Xử lý vi khuẩn lao trong nước sử dụng hạt nano gắn enzyme

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ts Phạm Bảo Yên Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Bảo Yên, cán phòng Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học – Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzyme - Protein Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình dạy bảo, giúp đỡ suốt trình thực đề tài chỉnh sửa luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Bệnh viện Phổi Hà Nội; giúp đỡ nhiều trình nghiên cứu Tôi xin gửi làm cảm ơn chân thành đến cán nghiên cứu sinh phòng thí nghiệm Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học, người luôn bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện cho học tập làm việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ gia đình bên động viên, ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập hoàn thành tốt khóa luận Cuối cùng, xin cảm ơn tất bạn bè giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, 25 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Quang Đạo Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Mục lục MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Nƣớc thải phƣơng pháp xử lý nƣớc thải 1.1.1 Khái niệm phân loại nƣớc thải 1.1.2 Thực trạng xử lý nƣớc thải bệnh viện trung tâm thu nhận bệnh nhân 1.1.3 Các phƣơng pháp xử lý vi sinh vật nƣớc thải 10 1.1.3.1 Phƣơng pháp vật lý 11 1.1.3.2 Phƣơng pháp hóa học 12 1.1.3.3 Phƣơng pháp sinh học 13 1.2 Bệnh lao 15 1.2.1 Bệnh lý học 15 1.2.2 Dịch tễ học 16 1.3 Vi khuẩn lao 18 1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn lao 18 1.3.2 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.4 Hạt nano ứng dụng 21 1.4.1 Các tính chất hạt nano 21 1.4.2 Hạt nano từ tính 23 1.4.3 Phức hệ phƣơng pháp tạo phức hệ với hạt nano 24 1.4.4 Ứng dụng hạt nano 26 1.5 Enzyme ứng dụng xử lý nƣớc thải 28 1.5.1 Ứng dụng enzyme xử lý nƣớc thải 28 1.5.2 Lysozyme 29 1.5.3 Lipase 29 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nguyên liệu 32 2.1.1 Vắc xin BCG mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin 32 2.1.2 Hạt từ nano amino (NP-NH2) chất xúc tác tạo phức hệ EDC 33 2.1.3 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn chèn 6110 33 2.1.4 Enzyme lipase, lysozyme kháng thể kháng lao 35 Luận văn Thạc sỹ Khoa học 2.1.5 2.2 Nguyễn Quang Đạo Các dung dịch đệm hóa chất khác 36 Phƣơng pháp 36 2.2.1 Tạo phức hệ hạt nano từ amino-kháng thể/enzyme 36 2.2.2 Thử độ bền vững phức hệ 37 2.2.3 Làm giàu ly giải vi khuẩn lao 37 2.2.4 Phân tích kết điện di phần mềm Image J 38 2.2.5 Xây dựng mô hình nước thải chứa vắc xin BCG thử nghiệm phức hệ 38 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Tối ƣu điều kiện phản ứng gắn 39 3.1.1 Tối ƣu nồng độ hạt từ nano amino 39 3.1.2 Tối ƣu nồng độ EDC thời gian phản ứng 41 3.1.3 Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể 42 3.2 Hiệu phức hệ việc bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn vắc xin BCG 44 3.2.1 Sử dụng phức hệ đơn 44 3.2.2 Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng bƣớc 46 3.2.3 Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bƣớc 48 3.3 Thử nghiệm phức hệ mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 51 3.3.1 Thử nghiệm phức hệ hạt từ kháng thể mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 51 3.3.2 Sử dụng phức hệ đơn phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG 52 Kết luận 56 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Bảng ký hiệu chữ viết tắt AP Alkaline Phosphatase BCG Bacillus Calmette Guerin EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IS6110 Insert Sequence 6110 MTB Mycobacterium tuberculosis NHS N-hydroxysuccinimide NP-NH2 Nano amino Particles PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction SEM Scan Electron