Nghiên cứu khả năng ứng dụng kit realtime PCR đa mồi septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện nhi trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Minh Hằng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Minh Hằng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHÙNG THỊ BÍCH THỦY PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng LỜI CẢM ƠN Trước hết, với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới: TS Phùng Thị Bích Thủy – Trưởng khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh Truyền nhiễm – Bệnh viện Nhi Trung Ương PGS.TS Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm môn Vi sinh vật học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình tơi học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Trung Ương, phòng Tổ chức cán bộ, tập thể khoa Vi sinh, anh chị bạn đồng nghiệp Khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh Truyền nhiễm - người giúp đỡ tạo điều kiện cho nhiều để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu, phịng đào tạo Sau đại học, thầy, giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt thầy, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt q trình học tập Đồng thời tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp cho ý kiến q báu, giúp đỡ để tơi bảo vệ thành công đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 01 tháng11 năm 2016 Học viên Nguyễn Minh Hằng Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhiễm trùng huyết 1.2 Dịch tễ học bệnh nhiễm trùng huyết 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tình hình nhiễm trùng huyết Việt Nam 1.3 Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết trẻ em 1.4 Cơ chế gây bệnh nhiễm trùng huyết 1.5 Các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết 10 1.5.1 Vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết 11 1.5.2 Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết 19 1.5.3 Nấm gây nhiễm trùng huyết 29 1.6 Phƣơng pháp sinh học phân tử realtime PCR đa mồi Septifast chẩn đoán nhiễm trùng huyết trẻ em .34 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Địa điểm nghiên cứu .42 2.2 Thời gian nghiên cứu 42 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 42 2.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 42 2.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ 42 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .42 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 42 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 43 2.4.3 Sơ đồ nghiên cứu 43 2.5 Phƣơng pháp cấy máu truyền thống 45 2.6 Phƣơng pháp realtime PCR đa mồi Septifast chẩn đoán nhiễm trùng huyết trẻ em 47 2.6.1 Thiết bị, sinh phẩm hóa chất .47 2.6.2 Bảo quản lưu trữ 47 2.6.3 Bệnh phẩm thu nhận 48 2.6.4 Quy trình thực 48 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57 3.1 Tỷ lệ dƣơng tính với nhiễm trùng huyết kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast 57 3.2 Tỷ lệ tác nhân gây nhiễm trùng huyết kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast 58 3.3 So sánh tỷ lệ phát tác nhân nhiễm trùng huyết phƣơng pháp cấy máu truyền thống realtime PCR đa mồi Septifast .62 3.4 Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tính 67 3.5 Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa 68 3.6 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi 70 3.7 Mối liên quan nhiễm trùng huyết với số huyết học .72 KẾT LUẬN 75 KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các vi sinh vật đƣợc nêu danh sách xét nghiệm SeptiFast 38 Bảng 1.2 Các lồi đại diện cho Nhóm CoNS Streptococcus spp 38 Bảng 2.1 Giá trị baseline bƣớc sóng 54 Bảng 2.2 Giá trị Tm bar bƣớc sóng 55 Bảng 3.1 Các tác nhân nhiễm trùng huyết đƣợc phát kỹ thuật cấy máu 63 Bảng 3.2 So sánh tác nhân nhiễm trùng huyết phát phƣơng pháp 63 Bảng 3.3 Tác nhân nhiễm trùng