Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử b anthracis

Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THÀNH ĐẠT NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ĐẶC HIỆU TRÊN VỎ BÀO TỬ B anthracis Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS ĐỖ NGỌC LIÊN HÀ NỘI, 2012 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn B anthracis 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn B anthracis 1.1.2 Đặc điểm bào tử vi khuẩn B anthracis 1.1.3 Một số protein vỏ bào tử vi khuẩn than 1.1.4 BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định có mặt vi khuẩn than 11 1.2 Đại cương kháng thể 15 1.2.1 Kháng thể 15 1.2.2 Các domain định 16 1.2.3 Các domain biến thiên 17 1.2.4 Các lớp kháng thể 17 1.2.5 Phân loại kháng thể 18 1.2.6 Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng kháng thể đa dòng 19 1.3 Kháng nguyên 21 1.4 Tá chất 22 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 24 2.1.3 Hóa chất 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [1,2,4,6,11,13,15] 25 2.2.1 Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột 25 2.2.2 Kỹ thuật ELISA 26 54 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học 2.2.3 Phương pháp tinh IgG từ huyết Chuột 27 2.2.4 Định lượng protein phương pháp Bradford 28 2.2.5 Điện di protein gel polyacrylamid 12,5% 29 2.2.6 Kỹ thuật Western Blot 30 2.2.7 Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kiểm tra độ tinh protein BclA tái tổ hợp trước gây đáp ứng miễn dịch 34 3.2 Kiểm tra mẫu huyết chuột trước gây đáp ứng miễn dịch 35 3.3 Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp chuột 36 3.5 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than kỹ thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch 44 3.6 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than phương pháp Western blot 45 3.7 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis B subtilis que thử dạng sắc ký miễn dịch 47 KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 50 KẾT LUẬN: 50 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 55 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học MỞ ĐẦU Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học đưa vào thực tiễn từ sớm Cho đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng thành cơng sản phẩm hệ miễn dịch vào lĩnh vực sống Y học điều trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát bệnh, phát tác nhân vi sinh vật, loại độc chất, ma túy, khoa học hình sự, phát nhiễm mơi trường… với nhiều phương pháp ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật sử dụng đến sản phẩm hệ miễn dịch kháng thể đa dòng kháng thể đơn dòng Ngày nay, vi sinh vật nguy hiểm có vi khuẩn than (B anthracis ) sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố Hiện nay, giới xuất nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch thương mại hóa Chúng có ưu điểm thời gian cho kết nhanh chóng, độ xác cao, giá thành loại test mức cao thời gian nhập lâu Mặt khác, Việt Nam, vi sinh vật chủ yếu phát qua phương pháp PCR, ELISA Nhược điểm phương pháp cần thời gian lâu kết Do đó, cần phải có cơng cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát sớm có mặt tác nhân vi sinh vật Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu vỏ bào tử B anthracis.” Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Mục tiêu đề tài bao gồm:  Tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein đặc trưng vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein sản xuất theo đường tái tổ hợp)  Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dịng với protein vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis Đây bước đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kháng thể đơn dịng Viện Kỹ thuật Hóa sinh Tài liệu Nghiệp vụ Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật-Bộ Công An Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn B anthracis 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn B anthracis B anthracis (vi khuẩn than) vi khuẩn xác định vi khuẩn gây bệnh Vào năm 1877, R Koch nuôi vi khuẩn dạng chủng khiết, chứng minh khả hình thành bào tử gây bệnh than thực nghiệm cách cấy vào thể động vật Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae Chi Bacillus trực khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện Các vi khuẩn gồm nhiều loài, đa số không gây bệnh, số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B cereus), số có lợi cho người (B subtilis , B thuringiensis, B mycoides) B anthracis có đặc điểm khác biệt với