Microscope SMCC Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan – – carboxylate TAE Tris base-Acetic Acid-EDTA TB Tuberculosis TE Tris-HCl-EDTA WHO World Health Organization Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Danh mục bảng: Bảng 1.1 Một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm có mặt nước thải 10 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 32 Danh mục hình: Hình 1.1 Sử dụng màng lọc để bắt giữ vi khuẩn nước thải 11 Hình 1.2 Chu trình phát triển Bdellovibrio bacteriovorus 14 Hình 1.3 Con đường lây nhiễm bệnh lao 17 Hình 1.4 Hình ảnh SEM vi khuẩn lao (MTB) 19 Hình 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 20 Hình 1.6 Hạt nano từ bọc silica 24 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử SMCC 25 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử EDC 25 Hình 1.9 Phản ứng tạo liên kết amide xúc tác EDC 26 Hình 2.1 Vắc-xin BCG 30 Hình 2.2 Đoạn chèn IS6110 đặc trưng cho vi khuẩn lao cặp mồi sử dụng cho PCR 32 Hình 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 33 Hình 2.4 Phần mềm phân tích ảnh ImageJ 36 Hình 3.1 Tối ưu thể tích hạt nano từ tính phản ứng gắn 38 Hình 3.2 a Thời gian gắn kháng thể lên hạt nano từ tạo phức hệ bắt giữ 39 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.2a phần mềm ImageJ Hình 3.3 a Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể Hình 3.4 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.3a phần mềm ImageJ Phức hệ đơn Hình 3.5 a Sử dụng phức hệ đơn bắt giữ ly giải vi khuẩn vắc xin BCG 39 41 41 43 44 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.5a phần mềm ImageJ 44 Hình 3.6 Phức hệ kép tạo thành qua bước phản ứng 45 Hình 3.7 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng bước bắt giữ ly giải vi khuẩn mẫu vắc xin BCG Hình 3.8 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.7a phần mềm ImageJ Phức hệ kép hình thành qua hai bước phản ứng Hình 3.9 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bước so sánh với phức hệ kép từ phản ứng bước 46 46 47 48 b Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.9a phần mềm ImageJ Hình 3.10 Kiểm tra khả bắt giữ vi khuẩn phức hệ hạt từ kháng thể Hình 3.11 a sử dụng phức hệ đơn, phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nước thải bổ sung vắc xin BCG 48 50 51 b Phân tích độ sáng băng tương ứng hình 3.11a phần mềm imageJ Các mẫu 1-6 tương ứng với mẫu từ 1-6 hình 3.11a Hình 3.12 Kiểm tra khả bắt giữ ly giải tế bào phức hệ đơn 51 53 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo MỞ ĐẦU Hiện nay, sở bệnh viện, trung tâm thu nhận người mắc bệnh truyền nhiễm nơi tập trung lượng lớn vi sinh vật gây bệnh Nước thải từ sở chứa nhiều tác nhân vi khuẩn, virus có khả lây nhiễm, phương pháp xử lý thích hợp trở thành nguy lây lan bệnh truyền nhiễm Các vi sinh vật có nước thải bao gồm nhiều loài khác nhau, đề tài tập trung vào đối tượng nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh lao Mycobacterium tuberculosis (MTB) Lao bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ bệnh nhân tử vong cao thứ hai Theo ước tính Tổ chức Y tế giới WHO, đến năm 2015 khoảng phần ba dân số toàn cầu nhiễm vi khuẩn lao dạng tiềm tàng, năm có khoảng 10 triệu ca nhiễm lao (10,4 triệu ca năm 2015), gây tử vong cho triệu người năm hầu hết nước phát triển [2][3] Ở Việt Nam, gia tăng nhanh chóng chủng lao đa kháng thuốc làm cho việc chữa trị lao trở nên phức tạp hơn, theo số liệu điều tra từ chương trình chống lao quốc gia Việt Nam, khoảng 40% số bệnh nhân Việt Nam cho kết kháng thuốc với Rifampin, loại thuốc kháng sinh hàng quan trọng [4] Vi khuẩn lao chủng nguy hiểm không khả gây bệnh mà khả sống sót cao môi trường tự nhiên Vi khuẩn lao tồn đất (ẩm khô) tuần, bảo vệ khỏi tiếp xúc với ánh sáng, trì sống tới 74 ngày lâu chất thải động vật.