huyết có kết âm tính với cấy máu đƣợc phát kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast 64 Bảng 3.4 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi với bệnh nhi đƣợc phát dƣơng tính 70 Bảng 3.5 Liên quan nhiễm trùng huyết số huyết học 72 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ SIRS, Nhiễm trùng huyết nguồn gốc nhiễm trùng huyết vật chủ (Bone et al 1992) Hình 1.2 Real-time PCR với đầu dị lai ghép gen A: Bƣớc biến tính, B: Bƣớc ủ (đo lƣờng huỳnh quang), C: Bƣớc kéo dài, D: Kết thúc 35 Hình 1.3 Kênh bƣớc sóng vi khuẩn Gram dƣơng 36 Hình 1.4 Kênh bƣớc sóng vi khuẩn Gram âm 36 Hình 1.5 Kênh bƣớc sóng Nấm 37 Hình 1.6 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR đa mồi Septifast 39 Hình 2.1 SeptiFastLys kit Mgrade 48 Hình 2.2 Hệ thống đồng mẫu MagNa Lyser 49 Hình 2.3 SeptiFastPrep kit Mgrade 49 Hình 2.4 Septifast Cooling block 51 Hình 2.5 Hệ thống LightCycler 2.0 51 Hình 2.6 Tm bar đặt đỉnh đƣợc xác định 55 Hình 2.7 Dữ liệu kết realtime PCR đa mồi Septifast 56 Hình 3.1 Tỷ lệ dƣơng tính nhiễm trùng huyết kỹ thuật Septifast 57 Hình 3.2 Tỷ lệ tác nhân gây nhiễm trùng huyết kỹ thuật Septifast 59 Hình 3.3 Tỷ lệ phát tác nhân nhiễm trùng huyết hai phƣơng pháp cấy máu truyền thống Septifast 62 Hình 3.4 Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tính 68 Hình 3.5 Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa 69 Hình 3.6 Liên quan nhiễm trùng huyết số huyết học 72 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NTH: Nhiễm trùng huyết ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit ribonucleic PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) ACCP: American College of Chest Physicians SCCM: Society of Critical Care Medicine SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome (Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống) LPS: Lypopolysaccarit ITS: Internal transcribed spacer (Vùng không gian phiên mã) IC: Internal control (Nội kiểm chứng) dsADN: double-strand ADN (ADN sợi kép) CFU/ml: Colony Forming Units/ml (Số đơn vị khuẩn lạc 1ml mẫu) EDTA: Ethylen Diamin Tetra Acetat (Chất chống đông) TM: Thạch máu CHO: Thạch chocolate KSĐ: Kháng sinh đồ BET: Blood Extraction Tubes A.baumannii: Acinetobacter baumannii E.coli: Escherichia coli K.pneumoniae: Klebsiella pneumoniae CoNS: Coagulase negative Staphylococci Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng MỞ ĐẦU Nhiễm trùng huyết, sốc nhiễm trùng huyết hội chứng rối loạn chức đa quan tập hợp bệnh lý thƣờng gặp lâm sàng đặc biệt đơn vị hồi sức Nhiễm trùng huyết nguyên nhân gây tử vong cao bệnh nhân, theo số liệu công bố tỷ lệ tử vong nhiễm trùng huyết 5,9 tổng số 100.000 trẻ, số tỷ lệ tử vong trẻ từ 1-4 tuổi 0,6/100.000 0,2/100.000 trẻ từ 5-14 tuổi [43] Chỉ riêng Hoa Kỳ năm có khoảng 750.000 ca bệnh số 215.000 trƣờng hợp tử vong, chiếm 9,3% tổng số ca tử vong đất nƣớc [15] Nhƣ vậy, đứng số lƣợng tử vong nhiễm trùng huyết tƣơng đƣơng với tử vong nhồi máu tim cao nhiều so với AIDS ung thƣ vú Thời gian nằm viện trung bình 19,6 ngày chi phí điều trị cho trƣờng hợp 22.100 USD tức khoảng 16,7 tỷ USD tính tồn Hoa Kỳ [15,42] Mặc dù có nhiều tiến vƣợt bậc hiểu biết chế sinh lý bệnh nhiễm trùng huyết nhƣ phát triển phƣơng pháp chẩn đoán điều trị song tỷ lệ bệnh nhân mắc tử vong nhiễm trùng huyết giới không ngừng gia tăng chiếm tỷ lệ không nhỏ Tại Việt Nam, nhiễm trùng huyết tình trạng nhiễm khuẩn nặng gây tử vong cao đặc biệt trẻ sơ sinh Nhiễm trùng huyết nguyên nhân gây bệnh cảnh lâm sàng nặng nề cho bệnh nhân, làm tăng chi phí điều trị, kéo dài thời gian nằm viện đồng thời làm xuất chủng vi khuẩn kháng kháng sinh bệnh viện Nhiễm trùng huyết trẻ em giai đoạn sớm có triệu chứng khơng rõ ràng nhƣng bệnh tiến triển nhanh có nhiều biến chứng nguy hiểm nhƣ sốc nhiễm trùng, rối loạn chức đa quan để lại di chứng nặng nề dẫn tới gây tử