Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng (polynemus melanochir valenciennes, 1831) tại đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ NHÀN NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ PHÈN VÀNG (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HỊA - 2017 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ NHÀN NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ PHÈN VÀNG (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 928/QĐ-ĐHNT ngày 26/9/2014 Quyết định thành lập hội đồng: 685/QĐ-ĐHNT ngày 02/8/2017 Ngày bảo vệ: 21/9/2017 Người hướng dẫn khoa học: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Chủ tịch Hội Đồng: PGS - TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA Khoa sau đại học: KHÁNH HỊA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) Đồng Sơng Cửu Long” Là cơng trình nghiên cứu thực cá nhân hướng dẫn TS.Đặng Thúy Bình sở lý thuyết học tìm hiểu thực tế địa phương Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực xác Chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Luận văn tham khảo tư liệu sử dụng thông tin đăng tải danh mục tài liệu tham khảo Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Thị Nhàn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất thời gian cho suốt q trình thực luận văn Đặc biệt tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình -người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học giảng dạy, cung cấp kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Cảm ơn dự án PEER 2-7 (USAID NSF tài trợ) cung cấp kinh phí hỗ trợ thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, người thân quan tâm, hỗ trợ động viên để hồn thành tốt luận văn Trong q trình thực khơng thể tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp hội đồng để luận văn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Thị Nhàn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH .ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan địa điểm nghiên cứu 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu .5 1.2.1 Một số đặc điểm sinh học họ cá nhụ Polynemidae .5 1.2.2 Một số đặc điểm sinh học loài Cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.3.1 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể 1.3.2 Một số phương pháp giải trình tự 15 1.3.3 Tổng quan phương pháp giải trình tự RAD (Restriction-site Associated DNA) 25 1.4 Một số kết nghiên cứu liên quan đến nội dung đề tài .29 1.4.1 Nghiên cứu nước .29 1.4.2 Nghiên cứu nước 32 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu phương pháp thu mẫu 34 2.1.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 34 2.1.2 Phương pháp thu mẫu 35 v 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái 35 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) ứng dụng công nghệ giải trình tự hệ .37 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Đặc điểm hình thái phân loại cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 46 3.2 Nghiên cứu di truyền cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 46 3.2.1 Tách DNA tổng số .46 3.2.2 Tạo thư viện gen 47 3.2.3 Xác định thị phân tử SNP quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 48 3.2.4 Xây dựng cấu trúc quần thể cá phèn vàng P melanochir Việt Nam 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt ĐBSCL µl DNA g PCR Polymerase Chain Reaction SNPs Single-nucleotide polymorphism GB Genbank AF Allele Frequency bp Base pairs 10 MRC 11 AG An Giang 12 DT Đồng Tháp 13 BT Bến Tre 14 TV