Xử lý vi khuẩn lao trong nước sử dụng hạt nano gắn enzyme

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ts Phạm Bảo Yên Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Bảo Yên, cán phòng Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học – Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Enzyme - Protein Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình dạy bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài chỉnh sửa luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Bệnh viện Phổi Hà Nội; giúp đỡ tơi nhiều q trình nghiên cứu Tơi xin gửi làm cảm ơn chân thành đến cán nghiên cứu sinh phịng thí nghiệm Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học, người ln bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện cho học tập làm việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ gia đình bên động viên, ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập hồn thành tốt khóa luận Cuối cùng, xin cảm ơn tất bạn bè giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, 25 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Quang Đạo Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Mục lục MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Nƣớc thải phƣơng pháp xử lý nƣớc thải 1.1.1 Khái niệm phân loại nƣớc thải 1.1.2 Thực trạng xử lý nƣớc thải bệnh viện trung tâm thu nhận bệnh nhân 1.1.3 Các phƣơng pháp xử lý vi sinh vật nƣớc thải 10 1.1.3.1 Phƣơng pháp vật lý 11 1.1.3.2 Phƣơng pháp hóa học 12 1.1.3.3 Phƣơng pháp sinh học 13 1.2 Bệnh lao 15 1.2.1 Bệnh lý học 15 1.2.2 Dịch tễ học 16 1.3 Vi khuẩn lao 18 1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn lao 18 1.3.2 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.4 Hạt nano ứng dụng 21 1.4.1 Các tính chất hạt nano 21 1.4.2 Hạt nano từ tính 23 1.4.3 Phức hệ phƣơng pháp tạo phức hệ với hạt nano 24 1.4.4 Ứng dụng hạt nano 26 1.5 Enzyme ứng dụng xử lý nƣớc thải 28 1.5.1 Ứng dụng enzyme xử lý nƣớc thải 28 1.5.2 Lysozyme 29 1.5.3 Lipase 29 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nguyên liệu 32 2.1.1 Vắc xin BCG mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin 32 2.1.2 Hạt từ nano amino (NP-NH2) chất xúc tác tạo phức hệ EDC 33 2.1.3 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn chèn 6110 33 2.1.4 Enzyme lipase, lysozyme kháng thể kháng lao 35 Luận văn Thạc sỹ Khoa học 2.1.5 2.2 Nguyễn Quang Đạo Các dung dịch đệm hóa chất khác 36 Phƣơng pháp 36 2.2.1 Tạo phức hệ hạt nano từ amino-kháng thể/enzyme 36 2.2.2 Thử độ bền vững phức hệ 37 2.2.3 Làm giàu ly giải vi khuẩn lao 37 2.2.4 Phân tích kết điện di phần mềm Image J 38 2.2.5 Xây dựng mơ hình nước thải chứa vắc xin BCG thử nghiệm phức hệ 38 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Tối ƣu điều kiện phản ứng gắn 39 3.1.1 Tối ƣu nồng độ hạt từ nano amino 39 3.1.2 Tối ƣu nồng độ EDC thời gian phản ứng 41 3.1.3 Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể 42 3.2 Hiệu phức hệ việc bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn vắc xin BCG 44 3.2.1 Sử dụng phức hệ đơn 44 3.2.2 Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng bƣớc 46 3.2.3 Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bƣớc 48 3.3 Thử nghiệm phức hệ mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 51 3.3.1 Thử nghiệm phức hệ hạt từ kháng thể mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 51 3.3.2 Sử dụng phức hệ đơn phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 52 Kết luận 56 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Bảng ký hiệu chữ viết tắt AP Alkaline Phosphatase BCG Bacillus Calmette Guerin EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IS6110 Insert Sequence 6110 MTB Mycobacterium tuberculosis NHS N-hydroxysuccinimide NP-NH2 Nano amino Particles PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction SEM Scan Electron Microscope SMCC Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan – – carboxylate TAE Tris base-Acetic Acid-EDTA TB Tuberculosis TE Tris-HCl-EDTA WHO World Health Organization Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Danh