vong cho bệnh nhân [38] Ở trẻ em, đặc biệt trẻ sơ sinh trẻ nhỏ sức đề kháng yếu, trẻ uống thuốc theo đƣờng miệng, điều trị trẻ phải chịu nhiều thủ thuật xâm lấn nhƣ tiêm, truyền Vì việc xác định nhiễm trùng huyết sớm làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân Hiện phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm trùng huyết hầu hết bệnh viện nƣớc kể bệnh viện Nhi trung ƣơng chủ yếu dựa vào cấy máu truyền thống Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Cấy máu phƣơng pháp phổ biến đƣợc coi tiêu chuẩn vàng “gold standard” chẩn đoán xác định nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết Thông thƣờng cấy máu đƣợc thực trƣớc bắt đầu điều trị kháng sinh Tuy nhiên phƣơng pháp cấy máu thƣờng có độ nhạy thấp bệnh nhân trƣớc sử dụng thuốc kháng sinh loại vi khuẩn phát triển chậm có tạp nhiễm Việc điều trị kháng sinh sớm cho thấy hiệu lớn tới kết điều trị đầu bệnh nhân Ngƣời ta tính với chậm điều trị kháng sinh trung bình giảm 8% khả sống sót bệnh nhân [23] Khi mà vi sinh vật sinh trƣởng chậm đƣợc nghi ngờ, trình điều trị đƣợc tiến hành trƣớc có kết cấy máu, việc phát nhanh tác nhân gây nhiễm trùng huyết cho phép điều trị kháng sinh đúng, nhanh dẫn tới làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân [23] Hiện nay, bên cạnh phƣơng pháp cấy máu truyền thống, kỹ thuật đƣợc nƣớc giới ứng dụng để sàng lọc nguyên sớm bắt đầu đƣợc triển khai rộng rãi – kỹ thuật realtime PCR đa mồi (Septifast) để chẩn đoán tác nhân gây nhiễm trùng huyết Đây xét nghiệm sinh học phân tử dựa việc phát ADN vi sinh vật máu bệnh nhân Kỹ thuật realtime PCR đa mồi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao thời gian cho kết ngắn (chỉ 5h), đồng thời có khả phát lúc 25 loại nguyên gây bệnh phổ biến nhiễm trùng huyết bao gồm vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, Klebsiella (pneumonia/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia; vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, CoNS (Coagulase negative Staphylococci(-S.epidermiils, S.haemolyticus), Streptococcus pneumonia, Streptococcus spp (S.pyogenes, S.agalactiae, S.mitis), Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis) chủng nấm: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Aspergillus fumigates Sử dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi đƣợc xem phƣơng pháp ƣu việt Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 12 Nguyễn Minh Hằng N Septifast Cấy máu Xn Hạ Thu Đơng Hình 3.5 Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa Trong nghiên cứu chúng tôi, số lƣợng trẻ mắc nhiễm trùng huyết phân bố khắp mùa năm (Hình 3.5) Cụ thể 43 bệnh nhi đƣợc phát dƣơng tính kỹ thuật Septifast, có trƣờng hợp vào mùa xuân, 11 trƣờng hợp vào mùa hạ, mùa thu đông 12 trƣờng hợp Với phƣơng pháp cấy máu truyền thống, 13 trƣờng hợp phát dƣơng tính có trƣờng hợp vào mùa xn, trƣờng hợp vào mùa đông, mùa hạ thu trƣờng hợp Nhƣ thấy khơng có khác biệt thời gian trẻ mắc nhiễm trùng huyết mùa năm Có thể lý giải điều đặc điểm nhiễm trùng huyết bệnh nhiễm trùng toàn thân nặng xâm nhập liên tiếp vào máu vi khuẩn gây bệnh độc tố nó, nhiễm trùng huyết có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng trình phát triển bệnh phụ thuộc khơng vào mầm bệnh mà cịn phụ thuộc vào đáp ứng thể ngƣời bệnh Nguồn bệnh nguồn ngoại cảnh (đất, nƣớc, khơng khí ) nhiễm, vi khuẩn xâm nhập vào thể, phá vỡ hàng rào bảo vệ vi khuẩn bình thƣờng sống cộng sinh thể, gặp điều kiện thuận lợi nhƣ tổn thƣơng quan nội tạng, sức đề kháng thể giảm trở thành vi khuẩn gây bệnh Trong nghiên cứu này, tất Khóa 2014 - 2016 69 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng bệnh nhi nằm điều trị khoa Hồi sức cấp cứu, điều đồng nghĩa với việc trẻ có dùng kháng sinh kéo dài có hệ miễn dịch suy giảm, việc trẻ mắc nhiễm trùng huyết không phụ thuộc vào thời gian mùa