lồi trực khuẩn hiếu khí có bào tử tính có độc lực B anthracis có plasmids pXO1; pXO2 plasmid mã hố capsule, vỏ hình thành môi trường giàu chất dinh dưỡng, nuôi cấy môi trường dinh dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, nhiệt độ 37C điều kiện giàu CO2 (20%) [3] Về mặt hình thái, vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vng, có kích thước từ 11,5 310m, thường xếp thành chuỗi giống tre, bắt màu Gram (+) Ở điều kiện ngoại cảnh môi trường ni cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình thành bào tử, nằm thân khơng làm thay đổi hình thể vi khuẩn Trên động vật bị bệnh môi trường ni cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ Trong môi trường lỏng vi khuẩn không di động [5] Vi khuẩn B anthracis Bào tử vi khuẩn B anthracis Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Khuẩn lạc có kích thước lớn, đường kính 0,3 - 0,5 cm Màu khuẩn lạc trắng đến trắng ghi Bề mặt khuẩn lạc ướt, dính, khơng gây tan huyết thạch máu cừu (nhưng thạch máu thỏ gây tan huyết) Trong chương trình vũ khí sinh học (VKSH) vi khuẩn gây bệnh than B anthracis coi tác nhân sinh học thường đựơc ý quan tâm nhiều trực khuẩn than tồn thiên nhiên dạng nha bào (bào tử) thời gian 10 năm, có khả chịu nhiệt 160 độ C vòng phút, chịu nước sôi đến 10 phút Người bị nhiễm bệnh than qua đường: qua da, đường tiêu hoá đường thở Bào tử than bị hít thở qua mũi chúng có khả vào tới phế nang để gây bệnh than thể hô hấp cư trú phế bào phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho trung thất Tại vi khuẩn gây bệnh than sinh trưởng xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết nhiễm khuẩn nhiều nơi thể, gây tỷ lệ tử vong cao [3] Độc tố vi khuẩn than có tham gia yếu tố cấu thành: kháng nguyên bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác yếu tố gây phù nề (Edema Factor -EF) yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nhập vào tế bào vật chủ gây độc Về chất peptid thân vi khuẩn sinh Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính vật chủ làm cho tế bào khơng có khả thực bào để tiêu diệt vi khuẩn Các nhà nghiên cứu cho yếu tố gây chết vi khuẩn than kích thích đại thực bào sản sinh TNF-alpha interleukin-1-beta (cả hai yếu tố thành phần hệ miễn dịch có tác dụng phản ứng viêm sốc phản vệ) yếu tố gây chết vật chủ Đây yếu tố khác biệt chủ yếu so với chủng B anthracis cereus…[9,10] tương tự B Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than vi khuẩn B anthracis [3 ] Trước việc chẩn đốn xác định B anthracis phịng thí nghiệm chủ yếu dựa vào việc phát hình thái học đặc điểm sinh học Các kỹ thuật DNA gần đáp ứng yêu cầu phát xác, cho phép phân biệt B anthracis với loại trực khuẩn khác “nhóm B cereus” B cereus, B thuringiensis B mycoides Đó dựa vào có mặt hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) trực khuẩn than chứa gen độc lực [3,7] 1.1.2 Đặc điểm bào tử vi khuẩn B anthracis Bào tử vi khuẩn B anthracis hình thành mơi trường thiếu chất dinh dưỡng thiết yếu Trong trình hình thành có phân chia khơng đối xứng tế bào sinh dưỡng tạo phần lớn phần nhỏ tương ứng tế bào mẹ (mother cell) tiền bào tử (forespore) Các tế bào mẹ sau bao lấy phần tiền bào tử, lớp bào tử dần hình thành Do bào tử B anthracis bao gồm lớp sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium) Cuối tế bào mẹ phân giải tạo nên bào tử trưởng thành, bào tử khơng hoạt động có khả sống sót môi trường khắc nghiệt qua nhiều năm [10] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 2: Quá trình hình thành bào tử vi khuẩn than B anthracis [10] Phần lõi dày biến đổi peptidoglycan, lớp vỏ lõi bao lấy phần lõi chứa nhiều protein, lớp vỏ bào tử phần có cấu trúc giống bóng, liên kết lỏng lẻo, xem nơi tiếp xúc bề mặt bào tử môi trường [12] Trong B subtilis , lớp áo (coat) lớp bào tử vi khuẩn B anthracis , B thuringiensis, B cereus có vỏ bào tử lớp ngồi Cả áo bào tử vỏ bào tử có cấu trúc linh hoạt, khả đàn hồi tốt Mặt khác áo vỏ bào tử tập trung số enzyme có tác dụng bảo vệ Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát kính hiển vi điện tử [3,5 ] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Ở hình 3a, cấu tạo bào tử vi khuẩn B subtilis , có lớp áo bào tử (Oc: outer coat layer) Ở lớp tập trung chủ yếu protein (chiếm khoảng 30% protein bào tử) Ước tính có khoảng 70 protein lớp áo bào tử, phần lớn protein đặc hiệu cho chủng B subtilis , người ta thường dựa vào protein để kiểm tra có mặt vi khuẩn Khác với vi khuẩn B subtilis có lớp áo bào tử dày với lớp bên sáng lớp bên tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng Lớp phân cách với lớp khoảng (Is: interspace) Đối với chủng B anthracis , B cereus , B thuringiensis, B mycoides số thuộc nhóm Clostridia lớp ngồi vỏ bào tử Hình 3b hình mơ tả cấu tạo bào tử vi khuẩn than Hình 4: Cấu tạo lớp bào tử vi khuẩn than [3,5] Cấu tạo lớp bào tử gồm lớp sau: lớp (Bl: basal layer) phần bên giống sợi lông (Hn: hair-like nap) Khi quan sát kính hiển vi điện tử dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp dày khoảng 190A0 hình thành từ lớp mỏng Lớp gồm kết tinh, có cấu trúc lỗ có hình lục giác Ở B cereus B anthracis lớp dày khoảng 2030nm [14] Phần lơng bao quanh bên ngồi glycoprotein gọi BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis) Phần cấu trúc BclA mô tả cụ thể phần Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Goat anti mouse (C) BclA (T) Hình 18: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra có mặt kháng thể kháng BclA Vị trí C: Trải kháng thể đa dịng Goat anti mouse Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp 1: Huyết thu tuần 2: Huyết thu tuần 3: Huyết thu tuần 4: Huyết thu tuần Kết cho thấy, dịch huyết chuột thấy có xuất kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp biểu vạch mầu hồng vị trí T Tại vị trí C chúng tơi trải kháng thể đa dòng dê kháng lại IgG chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích kiểm tra hoạt động dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano 40nm Tại que thử nhứ nhất, thấy xuất mầu hồng nhạt vị trí T cho ta thấy sau tiêm kháng ngun vào lơ chuột gây đáp ứng miễn dịch tuần thứ chuột có phản ứng đáp ứng miễn dịch 39 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học với kháng nguyên lạ tiêm vào da chuột Tại que thử thứ vào tuần thứ trình gây đáp ứng miễn dịch có chững lại lượng kháng thể sinh ra, chứng của kết luận cường độ màu thị que vị trí T chênh so với tuần thứ Tại que thử thứ 3, thời điểm chúng tơi tiến hành tiêm nhắc lại với lơ chuột thí nghiệm Tại que thử thấy rõ khác màu sắc kết vị trí T với que thử thứ thứ 2, cho ta thấy trình tiêm nhắc lại cho kết tốt đáp ứng miễn dịch với chuột Ở que thử số 4, qua kết thị màu vị trí T, chúng tơi thấy lượng kháng thể có tăng lên khơng nhiều Do đó, tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành thu huyết chuột tinh kháng thể để tiến hành thí nghiệm Ngồi ra, chúng tơi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi loại thuốc gây nghiện THC, Morphine để kiểm tra đánh giá khả phản ứng chéo khả phong bế (block) hạt vàng dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano Goat anti mouse (C) BSA conjugated THC (T1) BSA conjugated Morphine (T2) Hình 19: Que thử miễn dịch kiểm tra khả phản ứng chéo block hạt vàng 40 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Kết (Hình 19) thu cho phép kết luận kháng thể đa dịng kháng protein BclA khơng phản ứng chéo với protein khác (ở BSA – Bovine serum albumin) Mặt khác, que thử hai vạch T1 T2 không xuất vạch màu hồng đồng nghĩa chứng tỏ dung dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng block hoàn toàn liên kết làm cho hạt vàng khơng cịn khả phản ứng với protein khác Từ cho phép kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp chuột bạch thành công 3.4 Tinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp Tuy thu huyết có chứa chủ yếu kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với Protein BclA tái tổ hợp, thực tế huyết cịn nhiều protein khơng mong muốn khác Vì vậy, chúng tơi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký lực HiTrap™ Protein G HP (hãng GE Healthcare) để loại protein không mong muốn, nhằm thu kháng thể IgG kháng Protein BclA tinh Phương pháp dựa vào khả liên kết đặc hiệu protein G (là immunoglobulin thành tế bào vi khuẩn Streptococcus sp với vùng Fc kháng thể IgG chuột), từ chúng tơi dễ dàng loại bỏ protein IgG (khơng có khả gắn đặc hiệu) khỏi huyết Cột HiTrap™ Protein G HP (1x5ml) cân với đệm rửa cột sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 Dung dịch huyết sau điều chỉnh pH pH 7.0 đưa lên cột với tốc độ 1ml/phút Rửa cột đệm sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 để loại protein không đặc hiệu với cột với thể tích đệm rửa lần thể tích cột Kết (Hình 20) cho thấy rửa lượng lớn protein không gắn với cột Protein G-Sepharose khỏi cột 41 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Protein (A280) Hình 20: Đồ thị rửa cột HiTrap™ Protein G HP sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 Sau đó, chúng tơi tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein GSepharose) đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7 Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng trung hịa pH 7.0 bằng cách bổ sung 200 μl thể tích đệm Tris-HCl M, pH 9.0 1ml phân đoạn, nhằm tránh cho kháng thể bị biến tính tiến hành xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford đo độ hấp phụ ánh sáng bước sóng 595nm Kết thu Hình 21 cho thấy phân đoạn chứa protein (protein không hấp phụ) với lượng nhỏ, phần dịch rửa chiết cho đỉnh protein rõ rệt Protein (A280) Hình 21: Đồ thị đẩy cột HiTrap™ Protein G HP Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7 42 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Để khẳng định độ tinh kháng thể thu được, tiến hành điện di kiểm tra phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu từ cột protein G-Sepharose kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE 12.5% Kết (Hình 22) cho thấy đỉnh protein mà chúng tơi thu (phân đoạn rửa chiết đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7) có hai băng protein với khối lượng phân tử 53kDa 25kDa, tương ứng với khối lượng chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể IgG Kết chứng tỏ kháng thể thu tinh 181kDa 115.5kDa 82.2kDa 53kDa 64.2kDa 48.8kDa 37.1kDa 25kDa 25.9kDa 19.4kDa 14.8kDa 6.0kDa Hình 22: Kết điện di tinh kháng thể đa dòng kháng protein BclA 1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder 2: Phân đoạn tinh kháng thể đa dịng Chúng tơi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford Kết nồng độ kháng thể thu 1.3mg/ml 43 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học 3.5 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than kỹ thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch Với mục đích tạo kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả nhận biết protein BclA tự nhiên có vỏ bào tử B anthracis , tiến hành phá vỏ bào tử B anthracis cách cho bào tử vi khuẩn B anthracis vào đệm PBS pH 7.4 tiến hành siêu âm máy siêu âm Ultrasonic liquid processors vòng 15 phút Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch Trải thành phần bao gồm: Goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử lên màng Nitrocellulose, ủ màng 37oC khoảng 8-10 tiếng, tiến hành lắp thành phần lên que thử Kết tiến hành thử nghiệm trình bày hình 23 Goat anti mouse (C) BclA tái tổ hợp (T1) Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn (T2) Hình 23: Kết thử nghiệm que thử miễn dịch với dịch phá vỏ bào tử C: Vạch đối chứng (kiểm tra hoạt động que thử) T1: Kết màu với protein tái tổ hợp T2: Kết màu với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than 44 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Từ kết cho thấy rằng, bước đầu tạo thành cơng kháng thể đa dịng bắt kháng nguyên tự nhiên vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis cách tạo kháng nguyên vỏ bào tử (BclA) theo đường tái tổ hợp Để khẳng định lần kết tiến hành kiểm tra khả phát kháng thể đa dòng với kháng nguyên vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis theo phương pháp Western blot 3.6 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than phương pháp Western blot Sau có kết kiểm tra khả bắt cặp kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than tự nhiên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả phản ứng kháng nguyên- kháng thể kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) phương pháp western blot Đây bước quan trọng để khẳng định q trình gây tạo kháng thể đa dịng từ kháng ngun tái tổ hợp có khả bắt cặp với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis Chúng tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B anthracis cách cho bào tử vi khuẩn B anthracis vào đệm PBS pH 7.4 tiến hành siêu âm máy siêu âm Ultrasonic liquid processors vòng 15 phút Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch Tiếp theo, tiến hành sử lý mẫu bao gồm mẫu protein BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử cách: mẫu pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing 50μl β – mercaptothanol) Mẫu marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder đun nóng 950C 5-10 phút đổ vào giếng Đậy nắp khung cắm điện, cài đặt máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút Sau protein chuyển lên màng Nitrocellulose phương pháp điện di chuyển đệm Tris-Glycine có 20% Methanol Sau màng phủ kháng thể sơ cấp (polyclonal anti BclA) kháng thể thứ cấp (goat anti mouse conjugated Alkaline phosphatase) Cuối màu 45 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học