mục bảng: Bảng 1.1 Một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm có mặt nước thải 10 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 32 Danh mục hình: Hình 1.1 Sử dụng màng lọc để bắt giữ vi khuẩn nước thải 11 Hình 1.2 Chu trình phát triển Bdellovibrio bacteriovorus 14 Hình 1.3 Con đường lây nhiễm bệnh lao 17 Hình 1.4 Hình ảnh SEM vi khuẩn lao (MTB) 19 Hình 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 20 Hình 1.6 Hạt nano từ bọc silica 24 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử SMCC 25 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử EDC 25 Hình 1.9 Phản ứng tạo liên kết amide xúc tác EDC 26 Hình 2.1 Vắc-xin BCG 30 Hình 2.2 Đoạn chèn IS6110 đặc trưng cho vi khuẩn lao cặp mồi sử dụng cho PCR 32 Hình 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 33 Hình 2.4 Phần mềm phân tích ảnh ImageJ 36 Hình 3.1 Tối ưu thể tích hạt nano từ tính phản ứng gắn 38 Hình 3.2 a Thời gian gắn kháng thể lên hạt nano từ tạo phức hệ bắt giữ 39 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.2a phần mềm ImageJ Hình 3.3 a Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể Hình 3.4 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.3a phần mềm ImageJ Phức hệ đơn Hình 3.5 a Sử dụng phức hệ đơn bắt giữ ly giải vi khuẩn vắc xin BCG 39 41 41 43 44 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.5a phần mềm ImageJ 44 Hình 3.6 Phức hệ kép tạo thành qua bước phản ứng 45 Hình 3.7 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng bước bắt giữ ly giải vi khuẩn mẫu vắc xin BCG Hình 3.8 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.7a phần mềm ImageJ Phức hệ kép hình thành qua hai bước phản ứng Hình 3.9 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bước so sánh với phức hệ kép từ phản ứng bước 46 46 47 48 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.9a phần mềm ImageJ Hình 3.10 Kiểm tra khả bắt giữ vi khuẩn phức hệ hạt từ kháng thể Hình 3.11 a sử dụng phức hệ đơn, phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nước thải bổ sung vắc xin BCG 48 50 51 b Phân tích độ sáng băng tương ứng hình 3.11a phần mềm imageJ Các mẫu 1-6 tương ứng với mẫu từ 1-6 hình 3.11a Hình 3.12 Kiểm tra khả bắt giữ ly giải tế bào phức hệ đơn 51 53 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo MỞ ĐẦU Hiện nay, sở bệnh viện, trung tâm thu nhận người mắc bệnh truyền nhiễm nơi tập trung lượng lớn vi sinh vật gây bệnh Nước thải từ sở chứa nhiều tác nhân vi khuẩn, virus có khả lây nhiễm, khơng có phương pháp xử lý thích hợp trở thành nguy lây lan bệnh truyền nhiễm Các vi sinh vật có nước thải bao gồm nhiều loài khác nhau, đề tài tập trung vào đối tượng nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh lao Mycobacterium tuberculosis (MTB) Lao bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ bệnh nhân tử vong cao thứ hai Theo ước tính Tổ chức Y tế giới WHO, đến năm 2015 khoảng phần ba dân số toàn cầu nhiễm vi khuẩn lao dạng tiềm tàng, năm có khoảng 10 triệu ca nhiễm lao (10,4 triệu ca năm 2015), gây tử vong cho triệu người năm hầu hết nước phát triển [2][3] Ở Việt Nam, gia tăng nhanh chóng chủng lao đa kháng thuốc làm cho việc chữa trị lao trở nên phức tạp hơn, theo số liệu điều tra từ chương trình chống lao quốc gia Việt Nam, khoảng 40% số bệnh nhân Việt Nam cho kết kháng thuốc với Rifampin, loại thuốc kháng sinh hàng quan trọng [4] Vi khuẩn lao chủng nguy hiểm không khả gây bệnh mà khả sống sót cao mơi trường tự nhiên Vi khuẩn lao tồn đất (ẩm khô) tuần, bảo vệ khỏi tiếp xúc với ánh sáng, trì sống tới 74 ngày lâu chất thải động vật.