Trà Vinh 15 BirdLife International Đọc Đồng sông Cửu Long Microliter Deoxyribonucleic acid Gam Mekong River Commission Hiệp hội tổ chức phi phủ quốc tế (iNGO) hoạt động lĩnh vực bảo tồn đa dạng sinh học vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số lượng mẫu cá phèn vàng (Polynemus melanochir) thu địa điểm 34 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt giới hạn 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện gen EzRAD 41 Bảng 2.4 Bộ ký tự ASCII mã hóa giá trị Q – score – 40 42 Bảng 2.5 Các giá trị thang đo Phred 43 Bảng 3.1 Số lượng thư viện mẫu giải trình tự 48 Bảng 3.2 Các giá trị độ bao phủ Coverage (cutoff1) Cutoff2 sử dụng xây dựng hệ gen tham chiếu 50 Bảng 3.3 Các thông số đa dạng di truyền quần thể cá phèn vàng dựa thị SNP 52 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền quần thể cá phèn ĐBSCL 53 Bảng 3.5 Kết phân nhóm quần thể cá phèn (k=3) ĐBSCL dựa phần mềm Structure .53 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình hình xâm nhập mặn Đồng Bằng Sông Cửu Long năm 2016 .4 Hình 1.2 Phân loại họ Polynemidae .6 Hình 1.3 Hình cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) Hình 1.4 Phân bố cá phèn vàng (Polynemus melanochir) .8 Hình 1.5 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 10 Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 12 Hình 1.7 Kỹ thuật SSR 13 Hình 1.8 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) .14 Hình 1.9 Cấu tạo dideoxynucleotides triphosphate (ddNTP) 15 Hình 1.10 Kết điện di gel polyacrylamide .16 Hình 1.11 Hai giai đoạn giải trình tự Sanger 16 Hình 1.12 Nguyên tắc kỹ thuật pyrosequencing 18 Hình 1.13 Các bước thực giải trình tự 18 Hình 1.14 Ba giai đoạn giải trình tự hệ (Illumina) 19 Hình 1.15 So sánh phương pháp Sanger giải trình tự hệ 20 Hình 1.16 Các bước chuẩn bị thư viện giải trình tự hệ thống 454 21 Hình 1.17 Các bước PCR nhũ tương 22 Hình 1.18 Các bước giải trình tự Illumina 23 Hình 1.19 Sơ đồ biểu diễn bước SOLID 25 Hình 1.20 Nguyên tắc tạo thư viện RAD .26 Hình 1.21 Phương pháp tạo thư viện gen phương pháp mbRAD 27 Hình 1.22 Hình thức cắt enzyme cắt giới hạn phương pháp ddRAD 27 Hình 1.23 Các bước giải trình tự tạo thư viện gen phương pháp 2bRAD 28 Hình 1.24 Quá trình tạo thư viện gen từ phương pháp EzRAD 29 Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu ĐBSCL 34 ix Hình 2.2 Một số phận cá xương 35 Hình 2.3 Các số đếm phân loại cá 36 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu di truyền quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir) 37 Hình 2.5 Quá trình Dam methyl hoá 38 Hình 2.6 Dam methyl hố Enzyme giới hạn MboI Sau3AI 38 Hình 2.7 Quá trình cắt enzyme tạo đầu đính 39 Hình 2.8 Cấu trúc Adapter .40 Hình 2.9 Quy trình dDocent 41 Hình 2.10 Dữ liệu di truyền sau giải trình tự định đạng file FASTQ 42 Hình 2.11 Quy trình tạo hệ gen tham chiếu cá phèn vàng 44 Hình 3.1 Hình thái cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) .46 Hình 3.2 Kết điện di DNA tổng số cá phèn vàng Bến Tre 47 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR 1.5% gel agarose 48 Hình 3.4 Hình ảnh (phần mềm Seaview) hệ gen tham chiếu dựa giá trị cutoff=3 Mũi tên đoạn trùng lắp (block) Các đoạn hạn chế lựa chọn hệ gen tham chiếu chuẩn 51 Hình 3.5 Phân tích cấu trúc di truyền quần thể cá phèn vàng theo phần mềm Structure 54 Hình 3.6 Mơ hình 3D phân tích PCoA dựa thị SNPs quần thể cá phèn vàng P melanochir ĐBSCL Vòng tròn thể phân nhóm quần thể 55 x TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: ADB, 2008 GMS: Climate Makers or Climate Takers? Understanding and Responding to the Challenges of Climate Change Background Paper GMS Development Dialogue 21 May Bùi Văn Sĩ, 2013 “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, sinh sản cá phèn” Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Cần Thơ Chu Hoàng Mậu, 2005 Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, Nxb Đại Học Sư phạm, trang 92 Kỷ Quang Vinh, 2012 Một Số Vấn Đề Phát Triển Bền Vững ĐBSCL Lê Anh Tuấn, 2008 Bài giảng Thủy văn môi trường Đại học Cần thơ, trang 76 Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng Trần Văn Diễn, 1995 Di truyền học, NXB Khoa học kỹ thuật Mai Đình Yên (chủ biên), Nguyễn Văn Trọng, Nguyễn Văn Thiện, Lê Hoàng Yến, Hứa Bạch Loan (1992), Định loại loài cá nước Nam Bộ, Nxb Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 351 tr Nguyễn Trung Vẹn,(2013) “Phân Tích Hiệu Quả Sản Xuất Trong Khai Thác Hải Sản Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long.” Diễn đàn “Bảo tồn Đa dạng Sinh học Biến đổi Khí hậu”, Thảo cầm viên Saigon, 22/5/2010 Phạm Hùng Vân Nguyễn Đỗ Phúc, 2012 Giải Trình Tự Gen Thế Hệ Mới: Cuộc Cách Mạng Trong Chẩn Đoán Nghiên Cứu Y Sinh Học Tạp chí Nghiên cứu khoa học Đại Học Y Dược tp.HCM, Tập 16, số 3, trang 10 Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR – Những vấn đề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học, 197 trang 11 Tống Xuân Tám, Phạm Văn Ngọt, Nguyễn Thị Hà, 2012 “Góp phần nghiên cứu đa dạng thành phần loài cá hệ sinh thái Rừng ngập mặn Cần Giờ, TP.HCM”, Tạp chí Khoa học, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, ISSN 1859-3100, 40(74), Trường Đại học Sư phạm TP.HCM, tr 91-104 61 12 Trần Đắc Định, Shibukawa Koichi, Nguyễn Thanh Phương, Hà Phước Hùng, Trần Xuân Lợi, Mai Văn Hiếu, Utsugi Kenzo, 2013 Mô tả định loại cá đồng sông Cửu Long, Việt Nam, Nxb Đại học Cần Thơ, 174 tr 13 Trương Thị Oanh 2016, ‘Xác định thị phân tử ứng dụng nghiên cứu di truyền quần thể cá hè chấm đỏ Lethrinus lentjan Lacepède, 1802 vùng biển Việt Nam’, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Đại học Nha Trang, Việt Nam 14 WWF, 2009 “Biến Đổi Khí Hậu Ở Khu Vực Mê Kơng Nguy Cơ Đối Với Đa Dạng Sinh Học, Dịch vụ Của Hệ Sinh Thái Phát Triển.” Tài liệu tiếng Anh: 15 Ashfaqun, N., Siddik, M.A.B., Alam, M.A., Ahsan, M.E., and Chaklader, M.R., 2014 Population Genetic Structure of Paradise Threadfin Polynemus paradiseus(Linnaeus, 1758) Revealed by Allozyme Marker World Journal of Zoology (4): 260-266 Doi: 10.5829/idosi.wjz.2014.9.4.86149 16 Adger, N., Aggarwal, P., Agrawala, S., Alcamo,J., Allali, A., Cruz, R V., Stone, J., 2007 Climate Change 2007: Impacts, Adaptation and Vulnerability Contribution of Working Group II Contribution to the Intergovermental Panel on Climate Change Fourth Assessment Report Summary for Policymakers 17 Baysal, B.E., DeLoia, J.A., Willett-Brozick, J.E., Goodman, M.T., Brady, M.F., Modugno, F., Lynch, H.T., Conley, Y.P., Watson, P., Gallion, H.H., 2004 Analysis of CHEK2 gene for ovarian cancer susceptibility Gynecol Oncol, Oct 2004; 95(1): 62-69 18 Baird, N A., Etter, P D., Atwood, T S., Currey, M C., Shiver, A L., Lewis, Z A., Selker, E U., Cresko, W A and Johnson E A., 2008 Rapid SNP Discovery and Genetic Mapping Using Sequenced RAD Markers, PLoS ONE, 3(10), p e3376 19 Beuzen, N D., Stear, M.J., Chang, K.C., 2000 Molecular markers and their use in animal breeding Veterinary Journal 160, 42-52 20 Brown, W M., George, M., & Wilson, A C., 