[5] Hiện nay, để xử lý vi sinh vật nước thải phương pháp thường sử dụng chia vào ba nhóm chính: phương pháp vật lý, hóa học sinh học, nhiên, phương pháp vật lý, hóa học tốn để lắp đặt hệ thống xử lý trì thời gian dài, số phương pháp có nguy tái nhiễm vi khuẩn cao Từ lí nêu trên, để tiêu diệt vi khuẩn lao nước thải góp phần ngăn chặn nguy lây nhiễm (đặc biệt chủng lao kháng thuốc), tiến hành nghiên cứu đề tài “Phát triển phương pháp xử lý vi khuẩn lao nước” sử dụng công nghệ nano kết hợp với công nghệ protein enzyme Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Nƣớc thải phƣơng pháp xử lý nƣớc thải 1.1.1 Khái niệm phân loại nƣớc thải Nước nguồn tài nguyên đặc biệt, không chất thay cần sử dụng tiết kiệm, hợp lý Tổng trữ lượng nước trái đất vào khoảng 1.386 triệu km3 [6], nước nước dùng cho người có hạn tái tạo lại dường phân bố không không kịp cho nhu cầu sử dụng Nước chiếm khoảng 2,7% tổng lượng nước trái đất; nằm dạng băng 77,22%, nước ngầm 22,42%, hồ đầm 0,35%, sống suối 0,01% lượng nước Nguồn nước ngầm thường có xu hướng giảm khai thác nhiều mà không bổ sung kịp thời [7] Do việc tái sử dụng nước thải cho an toàn vấn đề cấp thiết quan tâm Theo Tilley cộng nước thải định nghĩa nước mà chất lượng bị ảnh hưởng xấu tác động người Nước thải bao gồm chất thải dạng lỏng từ hoạt động sinh hoạt, công nghiệp, thương mại, nông nghiệp nước mưa đổ vào hệ thống cống [8] Người ta định nghĩa nước thải chất lỏng thải sau trình sử dụng người bị thay đổi tính chất ban đầu chúng Thông thường nước thải phân loại theo nguồn gốc phát sinh, sở việclựa chọn biện pháp giải công nghệ xử lý [9] Hệ thống nước thải phổ biến chia làm năm loại Đầu tiên nước thải sinh hoạt: bắt nguồn từ khu dân cư, khu vực hoạt động thươngmại, khu vực công sở, trường học sở tương tự khác Tiếp nước thải công nghiệp (hay gọi nước thải sản xuất): từ nhà máy hoạt động nước thải công nghiệp chủ yếu Thứ ba nước thấm qua: lượng nước thấm vào hệ thống ống nhiều cách khác nhau, qua khớp nối, đường ống rò rỉ thành hố ga Thứ tư nước thải tự nhiên: nước mưa xem nước thải tự nhiên thành phố đại, thu gom theo hệ thống riêng Cuối nước thải đô thị: thuật ngữ chung chất lỏng hệ thống cống thoát thành phố, thị Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo kháng thể lên hạt từ tới enzyme (hình 3.9a) ngược lại Sau phức hệ kép sử dụng để làm giàu vi khuẩn mẫu tiến hành ủ ly giải 37oC sau thu ADN tiến hành PCR Đồng thời tiến hành thí nghiệm với phức hệ kép tạo thành sau bước phản ứng để so sánh phương pháp tạo phức hệ Kết thể hình 3.9 Hình 3.9a: Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bước so sánh với phức hệ kép từ phản ứng bước (-), M, (+): đối chứng âm, thang chuẩn 100bp, đối chứng dương Giếng 1, 2: phức hệ kép tạo thành bước gắn đồng thời kháng thể enzyme (lần lượt lysozyme lipase) Giếng 3, 4: Phức hệ tạo thành qua bước gắn liên tiếp kháng thể sau enzyme lên hạt từ (lần lượt lysozyme lipase) Giếng 5, 6: Phức hệ tạo thành qua bước gắn liên tiếp enzyme sau kháng thể lên hạt từ (lần lượt lysozyme lipase) 49 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Hình 3.9b: Phân tích độ sáng băng ADN hình 3.9a phần mềm ImageJ Kết thí nghiệm khẳng định lại lysozyme có hiệu trình ly giải tế bào vi khuẩn, thể qua băng 1, 3, sáng băng 2, 4, Từ kết ta nhận thấy phức hệ kép tạo thành hiệu suất phức hệ kép tạo thành sau bước gắn tốt Kết giải thích đưa đồng thời kháng thể enzyme vào phản ứng gắn với tỉ lệ gần tương đương 1:1 phức hệ kép tạo thành có khả bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn cân từ thu kết tốt Trong kết phương pháp gắn hai bước gắn kháng thể enzyme lên hạt trước, phân tử chiếm vị trí nhóm NH2 bề mặt hạt làm cho hiệu suất gắn protein bổ sung bước thứ hai hay nói cách khác vị trí gắn bị khóa lại Điều thể số quy trình gắn trước để hạn chế việc gắn không đặc hiệu lên