năm 3.6 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi Nghiên cứu chúng tơi kéo dài từ tháng 12 năm 2013 đến tháng năm 2016, khoảng thời gian năm, chia nhóm tuổi bệnh nhi điều trị khoa Hồi sức cấp cứu - bệnh viện Nhi trung ƣơng thành mức độ khác nhƣ sau: nhóm trẻ sơ sinh trẻ dƣới tháng tuổi, nhóm trẻ từ tháng đến tuổi, nhóm trẻ từ đến tuổi nhóm trẻ tuổi Bảng 3.4 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi với bệnh nhi đƣợc phát dƣơng tính Trên Dƣới tháng tháng – tuổi tuổi -5 tuổi Septifast 11 11 21 43 Cấy máu 04 01 08 13 tuổi Tổng Bảng 3.4 mô tả phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi bệnh nhi đƣợc phát dƣơng tính kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast, thấy trẻ có tỷ lệ mắc nhiễm trùng huyết cao từ tuổi đến tuổi với 21/43 trẻ Ở nhóm trẻ dƣới tháng từ tháng đến tuổi tỷ lệ mắc nhiễm trùng huyết thấp 11/43 trẻ Tỷ lệ trẻ mắc thấp nhóm trẻ tuổi Với kỹ thuật cấy máu truyền thống, số 13 trẻ đƣợc phát dƣơng tính, kết từ đến tuổi độ tuổi trẻ mắc nhiễm trùng huyết cao Khóa 2014 - 2016 70 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng – 08 trẻ Nhóm trẻ dƣới tháng 04 trẻ, gặp nhóm trẻ tháng đến tuổi khơng bắt gặp trƣờng hợp nhóm trẻ tuổi nghiên cứu Kết phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Adrienne G Randolph cộng sự, cho thấy nhiễm trùng huyết nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trẻ dƣới tuổi [14] Có thể giải thích điều trẻ nhỏ có hệ miễn dịch chƣa hoàn chỉnh, đáp ứng miễn dịch đồng thời ảnh hƣởng số yếu tố nguy nhiễm khuẩn nhƣ lây nhiễm từ trƣờng học, môi trƣờng sinh sống nên khả chống lại bệnh nhiễm trùng nói chung tác nhân vi khuẩn, nấm nói riêng cịn Khóa 2014 - 2016 71 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 3.7 Mối liên quan nhiễm trùng huyết với số huyết học Bảng 3.5 Liên quan nhiễm trùng huyết số huyết học CRP Eosinophiles NEU MONO WBC (mg/l) (%) (%) (10^9/l) (10^9/l) Dƣơng tính 95,63 ± 80,29 3,54 ± 4,99 65,14 ± 22,87 1,57 ± 2,69 20,02 ± 10,70 Âm tính 60,36 ± 19,05 1,32 ± 1,28 19,18 ± 1,85 64,79 ± 63,31 2,00 ± 2,28 P 0,017 200 0,193 0,011 0,453 p=0.01 0,706 Dương tính Âm tính 160 120 80 p=0.01 40 CRP Eosinophiles NEU MONO WBC (mg/l) (%) (%) (g/l) (g/l) Hình 3.6 Liên quan nhiễm trùng huyết số huyết học Kết bảng 3.5 hình 3.6 mô tả mối liên quan nhiễm trùng huyết số xét nghiệm huyết học 43/150 trƣờng hợp trẻ dƣơng tính với nhiễm trùng huyết có số xét nghiệm CRP 95,63 ± 80,29 mg/l, Eosinophiles 3,54 ± 4,99%, Neutrophiles 65,14 ± 22,87%, Monocytes 1,57 ± 2,69 g/l Bạch cầu 20,02 ± 10,70 g/l Ở nhóm trẻ âm tính, 107/150 trẻ có CRP 64,79 ± 63,31 mg/l, Khóa 2014 - 2016 72 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Eosinophiles 2,00 ± 2,28 %, Neutrophiles 60,36 ± 19,05 %, Monocytes 1,32 ± 1,28 g/l, Bạch cầu 19,18 ± 1,85 g/l Sự khác biệt số CRP phần trăm bạch cầu toan Eosinophiles hai nhóm trẻ có ý nghĩa thống kê với p = 0,017 (CRP) p = 0,011 (Eosinophiles) Nhìn chung khơng có khác biệt giá trị Monocytes, Neutrophiles Bạch cầu (p>0,05) C-reactive protein (CRP) chất phản ứng giai đoạn cấp tính, loại protein đƣợc gan sản xuất phóng thích vào máu vài sau mô bị tổn thƣơng bị nhiễm trùng, nguyên nhân khác gây viêm Ngƣỡng CRP bình thƣờng trẻ dƣới 6mg/l Mức độ CRP tăng có chấn thƣơng, rối loạn tự miễn nhiễm trùng nặng vi khuẩn nhƣ nhiễm trùng huyết Chỉ số CRP máu có giá trị việc phát viêm nhiễm cấp tính theo dõi bùng phát bệnh mãn tính Xét nghiệm CRP khơng dùng để chẩn đốn, nhiên cung cấp thơng tin để bác sỹ lâm sàng biết có diện viêm nhiễm Theo tác giả Mohsen AH nghiên cứu năm 2015 cho thấy tỷ lệ CRP tăng cao nhóm trẻ nhiễm trùng huyết với giá trị 85,6± 44,4 mg/l (p=0,0001) Độ nhạy độ đặc hiệu số CRP lần lƣợt 72,9% 100% [37] Cũng theo kết nghiên cứu tác giả Nguyễn Thanh Liêm năm 2005, tỷ lệ CRP tăng cao trẻ nhiễm trùng huyết 55,22% [6] Số lƣợng bạch