1979 Rapid evolution of animal mitochondrial DNA Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(4), 1967-1971 21 Biology, edited by Virginie Orgogozo and Matthew V Rockman Humana Press p 157–78 62 22 Bolger, AM, Lohse, M & Usadel, B 2014, ‘Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data’, Bioinformatics, vol 30, no 15, pp 2114-2120 23 Cambell, I C., 2012 Biodiversity of the Mekong Delta The Mekong Delta System, Part of the series Springer Environmental Science and Engineering pp 293-313 24 Chong, Z., Ruan, J., & Wu, C.-I., 2012 Rainbow: an integrated tool for efficient clustering and assembling RAD-seq reads Bioinformatics (Oxford, England), 28(21), 2732–7 doi:10.1093/bioinformatics/bts482 25 Di Bangladesh, M S P S., Chaklader, M R., Siddik, M A B., & Nahar, A ,2015 Taxonomic diversity of paradise threadfin Polynemus paradiseus (Linnaeus, 1758) inhabiting southern coastal rivers in Bangladesh Sains Malaysiana, 44(9), 1241-1248 26 Danecek, P., Auton, A., Abecasis, G., Albers, C.A., Banks, E., DePristo, M.A., Handsaker, R.E., Lunter, G., Marth, G.T., Sherry, S.T., 2011 The variant call format and VCFtools Bioinformatics 27:2156–2158 DOI 10.1093/bioinformatics/btr330 27 Etter, P D., Susan B., Paul A H., EricA J., and WilliamA Cresko, 2011 SNP Discovery and Genotyping for Evolutionary Genetics Using RAD Sequencing in Molecular Methods for Evolutionary Genetics SE - 9, vol 772, Methods in Molecular 28 Elshire, R.T., Glaubitz, J C., Sun, Q., Poland, J A., Kawamoto, K., Buckler, E S and Mitchell, S E., 2011 A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species., PloS one, 6(5), P.e19379 29 EOE (2012), “Effect of climate change and land use change on saltwater intrusion”, http://www.eoearth.org/view/article/152361 30 Evanno, G, Regnaut, S & Goudet, J 2005, ‘Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study’, Mol Ecol, vol 14, pp 2611–2620 31 Frascaroli, E., Schrag, T A., Melchinger, A E., 2013 Genetic diversity analysis of lite European maize (Zea mays L.) inbred lines using AFLP, SSR and SNP markers reveals ascertainment bias for a subset of SNPs Theor Appl Genet., 126: 133-141 32 Fishbase, 2012/…/Ecosys/10617 63 33 Fu, L, Niu, B, Zhu, Z, Wu, S & Li, W 2012, ‘CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data’, Bioinformatics, vol 28, no 23, pp 3150–3152 doi: 10.1093/bioinformatics/bts565 34 Guryev, V., Berezikov, E., Cuppen, E., 2005 CASCAD: a database of candidate single nucleotide polymorphisms associated with expressed sequences BMC Genomics, 6: 10 doi:10.1186/1471-2164-6-10 35 Gouy, M., Guindon, S & Gascuel, O., 2010 SeaView version 4: a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building Molecular Biology and Evolution 27(2) : 221-224 36 Glenn, K.L., Grapes, L., Suwanasopee, T., Harris, D.L., Li, Y., Wilson, K., Rothschild, M.F., 2005 SNP analysis of AMY2 and CTSL genes in Litopenaeus vannamei and Penaeus monodon shrimp Animal Genetics 36, 235-236 37 Garrison, E & Marth, G 2012, ‘Haplotype-based variant detection from short-read sequencing’, arXiv preprint arXiv: 1207.3907 [q-bio.GN] 38 Hoegh-Guldberg, O., & Bruno, J F., 2010 The Impact of Climate Change on the World’s Marine Ecosystems Science (New York, N.Y.) 328 (5985), 1523–28 doi:10.1126/science.1189930 39 Huse, S M., Huber, J A., Morrison, H G., Sogin, M L andWelch, D M., 2007 Accuracy and quality of massively parallel DNA pyrpsequencing Gennome Biology, 8(7) 40 Ha, B K., Hussey, R S., Boerma, H R., 2007 Development of