nhân giống in vitro 14 1.2.4.2 Ý nghĩa nhân giống in vitro 15 1.2.4.3 Các phương thức nhân giống vơ tính 18 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 18 1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện khử trùng mẫu cấy 18 1.3 Ảnh hưởng thành phần hóa học 19 1.3 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 23 1.3.4 Ảnh hưởng điều kiện 24 1.4 Quy trình sản xuất cấy mơ 25 1.5 Tình hình nghiên cứu Lan Kim tuyến 26 1.5.1.Tình hình nghiên cứu giới 26 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 27 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.2 Mục tiêu nghiên cứu 28 2.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 29 2.4 Nội dung nghiên cứu 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 2.5.2 Phương pháp đánh giá kết xử lý số liệu 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu xác định quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro 39 3.1.1 Xác định chất khử trùng thích hợp 39 3.1.2 Xác định quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu tăng hệ số nhân chồi in vitro 42 3.1.2.1 Ảnh hưởng loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu 42 3.1.2.2 Ảnh hưởng quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro 44 3.2 Nghiên cứu môi trường khởi động nhân nhanh thích hợp 45 3.2.1 Xác định mơi trường thích hợp cho ni cấy mơ Lan Kim tuyến (A setaceus) 45 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm chất điều hịa sinh trưởng riêng rẽ phối hợp đến phát sinh hình thái hệ số nhân 47 3.2.2.1 Ảnh hưởng nhóm chất Cytokinin đến phát sinh hình thái hệ số nhân 47 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA αNAA đến phát sinh hình thái hệ số nhân Lan Kim tuyến (A setaceus) 50 3.2.2.3.Ảnh hưởng phối hợp nhóm chất auxin cytokinin đến phát sinh hình thái hệ số nhân 53 3.3 Nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh 56 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường (mơi trường khơng có chất điều tiết sinh trưởng) đến rễ 56 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến rễ 58 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 4.1 Kết luận 67 4.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 75 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan biết đến loài hoa quý phái, hoa bậc vua chúa vương giả Lan phát vào năm 40 kỷ VIII, có 15.000 loại lan trồng khác trên giới Tại Việt Nam, hoa lan vô đa dạng phong phú, có khoảng 1.000 lồi hoa loại, chúng sinh sản vùng rừng, núi Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, lan Việt Nam đẹp cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có nhiều quý có trước thấy mọc Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati) Họ lan (Orchidaceae) số họ thực vật đa dạng Việt Nam, với tổng số khoảng 865 lồi thuộc 154 chi Thơng thường lan sử dụng làm cảnh Ngồi ra, có nhiều lồi lan cịn sử dụng làm thuốc Chi lan Kim tuyến Anoectochilus Việt Nam thống kê 12 lồi, có lồi lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng hầu hết tỉnh nước, biết đến nhiều giá trị làm cảnh, mà giá trị làm thuốc Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ lâu, nên loài lan Kim tuyến bị đe dọa nghiêm trọng, bị tuyệt chủng tự nhiên khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến cấp báo Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại nhóm thực vật rừng nguy cấp EN A1a,c,d, sách đỏ Việt Nam 2007 Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lồi lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume triển khai cung cấp sở khoa học thực tiễn để tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền nhằm bảo tồn phát triển lồi dược liệu nguy cấp, q Xuất phát từ sở đó, chúng tơi lựa chọn thực nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý” CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) gọi lan trang sức vẻ đẹp hấp dẫn nó, Carlvon Blume mơ tả năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae Trên giới thống kê 51 loài Ở Việt Nam thống kê 12 lồi, lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây loài đơn thân, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nước có nhiều lơng mềm, mang - mọc x sát đất Lá hình trứng, gần trịn gốc, chóp nhọn có mũi ngắn, cỡ - x - cm, mặt màu nâu thẫm có vệt vàng màu hồng nhạt gân, mặt màu nâu nhạt Cuống dài - cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - cm; môi dài đến 1,5 cm, bên gốc mang - dải hẹp, chẻ đơi thành thuỳ hình thn trịn Bầu dài 13mm, có lơng thưa Mùa hoa tháng 2, tháng Tái sinh chồi từ thân rễ hạt ít, sinh trưởng chậm Là loại ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới độ cao 500 - 1600m Mọc rải rác vài ba đất ẩm, giàu mùn rụng Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,… Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến loài thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thơng, có tính kháng khuẩn, chữa bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Loài lan dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến) Trước đó, lan Kim tuyến (A setaceus) dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi nóng gan (Tạ A Mộc Trần Kiến Đào, 1958) Hơn người ta phát khả phòng chống ung thư loại thảo dược Theo tài liệu nghiên cứu Trung Quốc công bố gần kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột kỹ thuật quang phổ phân lập, xác định cấu trúc hoá học thử hoạt tính sinh học số hợp chất có lồi lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363) Bằng kỹ thuật quang phổ xác định hợp chất hoá học Các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả làm giảm gốc tự thể, nên có khả phịng bệnh tốt Đặc biệt có hai axít hữu phân lập Olenolic acid Ursolic acid có khả chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn… 1.1.1 Đặc điểm hình thái Lan Kim tuyến thảo, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nước, mang mọc xòe sát đất a Thân rễ Lan Kim tuyến thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đơi nghiêng, bị dài Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình 7,87 cm Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình 3,17 mm Số lóng thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình 4,03 lóng Chiều dài lóng từ 1-6 cm, trung bình 1,99 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đơi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông b Thân khí sinh Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng mặt đất, mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình cm Đường kính thân khí sinh từ 3- mm, trung bình 3,08 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, lóng có chiều dài khác Số lóng thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình 2,87 Chiều dài lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, khơng phủ lơng; thường có màu xanh trắng, đơi có màu hồng nhạt c Rễ Rễ lan Kim tuyến mọc từ mẫu thân rễ Đơi rễ hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thơng thường mẫu có rễ, đơi có vài rễ hình thành từ mấu thân rễ Số lượng kích thước rễ thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ thường từ - 10, trung bình 5,4 Chiều dài rễ thay đổi từ 0,5 - cm, rễ dài trung bình 6,07cm ngắn trung bình 1,22 cm, chiều dài trung bình rễ 3,82 cm d Lá Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, x mặt đất Lá hình trứng, gần trịn gốc, đầu nhọn có mũi ngắn, thường dài từ - cm, trung bình 4,03 cm rộng từ - cm, trung bình 3,12 cm Lá có màu nâu đỏ mặt phủ lông mịn nhung Hệ gân mạng lưới lơng chim, thường có gân gốc Các gân thường có màu hồng mặt rõ Đơi gân có màu vàng nhạt Mặt có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với gân gốc rõ Các gân bên phía rìa rõ, gân ở mặt không rõ Cuống dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn có màu trắng xanh, đơi đỏ tía bẹ Bẹ rõ nhẵn Số thay đổi từ - 6, thơng thường có Kích thước thay đổi, thường có kích thước khác rõ rệt e Hoa, Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm thân, mang - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài - 10 mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, bên gốc mang - dải hẹp, đầu chẻ đôi Mùa hoa tháng 10 - 12 Mùa chín tháng 12 - năm sau Thân khí sinh Thân ngầm A B Hình 2.1 Cây (A) hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.2.1 Phân bố theo kiểu rừng: Kết điều tra rằng, lan Kim tuyến hầu hết phân bố kiểu rừng kín rộng thường xanh nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có tầng gỗ Đơi gặp lan Kim tuyến kiểu rừng kín rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới - Tầng ưu sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với loài gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v Chiều cao tầng A2 từ 15-25 m - Tầng gỗ A3: Bao gồm lồi tầng cịn nhỏ loài tầng như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum ... dược liệu nguy cấp, q Xuất phát từ sở đó, lựa chọn thực nghiên cứu đề tài:? ?Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý? ?? CHƯƠNG... Phí Thị Cẩm Miện NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42... cấp dẫn liệu khoa học loài lan (Anoectochilus setaceus Blume) , chi Lan Kim tuyến - Cung cấp sở khoa học quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume - Các kết nghiên cứu bổ sung