Bài viết tiến hành thu thập. phân lập và xác định nguồn bệnh bạc lá bằng kỹ thuật PCR. Bảo quản nguồn bệnh phân lập đƣợc để làm vật liệu nghiên cứu. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠC LÁ LÚA BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ VÀ BẢO QUẢN NGUỒN BỆNH CHO NGHIÊN CỨU DENTIFICATION OF RICE BACTERIAL LEAF BLIGHT Xanthomonas oryzae BY PCR Đồn Thị Thanh Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam Abstract Bacterial blight (BB) is one of the most destructive disease of rice plants in almost rice growing countries in both temperature and tropical regions especially in Asia This is also a major disease of rice in Viet nam This disease is multiplicate increase during the past 10 years in the Northern Vietnam in both two seasons of rice We collected isolates of the bacterial leaf bright of rice from various regions of Northern Vietnam The identification of Xanthomonas oryzae (X.oryzae) species by PCR showed that: There are 29 isolates of X.oryzae by using primers X R -F and X R -R2 Time preservation of X.oryzae in liquid glycerol last one year, in skim milk medium over one year and in water only two months Keywords: Xanthomonas oryzae, PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạc nguyên nhân vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây nên, bệnh hại nguy hiểm lúa hai vụ: vụ xuân vụ mùa nƣớc ta Những năm gần bệnh gây thiệt hại nặng, đặc biệt giống lúa lai giống lúa nhập nội từ Trung quốc Do cần xác định xác nguồn bệnh làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống cần thiết Do vậy, tiến hành thu thập phân lập xác định nguồn bệnh bạc kỹ thuật PCR Bảo quản nguồn bệnh phân lập đƣợc để làm vật liệu nghiên cứu Bắc Việt Nam - Các môi trƣờng để phân lập bảo quản vi khuẩn hoá chất cần thiết để chạy PCR xác định nòi vi khuẩn bạc lúa 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phân lập nòi vi khuẩn bạc lúa môi trƣờng Wakimoto, 1995 - Phƣơng pháp lây nhiễm theo GS.TS.S.Taura (2000) - Phƣơng pháp PCR để xác định nòi vi khuẩn theo GS.TS.S.Taura (2000) - Phƣơng pháp bảo quản Wakimoto (1995) nguy Hwang (1998) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu bao gồm 0 nguồn bệnh đƣợc thu thập từ vùng trồng lúa miền Thu thập nguồn bệnh Chúng thu thập nguồn bệnh từ vùng trồng lúa miền Bắc Việt nam Kết thu đƣợc bảng Bảng1 Danh sách isolates thu thập STT 10 11 12 14 15 16 Dòng RR Nơi thu thập vi khuẩn chuẩn từ An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây VAS , Hà Tây Hoài Đức, Hà Tây Đồng Hỷ, Thái Nguyên Đồng Hỷ, Thái Nguyên ĐH Nông Lâm, Thái Nguyên Thanh Trì, Hà Nội VAS , Hà nội -1 VAS , Hà nội -2 VAS , Hà nội Quế Võ, Bắc Ninh -1 Quế Võ, Bắc Ninh -2 VAS , Hà nội -4 VAS , Hà nội -5 Lây nguồn bệnh để xác định isolates bệnh Xanthomnas oryzae - Trƣớc xác định bệnh tiến hành lây thử lên dòng mẫn cảm R24 để thử độc tính vi khuẩn sau bảo quản - Tạo dung dịch lây nhiễm: Sau 48 vi khuẩn nuôi cấy mơi trƣờng Wakimoto mọc Khi ta lấy vịng vi khuẩn hồ với 10 ml nƣớc tạo dung dịch có nồng độ vi khuẩn từ 108109 / ml nƣớc Đem dung dịch lây nhiễm - Lây nhiễm chủng cây, cắt toàn STT 17 Nơi thu thập VAS , Hà Nội - 18 19 20 Sơn Tây, Hà Tây TT xã, Sơn Tây, Hà Tây Sơn Tây, Hà Tây 21 22 24 25 26 Văn Giang, Hƣng ên -1 Văn Giang, Hƣng ên -2 Trại TN Lai Cách, Hƣng ên -1 Trại TN Lai Cách, Hƣng ên -2 Trƣờng NN, Việt ên, Bắc Giang Đơng Hƣng, Thái Bình 27 Hƣng Hà, Thái Bình 28 Thái Thuỵ, Thái Bình 29 Gia Lâm, Hà Nội Trâu Quì, Hà Nội Văn Giang, Hƣng ên có Kết hình 1 Hình Lây nhiễm nguồn bệnh để thử độc tính 1, Nguồn có độc tính cao; Nguồn có độc tính trung bình, Nguồn kháng bệnh Ly trích DNA Tất isolates đựơc nuôi cấy môi trƣờng Wakimoto, 1995 sau 49 để chiết tách AND Phƣơng pháp chiết tách ADN thep phƣơng pháp Wakimoto, 1995 .4 Xác định bệnh bạc phương pháp PCR Xác định bệnh bạc lúa nhờ cặp mồi X R -F X R -R2 theo phƣơng páhp Adachi ku (2000) .4.1 Phản ứng PCR + Hoá chất cần cho phản ứng PCR Hoá chất cần cho phản ứng gồm Taq bufer, Trí-HCL, KCl, Trion X-100, Taq polymera, MgCl2, dNPT, DNA khuôn,vv + Nhân gen Sau hồn chỉnh mẫu ly trích DNA ta tiến hành nhân gen