SNP assays for marker-assisted selection of two southern root-knot nematode resistance QTL in soybean Crop Sci., 47(2): S73-S82 41 Hurwood, D A., Adamson, E A S., & Mather, P B (2008) Evidence for strong genetic structure in a regionally important, highly vagile cyprinid (Henicorhynchus lobatus) in the Mekong River Basin Ecology of Freshwater Fish, 17(2), 273-283 42 Hortle, K G & Bush, S.R.,2003 Consumption in the Lower Mekong Basin as measure of fish yield pp 76-82 in Clayton T (ed.) New Approaches for the Improvement of Inland Capture Fishery Statistics in the Mekong Basin FAO, MRC, Govt of Thái Lan and Govt of the Netherlands RAP Publication 2003/1 64 43 Iranawati, F (2014) An assessment of the geographical scale of recurrent gene flow in wild populations of two species of Mekong River carps (Henicorhynchus spp.) (Doctoral dissertation, Queensland University of Technology) 44 Jakse, J., Martin, W., McCallum, J., Havey, M., 2005 Single nucleotide polymorphisms, InDel, and simple sequence repeats for onion cultivar identification J Amer Hort Sci., 130(6): 912-917 45 Kaur, S., Cogan, N O I., Forster, J W., Paull, J G., 2014 Assessment of genetic diversity in Faba bean based on single nucleotide polymorphism Diversity, 6: 88-101; doi:10.3390/d6010088 46 Kuipers, O P., P G G A., de Ruyter, M Kleerebezem, and W M de Vos., 1997 Controlled overproduction of proteins by lactic acid bacteria Trends Biotechnol 15:135–140 47 Kim, K S., Bellendir, S., Hudson K A., Hill, C.B., Hartman, G.L., Hyten, D.L., Hudson, M.E., Diers, B.W., 2010 Fine mapping the soybean aphidresistance gene Rag1 in soybean Theor Appl Genet., 120(5): 1063-1107 48 Liu, L., Li, Y., Li, S., Hu, N., He, Y., Pong, R., & Law, M., 2012 Comparision of Next-Generation Sequencing Systems Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012 49 Liu, Z., 2007 Single nucleotide polymorphism (SNP) In: Liu, Z (Ed.), Aquaculture Genome Technologies Blackwell, USA, pp 59-72 50 Li, H., & Durbin, R., 2009 Fast and accurate short read alignment with BurrowsWheeler transform Bioinformatics (Oxford, England), 25(14), 1754–60 doi:10.1093/bioinformatics/btp324 51 Motomura, H., 2004 Family Polynemus Rafinesque 1815 - threadfins Annotated checklists of fishes No.32 CaliforniaAcademy of Sciences, San Francisco 18 pp 52 Motomura, H., Kullander, T., Yoshino and Iwatsuki, Y., 2002 Review of sevenspined Polynemus species (Perciformes: Polynemidae) with designation of a neotype for Polynemus paradiseus Linnaeus, 1758 Ichthyol Res 49(4):307-317 (Ref 31582) 53 Motomura, H., 2004 Threadfins of the world (family Polynemidae) an annotated and illustrated catalogue of Polynemid species known to date FAO species catalogue 65 for fishery purposes No.3 Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) Rome 117 pp 54 Mardis, E.R., 2008 Next-generation DNA sequencing methods Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402 55 Margulies, M., Egholm, M., Altman, W E., Attiya, S., Bader, J S., Bemben, L A., & Dewell, S B., 2005 Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors Nature, 437(7057), 376-380 56 MRC, 2010 State of the Basin Report 2010 57 Meimans, P G and Van T P H., 2004 Genotype and Genodive: two programs for the analysis of genetic Diversity of Asexual Organisms Molecular Ecology Notes 58 Miller, T P., Gu, Z.J., Li, Q., Hillier, L., Kwok, P.Y., 1998 Overlapping genomic sequences: A treasure trove of single-nucleotide polymorphisms Genome Res 1998;8, pp 748–754 59 Miller, T L