protein cách ủ màng dung dịch chất p-nitro blue tetrazolium chloridel 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha đệm TBS pH 9.0 có 5mM MgCl2, băng rõ, phản ứng làm ngưng đệm TBS có chứa 20mM EDTA 181kDa 115.5kDa 82.2kDa 64.2kDa 48.8kDa 37.1kDa 25.9kDa 19.4kDa 14.8kDa 6.0kDa Hình 24: Kết lai chuyển thấm kiểm tra khả phản ứng kháng thể 1: Huyết trước gây đáp ứng miễn dịch 2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis có trọng lượng khoảng 70kDa 3: Protein BclA tái tổ hợp 4: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder Kết lai chuyển thấm miễn dịch hình 24 cho thấy: giếng tương ứng với huyết chuột trước gây đáp ứng miễn dịch, không thấy xuất băng điện chuyển Điều chứng tỏ kháng thể có huyết chuột trước 46 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học gây đáp ứng miễn dịch khơng có khả nhận hay phản ứng chéo với protein BclA tái tổ hợp Từ cho phép nhận định lô chuột thử nghiệm không bị nhiễm vi khuẩn than trước gây đáp ứng miễn dịch Mặt khác, kháng thể có mặt kháng huyết chuột sau gây đáp ứng miễn dịch độ pha lỗng 1000 lần có khả nhận biết đặc hiệu với băng chứa BclA tái tổ hợp có kích thước vào khoảng 35kDa ( giếng 3) Ngồi ra, kết cịn cho thấy kháng thể đa dịng có khả nhận biết băng tương tự dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than có kích thước vào khoảng 70kDa (giếng 2) tương ứng với kháng nguyên BclA tự nhiên (BclA tự nhiên, hay BclA có mặt dịch phá vỏ bào tử có trọng lượng phân tử lớn dạng tái tổ hợp kháng nguyên bao gồm đầy đủ đoạn vùng giống collagen, vùng lặp lặp lại GPT - glycine, proline, threonine) Kết thu cho phép sơ kết luận rằng: + Thứ nhất: Việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp chuột bạch thành công + Thứ hai: Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả bắt cặp với kháng nguyên vỏ bào tử vi khuẩn than 3.7 Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis B subtilis que thử dạng sắc ký miễn dịch Như biết, thành phần protein BclA có vỏ bào tử ba chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis (hình 5) chủng vi khuẩn khơng có protein BclA B subtilis Do sau tinh kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp cột sắc ký lực Hitrap protein G- Sepharose HP, tiến hành kiểm tra sơ khả bắt cặp kháng nguyên kháng thể kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử ba chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis Chúng tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis, B subtilis cách cho bào tử vi khuẩn bốn loại vào đệm 47 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học PBS pH 7.4 tiến hành siêu âm máy siêu âm Ultrasonic liquid processors vòng 15 phút Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch Tiếp theo, trải thành phần bao gồm: goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử chủng vi khuẩn lên màng Nitrocellulose, ủ màng 37oC khoảng 8-10 tiếng, tiến hành nắp thành phần lên que thử Tiến hành thử nghiệm que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết (Hình 25) mong đợi Goat anti mouse (C) BclA tái tổ hợp (T1) Dịch phá vỏ bào tử (T2) Hình 25: Kiểm tra khả phản ứng kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis, B subtilis 1: Dịch phá vỏ bào tử B subtilis 2: Dịch phá vỏ bào tử B cereus 3: Dịch phá vỏ bào tử B thuringiensis 4: Dịch phá vỏ bào tử B anthracis 48 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B subtilis , cho kết âm tính điều chứng tỏ kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với protein vỏ bào tử B subtilis Điều phù hợp với khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn B subtilis khơng có chứa thành phần protein BclA vỏ bảo tử Mặt khác, thử nghiệm que thử nhanh với chủng vi khuẩn B anthracis, B cereus, B thuringiensis, thu kết phản ứng tốt kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử chủng vi khuẩn Trên que thử kết phản ứng cho màu đỏ nâu, điều lần khẳng định chúng tơi chế tạo thành cơng kháng thể đa dịng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả phản ứng lại với protein BclA tự nhiên Trên sở đó, từ việc sản xuất thành cơng kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn than, tiến hành nghiên cứu để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng lại BclA vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis 49 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN: Từ kết thu trình nghiên cứu trên, rút số kết luận sau: Bằng phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột bạch, sản xuất thành cơng kháng thể đa dịng kháng lại protein