[5] Hiện nay, để xử lý vi sinh vật nước thải phương pháp thường sử dụng chia vào ba nhóm chính: phương pháp vật lý, hóa học sinh học, nhiên, phương pháp vật lý, hóa học tốn để lắp đặt hệ thống xử lý trì thời gian dài, số phương pháp có nguy tái nhiễm vi khuẩn cao Từ lí nêu trên, để tiêu diệt vi khuẩn lao nước thải góp phần ngăn chặn nguy lây nhiễm (đặc biệt chủng lao kháng thuốc), tiến hành nghiên cứu đề tài “Phát triển phương pháp xử lý vi khuẩn lao nước” sử dụng công nghệ nano kết hợp với công nghệ protein enzyme Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Nƣớc thải phƣơng pháp xử lý nƣớc thải 1.1.1 Khái niệm phân loại nƣớc thải Nước nguồn tài nguyên đặc biệt, khơng chất thay cần sử dụng tiết kiệm, hợp lý Tổng trữ lượng nước trái đất vào khoảng 1.386 triệu km3 [6], nước nước dùng cho người có hạn tái tạo lại dường phân bố không không kịp cho nhu cầu sử dụng Nước chiếm khoảng 2,7% tổng lượng nước trái đất; nằm dạng băng 77,22%, nước ngầm 22,42%, hồ đầm 0,35%, sống suối 0,01% lượng nước Nguồn nước ngầm thường có xu hướng giảm khai thác nhiều mà không bổ sung kịp thời [7] Do việc tái sử dụng nước thải cho an toàn vấn đề cấp thiết quan tâm Theo Tilley cộng nước thải định nghĩa nước mà chất lượng bị ảnh hưởng xấu tác động người Nước thải bao gồm chất thải dạng lỏng từ hoạt động sinh hoạt, công nghiệp, thương mại, nông nghiệp nước mưa đổ vào hệ thống cống [8] Người ta định nghĩa nước thải chất lỏng thải sau trình sử dụng người bị thay đổi tính chất ban đầu chúng Thơng thường nước thải phân loại theo nguồn gốc phát sinh, sở việclựa chọn biện pháp giải công nghệ xử lý [9] Hệ thống nước thải phổ biến chia làm năm loại Đầu tiên nước thải sinh hoạt: bắt nguồn từ khu dân cư, khu vực hoạt động thươngmại, khu vực công sở, trường học sở tương tự khác Tiếp nước thải cơng nghiệp (hay gọi nước thải sản xuất): từ nhà máy hoạt động nước thải công nghiệp chủ yếu Thứ ba nước thấm qua: lượng nước thấm vào hệ thống ống nhiều cách khác nhau, qua khớp nối, đường ống rò rỉ thành hố ga Thứ tư nước thải tự nhiên: nước mưa xem nước thải tự nhiên thành phố đại, thu gom theo hệ thống riêng Cuối nước thải đô thị: thuật ngữ chung chất lỏng hệ thống cống thoát thành phố, thị Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo nano sắt với kích thước nano khơng dễ bi lắng xuống Về lý thuyết, hạt tách khỏi dung dịch cách ly tâm, phải thời gian lâu số hạt bị vón lại khơng thể hòa tan trở lại ban đầu với hạt không nên ly tâm trường hợp nào, nghiên cứu sử dụng sắt nguyên tố kim loại có từ tính tập hợp nhanh chóng dễ dàng cách sử dụng nam châm Các hạt nano từ tính chức hóa với nhóm amin để tạo thuận lợi cho khớp nối với kháng thể đặc hiệu cho vi khuẩn lao có chứa nhóm carboxyl đặt tên hạt nano amino [36] Hình 1.6: Hạt nano từ bọc silica Các hạt nano từ phủ lớp silica tích điện âm giúp chúng ổn định huyền phù dung dịch lực đẩy điện tích dấu, tránh tập hợp lại với tủa xuống 1.4.3 Phức hệ phƣơng pháp tạo phức hệ với hạt nano Có nhiều phương pháp khác để tạo phức hệ hạt từ-protein, bao gồm: Sử dụng liên kết chéo carbondiimide để tạo liên kết amide nhóm carboxyl protein nhóm amine bề mặt hạt; Ứng dụng liên kết hạt hoạt hóa streptavidine tương tác với protein bị biotin hóa; Sử dụng succinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl) cyclohexan – – carboxylate (SMCC) để gắn gốc sulfhydryl 24 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo (NHS) với gốc amine.Trong SMCC cho hợp chất tạo liên kết protein sử dụng rộng rãi Hình 1.7: Cấu trúc phân tử SMCC Trong nghiên cứu 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC EDAC) loại carbodiimide sử dụng làm chất xúc tác tạo liên kết amide nhóm carboxyl nhóm amine Ứng dụng EDC hạt từ quy trình tạo liên kết bề mặt kết hợp với NHS ( N hydroxysulfosuccinimide) sulfo-được sử dung rộng rãi [36] Hình 1.8: Cấu trúc phân tử EDC[35] EDC hòa tan dung dich trộn trực tiếp vào với phản ứng mà không cần sử dụng dung mơi hịa tan hữu Hai thành phần tham gia phản ứng phân tử protein chứa nhóm carboxyl hạt nano từ tính chứa nhóm amine Khi cần thiết thành phần phản ứng sản phẩm phụ tạo sau phản ứng gắn loại bỏ màng lọc dialysis sắc ký lọc gel 25 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo EDC xúc tác tạo thành liên kết hạt nano từ amino phân tử protein miêu tả Hình 1.9 EDC phản ứng với gốc carboxyl phân tử protein tạo hợp chất trung gian hoạt động o-acylisourea Hợp chất tương tác với nhóm amine bề mặt hạt nano từ tạo thành liên kết amide Hình 1.9: Phản ứng tạo liên kết amide xúc tác EDC EDC phản ứng với carboxylic acids để tạo liên kết ester trung gian sau tương tác với gốc amine để tạo thành liên kết amide giải phóng EDC (Bioconjugate techniques) Nghiên cứu Chử Lương Luân cộng thành công gắn kháng thể lên hạt từ nano sử dụng EDC xúc tác tạo liên kết Tiếp nối kết nghiên cứu hướng tới việc thử nghiệm cố định enzyme lên hạt từ mà khơng làm hoạt tinh enzyme Sau phối hợp sử dụng hạt từ kháng thể enzyme để đồng thời bắt giữ tiêu diệt vi khuẩn lao 1.4.4.