and Cribb, T H., 2007 Phylogenetic relationships of some common Indo-Pacific snappers (Perciformes: Lutjanidae) based on mitochondrial DNA sequences, with comments on the taxonomic position of the Caesioninae Molecular Phylogenetics and Evolution, 44(1), 450-460 60 Morozova, O., Marco, A M., 2008 Application of next-generation sequencing technologies in functional genomics Genetic 92 (5), pp 255-264 61 Nelson, J S., Grande, T C., & Wilson, M V (1994) Fishes of the World 62 Nyrén Pål, 2007 “The History of Pyrosequencing.” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 373(3):1–14 63 Ngamsiri, T., Nakajima, M., Sukmanomon, S., Sukumasavin, N., Kamonrat, W., NA-NAKORN, U., & Taniguchi, N (2007) Genetic diversity of wild Mekong giant catfish Pangasianodon gigas collected from Thailand and Cambodia Fisheries Science, 73(4), 792-799 64 Nguyen, T T T., & Sunnucks, P (2012) Strong population genetic structure and its management implications in the mud carp Cirrhinus molitorella, an indigenous freshwater species subject to an aquaculture and culture-based fishery Journal of fish biology, 80(3), 651-668 66 65 Nguyen, N T T., & Duong, T Y (2016) Morphological and genetic differences between cultured and wild populations of Channa striata in Viet Nam and its phylogenetic relationship with other Channa species Songklanakarin Journal of Science & Technology, 38(4) 66 Peterson, B.K., Weber, J.N., Kay, E.H., Fisher, H.S., Hoekstra, H.E., 2012 Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species PLoS ONE 7(5): e37135 doi:10.1371/journal.pone.0037135 67 Poland, A J., Brown P J., Sorrells, M E., Jannink, J.L., 2012 Development of High-Density Genetic Maps for Barley and Wheat Using a Novel Two-Enzyme Genotyping-by-Sequencing Approach PloS one 7(2):e32253 68 Poehlmann, A., Kuester, D., Meyer, F., Lippert, H., Roessner, A., & SchneiderStock, R., 2007 K-ras mutation detection in colorectal cancer using the Pyrosequencing technique Pathology-Research and Practice, 203(7), 489-497 69 Poulsen, AF, Valbo-Jorgensen, J, Chan, S, Chhuon, CK, Hortle, KG, Bouakhamvongsa, K, Viravong, S, Suntornratana, U, Yoorong, N, Tran, QB & Nguyen, TT 2005, Distribution and ecology of some important river fish species of the Mekong River Basin, Mekong River Basin Technical Paper, Vientiane, 120 pp 70 Pritchard, J K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000 Inference of population structure using multilocus genotype data Genetics 2000 Jun;155(2), pp 945-59 71 Pearse-Smith, S W D., 2012 The impact of continued Mekong Basin hydropower development on local livelihoods Consilience: The Journal of Sustainable Development, 7(1), 73-86 72 Peakall, R & Smouse, PE 2012, ‘GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel Population genetic software for teaching and research-an update’, Bioinformatics, vol 28, pp 2537-2539 73 Raman, H., Dalton-Morgan, J., Diffey, S., Raman, R., Alamery, S., Edwards, D., & Batley, J., 2014 SNP markers-based map construction and genome-wide linkage analysis in Brassica napus Plant biotechnology journal, 12(7), 851-860 67 74 Rainboth W J., 1996 Fishes of the Cambodian Mekong, Food and Agriculture of Organization of the United Nations, Rome, p 55-265 75 Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlén, M., & Nyrén, P., 1996 Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release Analytical biochemistry, 242(1), 84-89 76 Ronaghi, M., Uhlén, M., & Nyren, P (1998) A sequencing method based on realtime pyrophosphate