BclA tái tổ hợp Đã tinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp hệ thống cột sắc ký lực HiTrap™ Protein G HP Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự nhiên có mặt dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Chúng thành công việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp kháng thể có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên Do đó, hướng nghiên cứu tiến hành sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo kháng thể đơn dòng kháng lại BclA vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis 50 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Đỗ Ngọc Liên (2004), Thực hành Hóa sinh miễn dịch, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Mùi (2001), Hóa sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội B Tiếng Anh Abrami, L N Reig, and F G van der Goot (2005), “Anthrax toxin: the long and winding road that leads to the kill” Trends Microbiol, 13:72-78 Antibody purification, Handbooks from Amersham Biosciences Aronson, A I., and P Fitz-James (1976), “Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat”, Bacteriol Rev, 40:360-402 Burns R (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol 295, 3rd ed, Humana Press Charlton, S., A J Moir, L Baillie, and A Moir (1999), “Characterization of the exosporium of Bacillus cereus”, J Appl Microbiol, 87:241-245 Christopher Steichen, Ping Chen, John F Kearney, and Charles L Turnbough, Jr (2002), Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus anthracis Exosporium, Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama 3529 Cote, C K., C A Rossi, A S Kang, P R Morrow, J S Lee, and S L Welkos (2005), “The detection of protective antigen (PA) associated with spores of Bacillus anthracis and the effects of anti-PA antibodies on spore germination and macrophage interactions”, Microb Pathog, 38:209-225 10 Edwards, K A., H A Clancy, and A J Baeumner (2006), “Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods”, Anal Bioanal Chem , 384:73-84 11 Holtzhauer M (2006), Basic Methods for the Biochemical Lab, Springer 51 Luận văn thạc sỹ 12 Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Petosa C., Collier R J., Klimpel K R., Leppla S H., Liddington R C (1997), "Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.", Nature, 385 (6619): 833– 838 13 Rapid Lateral Flow Test Strips, Handbooks from www.millipore.com/diagnostics 14 Redmond C., L W Baillie, S Hibbs, A J Moir, and A Moir (2004), “Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis”, Microbiol., 150:355-363 15 Ronald E (2003), Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc 16 Sylvestre P., E Couture-Tosi, and M Mock (2002), “A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium”, Mol Microbiol, 45:169-178 17 Sylvie Salamitou, Ignacio Garcia-Verdugo, David J S Hulmes, Richard Chaby and Anita Lewit-Bentley (2004), The Crystal Structure of the Bacillus anthracis Spore Surface Protein BclA Shows Remarkable Similarity to Mammalian Proteins, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc 18 Tijssen (1985), Practice and theory of enzyme immunoassays, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology 4th, 15: 242 - 246 19 Todd S J., A J Moir, M J Johnson, and A Moir (2003), “Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium”, J Bacteriol., 185:3373-3378 20 Turnbough, C L., Jr (2003), “Discovery of phage display peptide ligands for species-specific detection of Bacillus spores”, J Microbiol Methods, 53:263-271 21 Van Weemen BK, Schuurs AH (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates." FEBS Letters, 15 (3): 232–6 52 Luận văn thạc sỹ 22 Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Welkos S., S Little, A Friedlander, D Fritz, and P Fellows.(2001), “The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores”, Microbiology, 147:1677-1685 53 ... nơi tiếp xúc b? ?? mặt b? ?o tử môi trường [12] Trong B subtilis , lớp áo (coat) lớp ngồi b? ?o tử vi khuẩn B anthracis , B thuringiensis, B cereus có vỏ b? ?o tử lớp Cả áo b? ?o tử vỏ b? ?o tử có cấu trúc... mục đích tạo kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả nhận biết protein BclA tự nhiên có vỏ b? ?o tử B anthracis , tiến hành phá vỏ b? ?o tử B anthracis cách cho b? ?o tử vi khuẩn B anthracis. .. khả b? ??t cặp kháng nguyên kháng thể kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ b? ?o tử ba chủng vi khuẩn B anthracis , B cereus , B thuringiensis Chúng tiến hành phá vỏ b? ?o từ vi khuẩn B anthracis , B cereus