Ứng dụng hạt nano Dẫn truyền thuốc Trong điều trị ung thư phương pháp hóa trị liệu có nhược điểm tính khơng đặc hiệu, vào thể, thuốc chữa bệnh phân bố không tập trung nên tế bào khỏe mạnh bị ảnh hưởng tác dụng phụ thuốc Chính từ năm 26 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 1970 việc dùng hạt nano từ tính để dẫn thuốc đến vị trí cần thiết thể nghiên cứu Phương pháp mang lại hai lợi ích điều trị là: thu hẹp phạm vi phân bố thuốc góp phần làm giảm tác dụng phụ thể, đồng thời giảm lượng thuốc điều trị Các hạt nano sử dụng làm hạt mang thuốc thường hạt nano từ tính (oxit sắt) có kích thước từ 10-20 nm chức hóa bề mặt để liên kết với loại thuốc trị ung thư Phức hệ thuốc – hạt thông thường dạng lỏng, vào thể qua hệ tuần hoàn sau vào máu Sau phức hệ dẫn tới vị trí cần thiết thơng qua gradient từ trường có tác dụng tập trung vị trí có tế bào ung thư Q trình nhả thuốc diễn thơng qua chế hoạt động enzyme, tính chất sinh lý học tế bào ung thư gây (độ pH), trình khuyếch tán thay đổi nhiệt độ.[37] Chụp cộng hƣởng từ (MRI) Chụp cộng hưởng từ MRI trở thành công cụ sử dụng rộng rãi mạnh mẽ cho chẩn đoán lâm sàng.MRI dựa từ trường lớn, tần số vô tuyến (RFS), sử dụng thời gian nghỉ proton phân tử di động nước, chất béo protein có mặt quan nồng độ khác nhau, để tạo hình ảnh giải phẫu mô mềm với độ tương phản phân giải cao [38] Trong trình chụp cộng hưởng từ để gia tăng độ tương phản người ta thường thêm vào chất tương phản (contrast agent) Trong việc sử dụng hạt nano đầu dò gắn chất tạo hình ảnh (như huỳnh quang) có số ưu điểm Ưu điểm thứ kiểm sốt nồng độ chất tạo hình ảnh gắn lên hạt nano trình tổng hợp Đồng thời hạt nano có khả kéo dài thời gian lưu thông chất tạo hình ảnh máu nhắm mục tiêu vị trí cụ thể thể [39] Xử lý nƣớc Từ lâu khả kháng khuẩn bạc biết đến, nhiên đến gần việc sử dụng hạt nano bạc hệ thống xử lý nước dạng tự phủ lên màng lọc sứ bắt đầu áp dụng Các hạt nano bạc có khả kháng khuẩn chống lại dải rộng vi khuẩn gram âm, gram dương số loại 27 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo nấm Aspergillus niger, Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Tùy theo phương pháp tổng hợp mà hạt nano bạc có kích thước khác thường nhỏ 100nm Phương pháp phổ biến để tổng hợp hòa tan muối bạc nước với sodium borohydride, phương pháp tạo hạt nano bạc có kích thước khoảng 50nm Trong hệ thống xử lý nước đại hạt nano bạc sử dụng để phủ lên hệ thống màng lọc giúp ngăn ngừa việc hình thành màng sinh học bám lên màng lọc Ở số hệ thống xử lý nước thải bệnh viện nano bạc sử dụng kết hợp với ion đồng để chống lại hình thành khuẩn lạc Legionella spp Việc sử dụng nano bạc khử khuẩn phương pháp hứa hẹn thay sử dụng clo xử lý nước Tuy nhiên, tương quan độ bền nano bạc nước với yếu tố nồng độ hữu hòa tan, độ cứng nước nghiên cứu thêm trước phương pháp áp dụng rộng rãi [49] 1.5 Enzyme ứng dụng xử lý nƣớc thải Các enzyme phân giải công cụ giá trị công nghệ sinh học với nhiều ứng dụng y học, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, để thu sản phẩm nội bào từ nấm men vi khuẩn Sự đa dạng tiềm ứng dụng ngày mở rộng với phát triển củahệ thống enzyme ly giải có đặc điểm phù hợp để đáp ứng yêu cầu từngứng dụng cụ thể Trong phải kể đến protease enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptit ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm sản xuất da thuộc Các phương pháp thường sử dụng để ứng dụng enzyme vào trình sinh học bao gồm: bổ sung vi khuẩn sản xuất enzyme, bổ sung trực tiếp enzyme, bổ sung enzyme cố định lên giá thể Trong nghiên cứu hai loại enzyme thử nghiệm để phá hủy màng tế bào vi khuẩn lysozyme lipase 1.5.1.