cầu máu số đƣợc quan tâm đối tƣợng bệnh nhi nhiễm trùng huyết Đây thành phần quan trọng hệ miễn dịch Khi có tình trạng viêm, nhiễm, chấn thƣơng, bạch cầu tiết chất CSF (colony-stimulating factor) Chất kích thích tủy tăng sản xuất bạch cầu Xét nghiệm công thức bạch cầu đƣợc định bệnh viêm nhiễm trùng, ung thƣ máu, ung thƣ hạch, nhiễm trùng huyết bất thƣờng tủy xƣơng Bên cạnh đó, số số huyết học khác có ý nghĩa hỗ trợ việc phát viêm nhiễm trẻ có nghi ngờ nhiễm trùng huyết nhƣ tỷ lệ phần trăm bạch cầu trung tính (Neutrophil), số lƣợng bạch cầu Mono hay tỷ lệ phần trăm bạch cầu toan eosinophiles Tỷ lệ phần trăm Neutrophil bất thƣờng trƣờng hợp nhiễm khuẩn cấp, bệnh bạch cầu dòng tủy, nhiễm virus hay xạ trị Số lƣợng bạch Khóa 2014 - 2016 73 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng cầu Mono tăng bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm ký sinh trùng, khối u, viêm ruột, bệnh bạch cầu dòng monocyte, u lympho, u tủy Tỷ lệ phần trăm bạch cầu toan eosinophiles bất thƣờng trƣờng hợp bệnh nhi nhạy cảm thuốc hay sử dụng thuốc corticosteroids Những thay đổi số xét nghiệm số khách quan phản ánh tình trạng nhiễm trùng trẻ Có thể thấy biến động số chứng tỏ khả phòng vệ trẻ Sự thay đổi có giá trị hƣớng dẫn, định hƣớng q trình chẩn đốn nhiễm trùng huyết trẻ em Khóa 2014 - 2016 74 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 150 bệnh nhi từ 01 tháng đến 10 tuổi có nghi ngờ nhiễm trùng huyết nằm điều trị khoa hồi sức cấp cứu, bệnh viện Nhi trung ƣơng Sử dụng kỹ thuật cấy máu realtime PCR đa mồi Septifast, thu đƣợc kết nhƣ sau: Tỷ lệ Septifast dƣơng tính: 43/150 bệnh nhi, chiếm tỷ lệ 28,67% Tác nhân nhiễm trùng huyết đƣợc phát kỹ thuật Septifast chiếm tỷ lệ cao nhất: Klebsiella sp., Pseudomonas Stenotrophomonas maltophilia (18,4%), tiếp đến Staphylococcus aureus (16,3%), gặp nhóm Candida albicans Aspergillus fumigatus (6,1%) Tỷ lệ cấy máu dƣơng tính: 13/150 (chiếm 8,66%) Các tác nhân đƣợc phát Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidemidis (23,07%), gặp nhóm Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae (15,38%), thấp nhóm Acinetobacter baumannii Candida sp (7,7%) 39 trƣờng hợp âm tính với cấy máu đƣợc phát kỹ thuật Septifast (chiếm 26%) Độ tuổi thƣờng gặp nhóm trẻ từ đến tuổi Trẻ mắc nhiễm trùng huyết khơng có khác biệt giới tính nhƣ thời gian mắc bệnh mùa năm Chỉ số CRP cao hầu hết trẻ mắc nhiễm trùng huyết Tỷ lệ CRP nhóm trẻ mắc nhiễm trùng huyết cao nhóm trẻ khơng mắc với p=0,017 Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast chẩn đốn nhiễm trùng huyết có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đồng thời có khả phát nhiều nguyên vi sinh vật thời gian xét nghiệm Rút ngắn thời gian xét nghiệm cịn Khóa 2014 - 2016 75 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu xin kiến nghị nhƣ sau: Sử dụng phƣơng pháp realtime PCR đa mồi Septifast chẩn đoán sớm nhiễm trùng huyết trẻ em, phục vụ điều trị cho trẻ mắc nhiễm trùng huyết Khóa 2014 - 2016 76 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Xuân Chƣơng CS (2012), Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng kết điều trị nhiễm khuẩn huyết bệnh viện Trung ương Huế 2009 – 2012, Hội nghị khoa học bệnh truyền nhiễm HIV/AIDS toàn quốc Trần Xuân Chƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo CS (2010), Một số đặc điểm lâm sàng, huyết học kết điều trị nhiễm trùng huyết Bệnh viện Trung ương Huế năm 2009-2010, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học Đại hội Hội Truyền nhiễm Việt Nam lần thứ IV, tr.36 Võ Tăng Duyên, Bùi Quốc Thắng (2009), “Các yếu tố dịch tễ học, lâm sàng cận lâm sàng liên quan đến tử vong nhiễm trùng huyết sơ sinh”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1), tr 35 – 39 Hồng Trọng Kim, Trƣơng Thị Hịa, Đỗ Văn Dũng (2005), “Những yếu tố tiên lƣợng nặng nhiễm trùng huyết khoa