hạt, BSA sử dụng để khóa lại vị trí gắn hạt [54, 55] Do phức hệ tạo có khả ly giải có khả bắt giữ vi khuẩn so với phức hệ kép gắn đồng thời bước phản ứng Từ kết này, thí nghiệm phương pháp gắn bước đồng thời kháng thể enzyme lên hạt tạo phức hệ kép áp dụng 50 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 3.3 Thử nghiệm phức hệ mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG Phương pháp PCR phương pháp sử dụng để xác định có mặt vi khuẩn mẫu nước thải thu từ bệnh viện địa bàn Hà Nội Theo thí nghiệm thực lượng nước thải sau đun lên 100oC đưa trực tiếp vào PCR không vượt 8% tổng thể tích phản ứng phản ứng PCR diễn bình thường Tuy nhiên kết thu từ mẫu nước thải âm tính với phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Do thí nghiệm, để tạo mẫu chuẩn thử nghiệm vắc xin BCG bổ sung vào mẫu nước thải để kiểm tra hoạt tính phức hệ 3.3.1 Thử nghiệm phức hệ hạt từ kháng thể mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG Khả bắt giữ vi khuẩn lao phức hệ hạt từ kháng thể điều kiện quan trọng để ứng dụng xử lý vi khuẩn Do trước tiến hành thí nghiệm với phức hệ hạt từ enzyme phức hệ kép thí nghiệm kiểm tra khả bắt giữ vi khuẩn thực kết thể hình 3.10 Hình 3.10: Kiểm tra khả bắt giữ vi khuẩn phức hệ hạt từ kháng thể -, M, + : đối chứng âm, thang chuẩn 100bp, đối chứng dương 1: mẫu phức hệ hạt từ kháng thể bắt giữ vi khuẩn nước thải 2: mẫu vi khuẩn nước thải trực tiếp ly giải nhiệt độ 51 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Từ kết nhận thấy phức hệ hạt từ kháng thể có khả bắt giữ vi khuẩn môi trường nước thải Sử dụng phần mềm ImageJ so sánh độ sáng băng giếng cho thấy mẫu sử dụng phức hệ hạt từ kháng thể cho băng có độ sáng khoảng 70% so với ly giải trực tiếp mẫu nước thải bổ sung vi khuẩn từ vắc xin BCG Có thể kết luận hoạt động nước thải phức hệ đơn hạt từ kháng thể có khả bắt giữ khoảng 70% lượng vi khuẩn Kết giải thích yếu tố độ pH nồng độ ion có nước thải gây ảnh hưởng tới khả bắt cặp kháng thể kháng nguyên bề mặt vi khuẩn [56,57] Từ tiến hành thí nghiệm với hỗn hợp phức hệ đơn hạt từ kháng thể, hạt từ enzyme phức hệ kép hạt từ kháng thể enzyme 3.3.2 Sử dụng phức hệ đơn phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG Mục đích thí nghiệm kiểm tra khả bắt giữ ly giải tế bào hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phức hệ đơn phức hệ kép tạo thành bước phản ứng Các phức hệ tạo trước đưa vào nước thải để bắt giữ vi khuẩn Sau mẫu ủ 37 oC 30 phút nhiệt độ tối thích để ủ enzyme ly giải tế bào đưa vào PCR Trong thí nghiệm mẫu phức hệ đơn hạt từ kháng thể bắt giữ vi khuẩn sau ly giải nhiệt độ mẫu nước thải chứa vi khuẩn ly giải trực tiếp nhiệtvẫn áp dụng để đối chứng lượng vi khuẩn có nước thải lượng vi khuẩn bắt giữ sử dụng phức hệ đơn Kết thể hình 3.11 52 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo a b Hình 3.11a: Kết sử dụng phức hệ đơn, phức hệ kép bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn mẫu nước thải bổ sung vắc xin BCG -, M, + : đối chứng âm, thang chuẩn 100bp, đối chứng dương Ab: mẫu hạt từ kháng thể bắt giữ vi khuẩn lao nước thải Ab+ly: phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ enzyme lysozyme, Ab+li: phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ lipase, Ab-ly: phức hệ kép hạt từ kháng thể enzyme lysozyme, Ab-li: phức hệ kép hạt từ kháng thể enzyme lipase Hình 3.11b: Phân tích độ sáng băng tương ứng hình 3.11a phần mềm imageJ Các mẫu 1-6 tương ứng với mẫu (+); Ab; Ab+ly; Ab+li; Ab-ly; Ab-li hình 3.11a Từ kết ta nhận thấy thí nghiệm so sánh lấy mẫu nước thải bổ sung vắc xin ly giải nhiệt làm đối chứng 100%, phức hệ đơn hạt từ kháng thể hoạt động hiệu bắt giữ tới 91,6% vi khuẩn có mẫu Tuy nhiên hoạt tính bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn hỗn hợp phức hệ đơn lại thấp hơn, phức hệ đơn sử dụng lysozyme đạt 