Ứng dụng enzyme xử lý nƣớc thải Theo Aitken (1993) enzyme lần đề xuất để xử lý chất thải công nghiệp vào năm 1930, khơng ứng dụng gần công nghệ enzyme nhận nhiều ý [50] với cải tiến xử lý sinh học cho 28 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo nước thải công nghiệp Xử lý sinh học loại bỏ, chuyển đổi chất gây ô nhiễm thành dạng độc hại dựa q trình tự nhiên từ giúp thu hồi nguồn tài nguyên nước Một nghiên cứu gần xác định tham gia nhiều enzyme thủy phân phosphatase, sulphatase, protease, lipase, endoglucanase glucosidase vào trình phân giải chất độc nước thải [51,52] Trong đó, sulphatase sử dụng nhiều nơi, sử dụng enzyme có khả loại bỏ đồng thời hợp chất phosphate ion kim loại Các vi sinh vật phân giải phân giải sulphate sử dụng bùn nước thải nguồn carbon, trình phân hủy sinh hydrogen sulphite có khả kết tủa ion kim loại 1.5.2 Lysozyme Lysozyme enzym kháng sinh tìm thấy nhiều loài sinh vật bao gồm loài chim, động vật, thực vật, côn trùng vi khuẩn Các lysozyme lấy từ lòng trắng trứng gà nghiên cứu rộng rãi Lysozyme từ trứng gà lần mô tả Laschtschenko năm 1909 phải đến năm 1922 tên 'lysozyme' sử dụng, Alexander Fleming (1881-1955), người phát penicillin Fleming quan sát hoạt động kháng khuẩn lysozyme ông xử lý môi trường nuôi cấy vi khuẩn với chất nhầy mũi từ bệnh nhân bị cảm lạnh Lysozyme phần hệ thống miễn dịch bẩm sinh Mức lysozyme giảm có liên quan với chứng loạn sản phế quản phổi trẻ sơ sinh Trẻ sơ sinh ăn thiếu lysozyme chế độ ăn uống có khả mắc bệnh tiêu chảy cao gấp lần bình thường Lysozyme tiêu diệt vi khuẩn cách cơng peptidoglycan (được tìm thấy màng tế bào vi khuẩn, vi khuẩn đặc biệt vi khuẩn Gram dương) thủy phân liên kết glycosidic nối axit N-acetylmuramic với nguyên tử carbon thứ tư N-Acetylglucosamine Lysozyme làm điều cách liên kết với phân tử peptidoglycan vị trí gắn bên với domain phân tử enzyme.[40] 1.5.3 Lipase Lipase enzyme xúc tác cho trình thủy phân chất béo (lipid) Lipase lớp esteraza Trong hầu hết, sinh vật sống Lipase thực vai trò quan trọng trình tiêu hóa, vận chuyển xử lý chất béo (ví dụ 29 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo triglyceride, chất béo, dầu) Các gen mã hóa lipase chí cịn diện vài virus Lipase phân loại theo nguồn gốc: lipase từ động vật, thực vật, vi sinh vật; theo tính chất: lipase có tính đặc hiệu vị trí, lipase có tính đặc hiệu chất Hầu hết hoạt động lipase vị trí cụ thể khung glycerol chất lipit (A1, A2 A3) (ruột non) Ví dụ, lipase từ tụy người (HPL), enzyme mà phá vỡ chất béo từ thức ăn uống hệ thống tiêu hóa người, chuyển đổi chất béo trung tính tìm thấy loại dầu ăn thành monoglyceride hai loại axit béo Một số loại khác lipase tồn tự nhiên, chẳng hạn Phospholipases sphingomyelinases, nhiên loại lipase thường xử lý cách riêng biệt với lipase "thông thường" Một số lipase biểu tiết sinh vật gây bệnh trình lây nhiễm Đặc biệt, Candida albicans có số lượng lớn loại lipase khác nhau, phản ánh hoạt động lipolytic rộng, loại lipse đóng góp vào khả tồn độc lực C albicans mơ người.[58] Với đặc tính phân giải lipit, lipase enzyme thường sử dụng thay lysozyme để tiêu diệt loại vi khuẩn Mycoplasma Trong nghiên cứu trước S Razin M Argaman, lipase có khả ly giải hầu hết vi khuẩn Mycoplasma Lipase phân giải liên kết peptide cách sử dụng tác nhân nucleophin cơng vào nhóm cacbonyl, gốc serine enzyme tạo thành liên kết tạm thời với chất Sau kết hợp với histidine axit aspatic gốc serine tạo thành xúc tác cho phản ứng thủy phân lipit.