hồi sức cấp cứu Bệnh viện Nhi Đồng 1”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1), tr 7-16 Nguyễn Văn Kính (2008), “Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh Việt Nam”, GARP Việt Nam, http://www.cddep.org/sites/cddep.org Nguyễn Thanh Liêm, Lâm Thị Mỹ (2005), “Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết học, vi trùng học trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết BV Nhi đồng từ tháng 1-99 đến 1-04”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1), tr 196 Lê Kiến Ngãi, Trần Văn Hƣờng, Colin Partridge cộng sự, “Tỷ lệ mắc số yếu tố liên quan nhiễm khuẩn huyết bệnh viện Khoa Hồi sức cấp cứu Bệnh viện Nhi Trung ương” Vũ Đình Phú (2013), Khảo sát nhiễm trùng bệnh viện sử dụng kháng sinh khoa Hồi sức tích cực Việt Nam, Hội nghị kháng kháng sinh Châu Á, Bệnh viện Bạch Mai Đoàn Mai Phƣơng (2008), “Đặc điểm tác nhân gây nhiễm trùng máu Khóa 2014 - 2016 77 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng bệnh viện Bạch Mai năm 2008”, Tạp chí Y học lâm sàng, Số 48, tr.32-38 10 Phạm Thị Ngọc Thảo (2010), “Đặc điểm bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết điều trị khoa hồi sức cấp cứu bệnh viện Chợ Rẫy”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 14 (2), tr 348-352 11 Phạm Thị Xuân Tú, Nguyễn Thanh Hà (2003), “Tìm hiểu số yếu tố nguy nhiễm khuẩn mẹ vi khuẩn Bệnh viện phụ sản trung ƣơng”, Tạp chí Y học thực hành, (495), tr.96-100 12 Phạm Thị Xuân Tú, Phạm Văn Hùng (2001), “Đặc điểm lâm sàng, sinh học nhiễm khuẩn huyết trẻ sơ sinh”, Tạp chí Nhi khoa, 10, tr.86-89 13 Hà Mạnh Tuấn, Hoàng Trọng Kim (2005), “Tần suất nhiễm khuẩn bệnh viện khoa Hồi sức cấp cứu Nhi”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 9(2) , tr 78 Tiếng Anh 14 Adrienne G Randolph, Russell J McCulloh (2014), “Pediatric sepsis important considerations for diagnosing and managing severe infections in infants, children, and adolescents” Virulence, 5(1), pp 179–189 15 Augus DC, Linde-Zwirbe WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR (2001), “Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care” Crit Care Med, 29, pp 13031310 16 Bone, R C., et al (1992), “Definitions for Sepsis and Organ Failure and Guidelines for the use of Innovative Therapies in Sepsis The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine”, Chest, 101(6), pp.1644-1655 17 Dierkes C, Ehrenstein B, Siebig S, Linde HJ, Reischl U, Salzberger B (2009), “Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for rapid detection of pathogens in patients with presumed sepsis” BMC Infect Dis, 9, pp.126 Khóa 2014 - 2016 78 Luận văn Thạc sĩ Khoa hc Nguyn Minh Hng 18 Dinỗ F, Akalin H, ệzakin C, Sinirta M, Kebabỗi N, Iỗimen R, Kelebek Girgin N, Kahveci F(2016), “Comparison of blood culture and multiplex real-time PCR for the diagnosis of nosocomial sepsis”, Minerva Anestesiol, 82(3), pp.301 19 Elisa Burdino, Tina Ruggiero, Tiziano Allice, Maria Grazia Milia, Gabriella Gregori, Rosangela Milano, Francesco Cerutti, Francesco Giuseppe De Rosa, Pietro Caramello, Giovanni Di Perri (2014), “Combination of conventional blood cultures and the SeptiFast molecular test in patients with suspected sepsis for the identification of bloodstream pathogens”, Diagn Microbiol Infect Dis, 79(3), pp 287–292 20 Ephraim L Tsalik, Daphne Jones, Bradly Nicholson, Lynette Waring, Oliver Liesenfeld, Lawrence P Park, et al (2010), “Multiplex PCR To Diagnose Bloodstream Infections in Patients Ad mitted from the Emergency Department with Sepsis” J Clin Microbiol, 48(1): 26 21 Figueroa JR, Ortiz J, Morales I (2010), “Use of the LightCycler SeptiFast test for rapid etiologic diagnosis of nosocomial infection in gynecological sepsis”, Gynecol Obstet Invest, 70(3), pp 215–216 22 Gies F, Tschiedel E, Felderhoff-Müser U, Rath PM, Steinmann J, DohnaSchwake C (2016), “Prospective evaluation of SeptiFast Multiplex PCR in children with systemic inflammatory response syndrome under antibiotic treatment” BMC Infect Dis.16:378 23 G Martin, D.Mannino, S Eaton, et all (2003), “The epidemiology of sepsis in the united states from 1979 through 2000”, N Engl J Med, 348, pp 1546 24 Harrison D.A., Welch C.A., Eddleston J.M (2006), "The epidemiology of severe sepsis in England, Wales and Northern Ireland, 1996 to 2004: secondary analysis of a high quality clinical database, the ICNARC Case Mix Programme Database" Critical Care, 10, pp.42 25 Jason P et al (2011), "Management of severe sepsis in patients admitted to Asian intensive care units: prospective cohort study", British Medical Journal, Khóa 2014 - 2016 79 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng pp 342-345 26 Komolate A.D., Adegoke A.A (2008), “Incidence of bacterial septicaemia in IIe - Ife Metropolis, Nigeria”, Malaysian journal of microbiology, 4(2), pp 5161 27 Lamoth F, Jaton K, Prod'hom G, Senn L, Bille J, Calandra T, Marchetti O (2010), “Multiplex blood PCR in combination with blood cultures for improvement of microbiological documentation of infection in febrile neutropenia” J Clin Microbiol, 48(10), pp 3510–3516 28 Lefevre N, Noyon B, Biarent D, Corazza F, Duchateau J, Casimir G (2016), “Sex Differences in Inflammatory Response and Acid-Base Balance in Prepubertal Children with Severe Sepsis”, Shock 29 Lehmann LE, Hunfeld KP, Emrich T, Haberhausen G, Wissing H, Hoeft A, Stüber F (2008), “A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples” Med Microbiol Immunol, 197(3), pp 313–324 30 Lehmann LE, Hunfeld KP, Steinbrucker M, Brade V, Book M, Seifert H, Bingold T, Hoeft A, Wissing H, Stüber F (2010), “Improved detection of blood stream pathogens by real-time PCR in severe sepsis” Intensive Care Med, 36(1), pp 49–56 31 Leonella Pasqualini, et al (2012), “Diagnostic Performance of a Multiple RealTime PCR Assay in Patients with Suspected Sepsis Hospitalized in an Internal Medicine Ward” J Clin Microbiol, 50(4), pp.1285 32 Lilienfeld-Toal M, Lehmann LE, Raadts AD, Hahn-Ast C, Orlopp KS, Marklein G, Purr I, Cook G, Hoeft A, Glasmacher A, Stüber F (2009), “Utility of a commercially available multiplex real-time PCR assay to detect bacterial and fungal pathogens in febrile neutropenia” J Clin Microbiol, 47(8), pp 2405– 2410 Khóa 2014 - 2016 80 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 33 Louie RF, Tang Z, Albertson TE, Cohen S, Tran NK, Kost GJ (2008), “Multiplex polymerase chain reaction detection enhancement of bacteremia and fungemia” Crit Care Med, 36(5), pp 1487–1492 34 Lucignano B, Ranno S, Liesenfeld O, Pizzorno B, Putignani L, Bernaschi P, Menichella D (2011), “Multiplex PCR allows rapid and accurate diagnosis of bloodstream infections in newborns and children with suspected sepsis” J Clin Microbiol, 49(6), pp 2252–2258 35 Mancini N, Clerici D, Diotti R, Perotti M, Ghidoli N, De Marco D, Pizzorno B, Emrich T, Burioni R, Ciceri F, Clementi M (2008), “Molecular diagnosis of sepsis in neutropenic patients with haematological malignancies” J Med Microbiol, 57(5), pp 601–604 36 Mencacci A, Leli C, Cardaccia A, Montagna P, Moretti A, Bietolini C, Meucci M, Perito S, Cenci E, Bistoni F (2011), “Comparison of conventional culture with SeptiFast real-time PCR for microbial pathogen detection in clinical specimens other than blood” J Med Microbiol, 60(12), pp 1774–1778 37 Mohsen AH, Kamel BA(2015), “Predictive values for procalcitonin in the diagnosis of neonatal sepsis” Electron Physician.7(4):1190-5 38 M.Paolucci, M.G Capretti, P.D.Monte and et all (2009), “Laboratory diagnosis of late-oneset sepsis in newborns by multiplex real-time PCR”, J Med Microbiol, p.533534 39 Mussap M, Molinari MP, Senno E, Gritti P, Soro B, Mannelli S, Fabris