60,2% đặc biệt phức hệ đơn sử dụng lipase đạt 3,9% Phức hệ kép cho kết tốt so sánh với phức hệ đơn phức hệ kép 53 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo lysozyme đạt 78,3%, lipase đạt 59,5% Từ ta kết luận môi trường nước thải lysozyme có hoạt tính ly giải tốt lipase, phức hệ kép cho kết bắt giữ ly giải tế bào hiệu so với phức hệ đơn Đặc biệt phức hệ đơn lipase cho hiệu suất trình thấp Có thể lipase bị ảnh hưởng ức chế tạp chất mẫu nước thải dạng phức hệ đơn lipase chịu ức chế nhiều dạng phức hệ kép Các tạp chất bao gồm muối kim loại sunfat đồng, bạc nitrat, sodium chloride [58] Để kiểm chứng lại khả bắt giữ ly giải tế bào phức hệ đơn thí nghiệm sử dụng phức hệ đơn mẫu nước thải lặp lại, thí nghiệm sau bắt giữ vi khuẩn mẫu phức hệ đơn tỉ lệ 1:1 ly giải phương pháp: ủ enzyme 37oC ly giải nhiệt 100oC Kết thể hình 3.12 Hình 3.12: Kiểm tra khả bắt giữ ly giải tế bào phức hệ đơn -, M, + : đối chứng âm, thang chuẩn 100bp, đối chứng dương mẫu hạt từ kháng thể bắt giữ vi khuẩn lao nước thải phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ enzyme lysozyme ủ enzyme 37oC, phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ lipaseủ enzyme 37oC, phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ lysozyme ly giải nhiệt 100oC, phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ lipase ly giải nhiệt 100oC 54 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Kết cho thấy lysozyme có hoạt tính ly giải tốt thí nghiệm mẫu ủ 37oC lipase không lên băng, lipase bị ức chế So sánh với mẫu sử dụng nhiệt để ly giải ta nhận thấy rõ ràng khả bắt giữ vi khuẩn trộn phức hệ đơn theo tỉ lệ 1:1 so với mẫu sử dụng phức hệ đơn hạt từ kháng thể 20,3% với mẫu lysozyme 11.6% sử dụng nhiệt độ ly giải Kết sử dụng lysozyme ly giải cho băng có độ sáng tương đương với sử dụng nhiệt Khi so sánh hai mẫu sử dụng nhiệt ly giải ta nhận thấy hỗn hợp phức hệ lysozyme cho băng sáng gần gấp lần hỗn hợp lipase Như hỗn hợp sử dụng lysozyme có khả bắt giữ vi khuẩn tốt so với lipase 55 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Kết luận Từ kết thu ta rút kết luận sau: Đã tối ưu điều kiện cho phản ứng gắn hạt từ protein bao gồm: thời gian phản ứng tối ưu 30 phút, nồng độ EDC tối ưu xúc tác phản ứng gắn 6,67 mg/ml bổ sung thời điểm bắt đầu phản ứng sau phản ứng diễn 15 phút, nồng độ hạt từ tối ưu 0,67mg/ml Phức hệ hạt từ kháng thể tạo thành có độ bền lên tới tháng Tạo phức hệ đơn: hạt từ kháng thể, hạt từ enzyme lipase, hạt từ enzyme lysozyme Và phức hệ kép kháng thể hạt từ enzyme (lipase lysozyme) Phức hệ thử nghiệm, có khả bắt giữ ly giải vi khuẩn lao mẫu vắc xin BCG, hỗn hợp phức hệ đơn hạt từ kháng thể hạt từ lysozyme cho kết tốt Khi thử nghiệm mẫu nước thải bổ sung vắc xin BCG phức hệ có khả bắt giữ ly giải tế bào vi khuẩn, phức hệ kép từ phản ứng bước sử dụng enzyme lysozyme cho kết tốt Kiến nghị Tiếp tục thử nghiệm phức hệ tạo thành mẫu nước thải có chứa vi khuẩn lao MTB theo hướng tăng độ bền phức hệ hiệu suất trình Xây dựng mô hình xử lý nước thải có chứa vi khuẩn lao sử dụng hạt từ gắn kháng thể hạt từ gắn enzyme Tiếp tục mở rộng thử nghiệm với loại vi khuẩn gây bệnh khác có mặt nước thải 56 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Quang Huy, Ngô Thị Kim Toán “Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam” tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 43 Tài liệu tiếng Anh [2] WHO Tuberculosis Global Report 2016 [3] World Health Organization (2011) "The sixteenth global report on tuberculosis" [4] “Viet Nam: Optimism for Multidrug-Resistant TB Patients” WHO, 2013 Available from: http://www.who.int/features/2013/viet_nam_tuberculosis/en/ January 2016 [5] Duffield, B J., & Young, D A (1985) “Survival of Mycobacterium bovis in defined environmental conditions” Veterinary Microbiology, 10(2), 193-197 [6] I.A Shiklomanov, John C.Rodda “World water resource at the beginning of 21 century” International hydrology series ISBN 0-521-82085-5 [7] Peter Gleick; Heather Cooley; David Katz (2006) “The world's water, 2006–2007: the biennial report on freshwater resources” Island Press pp 29–31 ISBN 1-59726106-8 Retrieved 12 September 2009 [8] Tilley, E., Ulrich, L., Lüthi, C., Reymond, Ph., Zurbrügg, C “Compendium of Sanitation Systems and Technologies – (2nd Revised Edition)” Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag), Duebendorf, Switzerland p 175 ISBN 978-3-906484-57-0 [9] Nena NwachukuCharles P Gerba “Occurrence and persistence of Escherichia coli O157:H7 in water Reviews” in Environmental Science and Bio/Technolog September 2008, 7:267 DOI: 10.1007/s11157-008-9132-0 [10] Guy Kisluk and Sima Yaroncorresponding “Presence and Persistence of Salmonella enterica Serotype Typhimurium in the Phyllosphere and Rhizosphere of Spray-Irrigated Parsley” Appl Environ Microbiol 2012 Jun; 78(11): 4030–4036 doi: 10.1128/AEM.00087-12 PMCID: PMC3346414 57 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [11] Adesioye Fiyinfoluwa A., Fiyinfoluwa A Adesioye and Adeniyi A Ogunjobi “181 Comparative Study of Persistence of Escherichia coli, Salmonella Sp And Shigella Sp In Different Water Samples Stored under Various Storage Conditions” Nov 12, 2013; ISSN 1818-4952 IDOSI Publications, 2013 DOI: 10.5829/idosi.wasj.2013.26.02.7613 [12] Jubair M., Morris J G., Jr., Ali A (2012) “Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel “persister” phenotype” PLoS ONE 7:e4518710.1371/journal.pone.0045187 [13] Mark D Sobsey and John Scott Meschke “Virus survival in the environment with special attention to survival in sewage droplets and other environmental media of fecal or respiratory” august 21, 2003 [14] U.S Environmental Protection Agency (EPA) Wastewater technology fact sheet Ultraviolet disinfection, EPA 832-F-99-064 September 1999 [15] U.S EPA Wastewater technology fact sheet Chlorine disinfection, EPA 832-F99-062 September 1999 [16] U.S EPA Wastewater technology fact sheet Ozone disinfection, EPA 832-F-99063 September 1999 [17] Madigan, Michael T (2011-01-07) Brock Biology of Microorganisms,: Global Edition Pearson Education ISBN 9780321735515 [18] Strauch, E.; Beck, S.; Appel, B (2007) "Bdellovibrio and Like Organisms: Potential Sources for New Biochemicals and Therapeutic Agents" Predatory Prokaryotes Microbiology Monographs p 131 doi:10.1007/7171_2006_055 ISBN 978-3-540-38577-6 [19] Schwudke, M; Linscheid, M; Strauch, E; Appel, B; Zähringer,U; Moll, H; Müller, M; Brecker, L; Gronow, S; and Lindner, B “The Obligate Predatory Bdellovibrio bacteriovorus Possesses a Neutral Lipid A Containing -D-Mannoses That Replace Phosphate Residues” J Biol Chem 2003 Volume 278 Issue 30 27502-27512.] [20] J C Fry and D G Staples “Distribution of Bdellovibrio bacteriovorus in sewage works, river water, and sediments” Applied and Environmental Microbiology, 1976 Volume 31 No Pages 469–474 [21] Jindal, editor-in-chief SK Textbook of pulmonary and critical care medicine, New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers pp 549 ISBN 978-93-5025-073-0 58 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [22] ACTION 2009 Living with HIV, Dying of TB: A Critique of the Response of Global AIDS Donors to the Co-epidemic, Washington, DC: RESULTS Educational Fund [23] Ismael Kassim, Ray CG (editors) (2004) Sherris Medical Microbiology, (4th ed.) McGraw Hill ISBN 0-8385-8529-9 [24] Cole E, Cook C (1998) "Characterization of infectious aerosols in health care facilities: an aid to effective engineering controls and preventive strategies" Am J Infect Control 26 (4): 453–64 doi:10.1016/S0196-6553(98)70046-X PMID 9721404 [25] Nicas M, Nazaroff WW, Hubbard