[63] 30 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Với thực trạng nay, có 54% bệnh viện có hệ thống xử lý nước thải, việc phát triển phương pháp sinh học để loại bỏ tác nhân sinh học gây bệnh nước thải, mà trước tiên vi khuẩn lao vấn đề quan tâm Trong nghiên cứu này, với việc sử dụng kết hợp công nghệ enzyme công nghệ nano, mục tiêu nghiên cứu đặt bao gồm: Tạo phức hệ hạt từ - kháng thể, hạt từ - enzyme Đánh giá khả bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn lao phức hệ quy mơ phịng thí nghiệm Thử nghiệm khả bắt giữ, ly giải tế bào vi khuẩn lao phức hệ môi trường nước thải 31 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Quang Huy, Ngơ Thị Kim Tốn “Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam” tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 43 Tài liệu tiếng Anh [2] WHO Tuberculosis Global Report 2016 [3] World Health Organization (2011) "The sixteenth global report on tuberculosis" [4] “Viet Nam: Optimism for Multidrug-Resistant TB Patients” WHO, 2013 Available from: http://www.who.int/features/2013/viet_nam_tuberculosis/en/ January 2016 [5] Duffield, B J., & Young, D A (1985) “Survival of Mycobacterium bovis in defined environmental conditions” Veterinary Microbiology, 10(2), 193-197 [6] I.A Shiklomanov, John C.Rodda “World water resource at the beginning of 21 century” International hydrology series ISBN 0-521-82085-5 [7] Peter Gleick; Heather Cooley; David Katz (2006) “The world's water, 2006–2007: the biennial report on freshwater resources” Island Press pp 29–31 ISBN 1-59726106-8 Retrieved 12 September 2009 [8] Tilley, E., Ulrich, L., Lüthi, C., Reymond, Ph., Zurbrügg, C “Compendium of Sanitation Systems and Technologies – (2nd Revised Edition)” Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag), Duebendorf, Switzerland p 175 ISBN 978-3-906484-57-0 [9] Nena NwachukuCharles P Gerba “Occurrence and persistence of Escherichia coli O157:H7 in water Reviews” in Environmental Science and Bio/Technolog September 2008, 7:267 DOI: 10.1007/s11157-008-9132-0 [10] Guy Kisluk and Sima Yaroncorresponding “Presence and Persistence of Salmonella enterica Serotype Typhimurium in the Phyllosphere and Rhizosphere of Spray-Irrigated Parsley” Appl Environ Microbiol 2012 Jun; 78(11): 4030–4036 doi: 10.1128/AEM.00087-12 PMCID: PMC3346414 57 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [11] Adesioye Fiyinfoluwa A., Fiyinfoluwa A Adesioye and Adeniyi A Ogunjobi “181 Comparative Study of Persistence of Escherichia coli, Salmonella Sp And Shigella Sp In Different Water Samples Stored under Various Storage Conditions” Nov 12, 2013; ISSN 1818-4952 IDOSI Publications, 2013 DOI: 10.5829/idosi.wasj.2013.26.02.7613 [12] Jubair M., Morris J G., Jr., Ali A (2012) “Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel “persister” phenotype” PLoS ONE 7:e4518710.1371/journal.pone.0045187 [13] Mark D Sobsey and John Scott Meschke “Virus survival in the environment with special attention to survival in sewage droplets and other environmental media of fecal or respiratory” august 21, 2003 [14] U.S Environmental Protection Agency (EPA) Wastewater technology fact sheet Ultraviolet disinfection, EPA 832-F-99-064 September 1999 [15] U.S EPA Wastewater technology fact sheet Chlorine disinfection, EPA 832-F99-062 September 1999 [16] U.S EPA Wastewater technology fact sheet Ozone disinfection, EPA 832-F-99063 September 1999 [17] Madigan, Michael T (2011-01-07) Brock Biology of Microorganisms,: Global Edition Pearson Education ISBN 9780321735515 [18] Strauch, E.; Beck, S.; Appel, B (2007) "Bdellovibrio and Like Organisms: Potential Sources for New Biochemicals and Therapeutic Agents" Predatory Prokaryotes Microbiology Monographs p 131 doi:10.1007/7171_2006_055 ISBN 978-3-540-38577-6 [19] Schwudke, M; Linscheid, M; Strauch, E; Appel, B; Zähringer,U; Moll, H; Müller, M; Brecker, L; Gronow, S; and Lindner, B “The Obligate Predatory Bdellovibrio bacteriovorus Possesses a Neutral Lipid A Containing -D-Mannoses That Replace Phosphate Residues” J Biol Chem 2003 Volume 278 Issue 30 27502-27512.] [20] J C Fry and D G Staples “Distribution of Bdellovibrio bacteriovorus in sewage works, river water, and sediments” Applied and Environmental Microbiology, 1976 Volume 31 No Pages 469–474 [21] Jindal, editor-in-chief SK Textbook of pulmonary and critical care medicine, New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers pp 549 ISBN 978-93-5025-073-0 58 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [22] ACTION 2009 Living with HIV, Dying of TB: A Critique of the Response of Global