Đặt mẫu vào máy nhân gen theo chu kỳ nhiệt định, gen bệnh bạc dùng chu kỳ nhiệt riêng .4.2 Điện di sản phẩm PCR Sau kết thúc phản ứng PCR, tiến hành chạy điện di sản phẩm nhân gen, chạy điện với agarose 2%.: Sau pha trộn đầy đủ, ủ chúng 70C Water bath ven vòng tiếng, ủ qua đêm Tiếp chạy điện di sản phẩm gen cắt agarose 2% Lúc phân biệt đƣợc vạch Thƣờng điện di dịng điện có hiệu điện 60V, cƣờng độ dòng điện 200 mA 0 phút Trong trƣờng hợp muốn có kết nhanh chạy với dòng điện 100 V, cƣờng độ dòng điện 200 mA 15 phút Tuỳ trƣờng hợp mà xử lý cƣờng độ, hiệu điện nhƣ thời gian khác .5 Kết phản ứng PCR để xác định bệnh bạc từ isolates Sau điện di, quan sát vạch gel, chúng tơi thu đƣợc kết hình 2: Hình Xác định nguồn vi khuẩn X.oryzae PCR - Đường 1: Gồm isolates từ 1-15: số nguồn bệnh chuẩn X.oryzae - Đường 2: số isolates từ 16- 0: số isolates theo thứ tự bảng Kết hình cho thấy 0 isolates thu thập vi khuẩn X.oryzae vạch băng trùng với vạch băng số dòng chuẩn vi khuẩn X.oryzae .6 Các phương pháp bảo quản vi khuẩn X.oryzae - Phƣơng pháp bảo quản nƣớc cất: sau cấy vi khuẩn 2- ngày môi trƣờng SPA (môi trƣờng Wakimoto, 1995) Lấy 0.2ml dịch khuẩn nồng độ 104 tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc bảo quản 6-80C Sau 1, 2, , tháng cấy chuyển lần để xác định mức độ sống sót tế bào vi khuẩn - Phƣơng pháp bảo quản phủ dung dịch glycerol: Lấy 0.2ml dịch khuẩn nồng độ 104 -6tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc bảo quản 6-80C Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển lần để xác định mức độ sống sót tế bào vi khuẩn - Phƣơng pháp bảo quản vi khuẩn băng: Lấy 0.2ml dịch khuẩn nồng độ 104 -6tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc bảo quản 6-80C Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển lần để xác định mức độ sống sót tế bào vi khuẩn Kết đựơc ghi nhận bảng 2: Bảng Mức độ sống sót tế bào vi khuẩn qua giai đoạn bảo quản Phƣơng pháp bảo quản Trong nước cất tháng tháng tháng tháng Trong glycerol tháng tháng 12 tháng 16 tháng Trong Skim milk tháng tháng 12 tháng 16 tháng Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) Tỷ lệ sống (%) Thời gian mọc (giờ) 0.60 0 0.10 100 65 15 48 50 56 0.66 0.67 0.65 0.60 100 100 98 40 48 48 48 54 0.68 0.70 0.68 0.69 100 100 100 98 48 48 48 48 Kết bảng cho thấy bảo quản vi khuẩn X.oryzae nƣớc cất đƣợc 1-2 tháng, glycerol khoảng 12 tháng, Skim milk 16 tháng V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Thu thập đƣợc 0 isolates vùng khác để phân lập bệnh bạc lúa Chẩn đoán đƣợc 29 isolates vi khuẩn X.oryzae kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi chọn lọc 4.2 Đề nghị: Cần nghiên cứu thu thập thêm nhiều nguồn vi khuẩn bạc lúa vùng bị bệnh hại TÀI LIỆU THAM KHẢO Adachi.N and T ku, 2000 PCR mediated detection of Xanthomonas oryzae pv ryzae by aplification of 16S-2 S rDNA spacer sequence J Gen.Plant Pathol 66: 0- 09 zuka, A and kaku, H, 2000 A historical review of bacterial blight of race Bull Nati nst Agrobiol Resour 15:1-207 Suwas, T 1962 Studies on the culture media of Xanthomonas oryzae ( yeda et shiyama) Wakimoto, S, 1995 Studies on multipulication of P phage (Xanthomonas oryzae bacteriophage) neăstep growth experiment under variuos condition Sci.Bull.Fac.Agric Kyushu niv 15: 151-160 (in Lapanese with nglish summary) Phan Hữu Tôn, 2004 Chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu bệnh bạc miền Bắc Việt nam Hội nghị quốc tế Quốc gia chọn tạo giống lúa Nhà xuất nông nghiệp, tr.115-120, 2004 ... phân lập bệnh bạc lúa Chẩn đoán đƣợc 29 isolates vi khuẩn X.oryzae kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi chọn lọc 4.2 Đề nghị: Cần nghiên cứu thu thập thêm nhiều nguồn vi khuẩn bạc lúa vùng bị bệnh hại TÀI... .4 Xác định bệnh bạc phương pháp PCR Xác định bệnh bạc lúa nhờ cặp mồi X R -F X R -R2 theo phƣơng páhp Adachi ku (2000) .4.1 Phản ứng PCR + Hoá chất cần cho phản ứng PCR Hoá chất cần cho phản ứng... -4 VAS , Hà nội -5 Lây nguồn bệnh để xác định isolates bệnh Xanthomnas oryzae - Trƣớc xác định bệnh tiến hành lây thử lên dòng mẫn cảm R24 để thử độc tính vi khuẩn sau bảo quản - Tạo dung dịch