A (2005) "Toward understanding the risk of secondary airborne infection: emission of respirable pathogens" J Occup Environ Hyg (3): 143–54 doi:10.1080/15459620590918466 PMID 15764538 [26] Wells WF Aerodynamics of droplet nuclei In: Airborne contagion and air hygiene, Cambridge: Harvard University Press, 1955:13–9 [27] Amanda E Fine, Carole A Bolin, Joseph C Gardiner, and John B Kaneene “A Study of the Persistence of Mycobacterium bovis in the Environment under Natural Weather Conditions in Michigan, USA” Veterinary Medicine International, Volume 2011, Article ID 765430, 12 pages [28] Robert Koch and Tuberculosis: “Koch's Famous Lecture" Nobel Foundation 2008 Retrieved 2008-11-18 [29] Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2005) Medical Microbiology, Elsevier Mosby Page 230-234 [30] Pere-Joan Cardona : Understanding Tuberculosis - Deciphering the Secret Life of the BacilliEdited, ISBN 978-953-307-946-2, Hard cover, 334 pages, Publisher: InTech [31] Sharma SK, Mohan A Multidrug-resistant tuberculosis: a menace that threatens to destabilize tuberculosis control, Chest 2006; 130: 261-272 [32] Brosch RG, Gordon SV, Eiglmeier K, Garnier T, Tekaia F, Yeramian E, Cole ST: “Genomics , biology , and evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex” Molecular Genetics of Mycobacteria Edited by: Hatfull GF & Jacobs WR Jr 2000, Washington DC, USA: American Society for Microbiology Press, 19-36 ISBN 155581-191-4, [33] Fomukong NG, Tang TH, al-Maamary S, Ibrahim WA, Ramayah S, Yates M, Zainuddin ZF, Dale JW: “Insertion sequence typing of Mycobacterium tuberculosis: 59 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110” Tuber Lung Dis 1994, 75: 435-440 10.1016/0962-8479(94)90117-1 [34] Lok KH, Benjamin WH, Kimerling ME, Pruitt V, Lathan M, Razeq J, Hooper N, Cronin W, Dunlap NE: Molecular differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains without IS6110 insertions Emerg Infect Dis 2002, 8: 1310-1313 10.3201/eid0811.020291 [35] Hostetler, M J.; Wingate, J E.; Zhong, C.-Z.; Harris, J E.; Vachet, R W.; Clark, M R.; Londono, J D.; Green, S J.; Stokes, J J.; Wignall, G D.; Glish, G L.; Porter, M D.; Evans, N D.; Murray, R W “Alkanethiolate Gold Cluster Molecules with Core Diameters from 1.5 to 5.2 nm: Core and Monolayer Properties as a Function of Core Size” Langmuir 1998, 14, 17-30 [36] Greg T.Hermanson Bioconjugate techniques 2nd edition, Elsevier Inc, Academic Press, 2008 pp 215-250 [37] Lexinnova, Nanoparticles smart drugs delivery system for cancer, [38] Lam T, Pouliot P, Avti PK, et al “Superparamagnetic iron oxide based nanoprobes for imaging and theranostics” Adv Colloid Interface Sci 2013;199– 200:95–113 [39] Hashim Z, Green M, Chung PH, et al “Gd-containing conjugated polymer nanoparticles: bimodal nanoparticles for fluorescence and MRI imaging” Nanoscale 2014;6:8376–8386 [40] McKenzie HA, White FH (1991) "Lysozyme and alpha-lactalbumin: structure, function, and interrelationships" Adv Protein Chem 41: 173–315 doi:10.1016/s00653233(08)60198-9 PMID 2069076 [41] Luan L Chu, Dao Q Nguyen, Hieu M Nguyen, Nguyen Hoang Nam, Anh T.V Nguyen, Tuan-Nghia Phan, Nguyen Hoang Luong, Yen Pham: “Specificity and processing rate enhancement of Mycobacterium tuberculosis diagnostic procedure using antibody-coupled magnetic nanoparticles” Int J Nanotechnol, Vol 12, Nos 5/6/7 (2015) [42] Gilles, M A; Hudson, A Q; Borders, C L “Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution.” Anal Biochem 1990 Feb 1;184(2):244-8 PMID: 2158246 60 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [43] Yashwant Pathak, Simon Benita Antibody-Mediated Drug Delivery Systems: Concepts, Technology, and Applications, page 321 [44] Mustafa Raoof, MD, Stuart J Corr, PhD, Warna D Kaluarachchi, MS, Katheryn L Massey, Katrina Briggs, Cihui