C (2007), “New diagnostic tools for neonatal sepsis: the role of a real-time polymerase chain reaction for the early detection and identification of bacterial and fungal species in blood samples” J Chemother, 19(2):31–34 40 Pedro Tda C, Morcillo AM, Baracat EC (2015), “Etiology and prognostic factors of sepsis among children and adolescents admitted to the intensive care unit” Rev Bras Ter Intensiva 27(3):240-6 41 Roberta Sitnik, Alexandre Rodrigues Marra , Roberta Cardoso Petroni , Ozires Pereira Santos Ramos , Marines Dalla Valle Martino , Jacyr Pasternak, Oscar Khóa 2014 - 2016 81 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Fernando Pavão dos Santo, Cristóvão Luis Pitangueira Mangueira, João Renato Rebello Pinho (2014), “SeptiFast for diagnosis of sepsis in severely ill patients from a Brazilian hospital”, Einstein (Sao Paulo), 12(2) 42 R.Peters, M Agtmael, S Danner and et all (2004), “New developments in the diagnosis of bloodstream infections”, The Lanced Infect Dis, Vol 4(751), pp 60 43 Stephen M Schexnayder (1999) “Pediatric Septic Shock” Pediatr Rev.; 20; 303-308 44 Todi S., Chatterjee S., Sahu S., Bhattacharyya M (2010), “Epidemiology of severe sepsis in India: an update”, Critical Care, 14(1): 382 45 Torres-Martos E, Pérez-Ruiz M, Pedrosa-Corral I, Pena-Caballero M, JiménezValera MM, Pérez-Ramírez MD, Navarro-Marí JM (2013), “Evaluation of the LightCycler® SeptiFast test in newborns and infants with clinical suspicion of sepsis” Enferm Infecc Microbiol Clin 31(6):375-9 46 Troger B, T, Hepping Hartel C, Buer J, Dordelmann M, Felderhoff-Muser U, Hohn N, Hillebrand G, Kribs A, Marissen J, Olbertz D, Rath PM, Schmidtke S, Siegel J, Herting E, Gopel W, Steinmann J, Stein A (2016), “Clinical Relevance of Pathogens Detected by Multiplex PCR in Blood of VeryLow-Birth Weight Infants with Suspected Sepsis, Multicentre Study of the German Neonatal Network, PLoS One.,11(7) 47 Tschiedel E, Steinmann J, Buer J, Onnebrink JG, Felderhoff-Müser U, Rath PM, Dohna-Schwake C (2012), “Results and relevance of molecular detection of pathogens by SeptiFast a retrospective analysis in 75 critically ill children” Klin Padiatr, 224(1):12–16 48 Varani S, Stanzani M, Paolucci M, Melchionda F, Castellani G, Nardi L, Landini MP, Baccarani M, Pession A, Sambri V (2009), “Diagnosis of bloodstream infections in immunocompromised patients by real-time PCR” J Infect, 58(5):346–351 Khóa 2014 - 2016 82 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 49 Vince A, Lepej SZ, Barsić B, Dusek D, Mitrović Z, Serventi-Seiwerth R, Labar B (2008) “LightCycler SeptiFast assay as a tool for the rapid diagnosis of sepsis in patients during antimicrobial therapy” J Med Microbiol, 57(10):1306–1307 50 Westh H, Lisby G, Breysse F, Böddinghaus B, Chomarat M, Gant V, Goglio A, Raglio A, Schuster H, Stuber F, Wissing H, Hoeft A (2009), “Multiplex realtime PCR and blood culture for identification of bloodstream pathogens in patients with suspected sepsis” Clin Microbiol Infect, 15(6):544–551 Trang web 51 http.uptodate.com 52 https://vi.wikipedia.org/wiki/Nhiễm_trùng_huyết 53 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Miễn_dịch_bệnh_sinh_của_nhiễm_trùn g_huyết Khóa 2014 - 2016 83 ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHI? ?N - Nguyễn Minh Hằng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHI? ??M TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG Chuyên... tính bệnh nhân sử dụng kháng sinh trƣớc cấy máu Chính vậy, chúng tơi tiến hành ? ?Nghiên cứu khả ứng dụng kit realtime PCR đa mồi Septifast chẩn đoán nhi? ??m trùng huyết trẻ em bệnh viện Nhi Trung. .. đoán nhi? ??m trùng huyết trẻ em Realtime PCR đa mồi chẩn đoán nhi? ??m trùng huyết (Septifast) xét nghiệm sinh học phân tử dựa việc phát ADN vi sinh vật Phản ứng realtime PCR đa mồi sử dụng đầu dò