AIDS Donors to the Co-epidemic, Washington, DC: RESULTS Educational Fund [23] Ismael Kassim, Ray CG (editors) (2004) Sherris Medical Microbiology, (4th ed.) McGraw Hill ISBN 0-8385-8529-9 [24] Cole E, Cook C (1998) "Characterization of infectious aerosols in health care facilities: an aid to effective engineering controls and preventive strategies" Am J Infect Control 26 (4): 453–64 doi:10.1016/S0196-6553(98)70046-X PMID 9721404 [25] Nicas M, Nazaroff WW, Hubbard A (2005) "Toward understanding the risk of secondary airborne infection: emission of respirable pathogens" J Occup Environ Hyg (3): 143–54 doi:10.1080/15459620590918466 PMID 15764538 [26] Wells WF Aerodynamics of droplet nuclei In: Airborne contagion and air hygiene, Cambridge: Harvard University Press, 1955:13–9 [27] Amanda E Fine, Carole A Bolin, Joseph C Gardiner, and John B Kaneene “A Study of the Persistence of Mycobacterium bovis in the Environment under Natural Weather Conditions in Michigan, USA” Veterinary Medicine International, Volume 2011, Article ID 765430, 12 pages [28] Robert Koch and Tuberculosis: “Koch's Famous Lecture" Nobel Foundation 2008 Retrieved 2008-11-18 [29] Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2005) Medical Microbiology, Elsevier Mosby Page 230-234 [30] Pere-Joan Cardona : Understanding Tuberculosis - Deciphering the Secret Life of the BacilliEdited, ISBN 978-953-307-946-2, Hard cover, 334 pages, Publisher: InTech [31] Sharma SK, Mohan A Multidrug-resistant tuberculosis: a menace that threatens to destabilize tuberculosis control, Chest 2006; 130: 261-272 [32] Brosch RG, Gordon SV, Eiglmeier K, Garnier T, Tekaia F, Yeramian E, Cole ST: “Genomics , biology , and evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex” Molecular Genetics of Mycobacteria Edited by: Hatfull GF & Jacobs WR Jr 2000, Washington DC, USA: American Society for Microbiology Press, 19-36 ISBN 155581-191-4, [33] Fomukong NG, Tang TH, al-Maamary S, Ibrahim WA, Ramayah S, Yates M, Zainuddin ZF, Dale JW: “Insertion sequence typing of Mycobacterium tuberculosis: 59 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110” Tuber Lung Dis 1994, 75: 435-440 10.1016/0962-8479(94)90117-1 [34] Lok KH, Benjamin WH, Kimerling ME, Pruitt V, Lathan M, Razeq J, Hooper N, Cronin W, Dunlap NE: Molecular differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains without IS6110 insertions Emerg Infect Dis 2002, 8: 1310-1313 10.3201/eid0811.020291 [35] Hostetler, M J.; Wingate, J E.; Zhong, C.-Z.; Harris, J E.; Vachet, R W.; Clark, M R.; Londono, J D.; Green, S J.; Stokes, J J.; Wignall, G D.; Glish, G L.; Porter, M D.; Evans, N D.; Murray, R W “Alkanethiolate Gold Cluster Molecules with Core Diameters from 1.5 to 5.2 nm: Core and Monolayer Properties as a Function of Core Size” Langmuir 1998, 14, 17-30 [36] Greg T.Hermanson Bioconjugate techniques 2nd edition, Elsevier Inc, Academic Press, 2008 pp 215-250 [37] Lexinnova, Nanoparticles smart drugs delivery system for cancer, [38] Lam T, Pouliot P, Avti PK, et al “Superparamagnetic iron oxide based nanoprobes for imaging and theranostics” Adv Colloid Interface Sci 2013;199– 200:95–113 [39] Hashim Z, Green M, Chung PH, et al “Gd-containing conjugated polymer nanoparticles: bimodal nanoparticles for fluorescence and MRI imaging” Nanoscale 2014;6:8376–8386 [40] McKenzie HA, White FH (1991) "Lysozyme and alpha-lactalbumin: structure, function, and interrelationships" Adv Protein Chem 41: 173–315 doi:10.1016/s00653233(08)60198-9 PMID 2069076 [41] Luan L Chu, Dao Q Nguyen, Hieu M Nguyen, Nguyen Hoang Nam, Anh T.V Nguyen, Tuan-Nghia Phan, Nguyen Hoang Luong, Yen Pham: “Specificity and processing rate enhancement of Mycobacterium tuberculosis diagnostic procedure using antibody-coupled magnetic nanoparticles” Int J Nanotechnol, Vol 12, Nos 5/6/7 (2015) [42] Gilles, M A; Hudson, A Q; Borders, C L “Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution.” Anal Biochem 1990 Feb 1;184(2):244-8 PMID: 2158246 60 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [43] Yashwant