Zhu, Matthew A Cheney, Lon J Wilson, PhD, and Steven A Curley, MD, “Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endo-lysosomal nanoenvironment: Implications for non-invasive radiofrequency-based cancer therapy” Nanomedicine 2012 Oct; 8(7): 1096–1105 2012 Feb 17 doi: 10.1016/j.nano.2012.02.001 PMCID: PMC3392470 [45] Buck GE, O’Hara LC, Summersgill JT “Rapid, simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis to remove DNA for polymerase chain reaction” J Clin Microbiol.1992;30:1331–4 [46] Aldous WK, Pounder JI, Cloud JL, Woods GL “Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR” J Clin Microbiol 2005;43:2471–3 [47] Cukalevski R, Lundqvist M, Oslakovic C, Dahlbäck B, Linse S, Cedervall T “Structural changes in apolipoproteins bound to nanoparticles.” Langmuir 2011 Dec 6;27(23):14360-9 doi: 10.1021/la203290a Epub 2011 Nov [48] Malvindi MA; Matteis A, Galeone A, Brunetti V, George C Anyfantis, Athanassia Athanassiou, Roberto Cingolani, Pier Paolo Pompa “Toxicity Assessment of Silica Coated Iron Oxide Nanoparticles and Biocompatibility Improvement by Surface Engineering” January 21, 2014 [49] World Health Organization, Silver: water disinfection and toxicity, Spring 2014 [50] Whiteley CG; Lee D-J 2006 “Enzyme Technology and Biological Remediation: A Review,” Enz .Microbial Tech 38, (3-4): 291-316 [51] Enongene, G Pletschke, BI, Rose, PD Whittington-Jones, K Whiteley CG 2003 “Codigestion of primary sewage sludge and industrial wastewater under anaerobic 61 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo sulphate reducing conditions: Enzymatic profiles in a Reciprocating Sludge Bed Reactor Water” Science & Technology, 48(4), 129-138 [52] Ngesi, N Pletschke, BI Rose PD Whiteley CG 2002 “Specific sulphur metabolites stimulate β-glucosidase activity in an anaerobic sulphidogenic bioreactor.” Biotech Letts., 24, 1509-1513 [53] Goodfriend Tl, Levine L, Fasman Gd “Antibodies to bradykinin and angiotensin: a use of carbodiimides in immunology” Science 1964 Jun 12;144(3624):1344-6 [54] R Chauhan, T Basu “Functionalised Au Coated Iron Oxide Nanocomposites Based Reusable Immunosensor for AFB1 Detection” Journal of Nanomaterials, Volume 2015 (2015), Article ID 607268, 15 pages [55] Da-He Fan, Shi-Wei Yuan, Yong-Miao Shen “Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly(dimethylsiloxane) microchip” Colloids and surfaces B: Biointerfaces 75(2):608-11 · November 2009 [56] Hughes-Jones NC, Gardner B, Telford R “The effect of pH and ionic strength on the reaction between anti-D and erythrocytes” Immunol 1964;7:72–81 [57] Karush F “Immunologic specificity and molecular structure” Adv Immunol 1962;2:1–40 [58] J.M Jandal “Some factors affecting lipase activity in goat milk” Small Ruminant Research, Volume 16, Issue 1, March 1995, Pages 87-91 Trang mạng: [59] http://www.mycobacteriumtuberculosis.net/history.html [60] http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium [61] http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis [62] http://www.who.int/tb/xdr/xdrtb_sept06news.pdf [63] http://en.wikipedia.org/wiki/Lipase 62 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo [64] https://imagej.nih.gov/ij/ 63 ... thống xử lý nước thải bệnh vi n nano bạc sử dụng kết hợp với ion đồng để chống lại hình thành khuẩn lạc Legionella spp Vi c sử dụng nano bạc khử khuẩn phương pháp hứa hẹn thay sử dụng clo xử lý nước. .. [39] Xử lý nƣớc Từ lâu khả kháng khuẩn bạc biết đến, nhiên đến gần vi c sử dụng hạt nano bạc hệ thống xử lý nước dạng tự phủ lên màng lọc sứ bắt đầu áp dụng Các hạt nano bạc có khả kháng khuẩn. .. 16 1.3 Vi khuẩn lao 18 1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn lao 18 1.3.2 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.4 Hạt nano ứng dụng 21 1.4.1 Các tính chất hạt nano