Pathak, Simon Benita Antibody-Mediated Drug Delivery Systems: Concepts, Technology, and Applications, page 321 [44] Mustafa Raoof, MD, Stuart J Corr, PhD, Warna D Kaluarachchi, MS, Katheryn L Massey, Katrina Briggs, Cihui Zhu, Matthew A Cheney, Lon J Wilson, PhD, and Steven A Curley, MD, “Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endo-lysosomal nanoenvironment: Implications for non-invasive radiofrequency-based cancer therapy” Nanomedicine 2012 Oct; 8(7): 1096–1105 2012 Feb 17 doi: 10.1016/j.nano.2012.02.001 PMCID: PMC3392470 [45] Buck GE, O’Hara LC, Summersgill JT “Rapid, simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis to remove DNA for polymerase chain reaction” J Clin Microbiol.1992;30:1331–4 [46] Aldous WK, Pounder JI, Cloud JL, Woods GL “Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR” J Clin Microbiol 2005;43:2471–3 [47] Cukalevski R, Lundqvist M, Oslakovic C, Dahlbäck B, Linse S, Cedervall T “Structural changes in apolipoproteins bound to nanoparticles.” Langmuir 2011 Dec 6;27(23):14360-9 doi: 10.1021/la203290a Epub 2011 Nov [48] Malvindi MA; Matteis A, Galeone A, Brunetti V, George C Anyfantis, Athanassia Athanassiou, Roberto Cingolani, Pier Paolo Pompa “Toxicity Assessment of Silica Coated Iron Oxide Nanoparticles and Biocompatibility Improvement by Surface Engineering” January 21, 2014 [49] World Health Organization, Silver: water disinfection and toxicity, Spring 2014 [50] Whiteley CG; Lee D-J 2006 “Enzyme Technology and Biological Remediation: A Review,” Enz .Microbial Tech 38, (3-4): 291-316 [51] Enongene, G Pletschke, BI, Rose, PD Whittington-Jones, K Whiteley CG 2003 “Codigestion of primary sewage sludge and industrial wastewater under anaerobic 61 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo sulphate reducing conditions: Enzymatic profiles in a Reciprocating Sludge Bed Reactor Water” Science & Technology, 48(4), 129-138 [52] Ngesi, N Pletschke, BI Rose PD Whiteley CG 2002 “Specific sulphur metabolites stimulate β-glucosidase activity in an anaerobic sulphidogenic bioreactor.” Biotech Letts., 24, 1509-1513 [53] Goodfriend Tl, Levine L, Fasman Gd “Antibodies to bradykinin and angiotensin: a use of carbodiimides in immunology” Science 1964 Jun 12;144(3624):1344-6 [54] R Chauhan, T Basu “Functionalised Au Coated Iron Oxide Nanocomposites Based Reusable Immunosensor for AFB1 Detection” Journal of Nanomaterials, Volume 2015 (2015), Article ID 607268, 15 pages [55] Da-He Fan, Shi-Wei Yuan, Yong-Miao Shen “Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly(dimethylsiloxane) microchip” Colloids and surfaces B: Biointerfaces 75(2):608-11 · November 2009 [56] Hughes-Jones NC, Gardner B, Telford R “The effect of pH and ionic strength on the reaction between anti-D and erythrocytes” Immunol 1964;7:72–81 [57] Karush F “Immunologic specificity and molecular structure” Adv Immunol 1962;2:1–40 [58] J.M Jandal “Some factors affecting lipase activity in goat milk” Small Ruminant Research, Volume 16, Issue 1, March 1995, Pages 87-91 Trang mạng: [59] http://www.mycobacteriumtuberculosis.net/history.html [60] http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium [61] http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis [62] http://www.who.int/tb/xdr/xdrtb_sept06news.pdf [63] http://en.wikipedia.org/wiki/Lipase 62 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [64] https://imagej.nih.gov/ij/ 63 ... thống xử lý nước thải bệnh vi? ??n nano bạc sử dụng kết hợp với ion đồng để chống lại hình thành khuẩn lạc Legionella spp Vi? ??c sử dụng nano bạc khử khuẩn phương pháp hứa hẹn thay sử dụng clo xử lý nước. .. [39] Xử lý nƣớc Từ lâu khả kháng khuẩn bạc biết đến, nhiên đến gần vi? ??c sử dụng hạt nano bạc hệ thống xử lý nước dạng tự phủ lên màng lọc sứ bắt đầu áp dụng Các hạt nano bạc có khả kháng khuẩn. .. 16 1.3 Vi khuẩn lao 18 1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn lao 18 1.3.2 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.4 Hạt nano ứng dụng 21 1.4.1 Các tính chất hạt nano