Science, 281(5375), 363 77 Rainboth, W.J., 1996 Fishes of the Cambodian Mekong FAO Species Identification Field Guide for Fishery Purposes FAO, Rome 265pp 78 Rusk, N., 2011 Torrents of sequence Nat Meth 8(1): 44-44 79 Sachidanandam, R., Weissman, D., Schmidt, S C., Kakol, J M., Stein, L D., Marth, G., & Hunt, S E., 2001 A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms Nature, 409(6822), 928-933 80 Taillon-Miller, P., Gu, Z., Li, Q., Hillier, L., & Kwok, P Y., 1998 Overlapping genomic sequences: a treasure trove of single-nucleotide polymorphisms Genome Research, 8(7), 748-754 81 Tao, W.J., Boulding, E.G., 2003 Associations between single nucleotide polymorphisms in candidate genes and growth rate in Arctic charr (Salvelinus alpinus L.) Heredity 91, 60-69 82 Stone, R., 2011 "Mayhem on the Mekong." Science 333.6044 (2011): 814-818 83 Suh Y., Vijg J., 2005 SNP discovery in associating genetic variation with human disease phenotypes Mutat Res., 573: 41- 53 84 Schuster, S.C.,2008 Next-generation sequencing transforms today s biology Nat Methods (1): 16–8 85 Syvitski, J P., Kettner, A J., Overeem, I., Hutton, E W., Hannon, M T., Brakenridge, G R., & Nicholls, R J., 2009 Sinking deltas due to human activities Nature Geoscience, 2(10), pp 681-686 86 So, N., Maes, G E., & Volckaert, F A M (2006) High genetic diversity in cryptic populations of the migratory sutchi catfish Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong River Heredity, 96(2), 166 68 87 Tengs, T., LaFramboise, T., Den, R.B., Hayes, D N., 2004 Genemic representation using concatenates of Type IIB restriction endonuclease digestion fragments Nucleic acids research, 32(15): Art No 88 Twyman R M., 2004 SNP discovery and typing technologies for pharmacogenomics Curr Top Med Chem., 4: 1423-1431 89 Toonen, R J., Puritz, J B., Forsman, Z H., Whitney, J L., Fernandez-Silva, I., Andrews, K R., & Bird, C E., 2013 ezRAD: a simplified method for genomic genotyping in non-model organisms PeerJ, 1, e203 90 Valouev, A., Ichikawa, J., Tonthat, T., Stuart, J., Ranade, S., Peckham, H., & Sidow, A., 2008 A high-resolution, nucleosome position map of C elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning Genome research, 18(7), 1051-1063 91 Wang, S., Meyer, E., McKay, J K., & Matz, M V., 2012 2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping Nature methods, 9(8), 808-810 92 Wu, X., Li, Y., Shi, Y., Song, Y., Wang, T., Huang, Y., & Li, Y., 2014 Fine genetic characterization of elite maize germplasm using high-throughput SNP genotyping Theoretical and applied genetics, 127(3), 621 93 Wang, Z., Gerstein, M., & Snyder, M., 2009 RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics Nature reviews genetics, 10 (1), 57-63 94 Xu, Y.X., Zhu, Z.Y., Lo, L.C., Wang, C.M., Lin, G., Feng, F., Yue, G.H., 2006 Characterization of two parvalbumin genes and their association with growth traits in Asian seabass (Lates calcarifer) Animal Genetics 37, 266-268 95 Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T V D., Hornes, M., & Zabeau, M., 1995 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting Nucleic acids research, 23(21), 4407-4414 96 Zabeau, M., and P Vos 1993 Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting European Patent Office Publication 534 858 A1 bulletin 93/13 69 PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN BẰNG KIT QIAGEN Lấy 25mg mẫu mô cá phèn vàng cho vào tuýp 1,5 ml Cho thêm 180 µl đệm ATP 20 µl dung dịch Proteinase K vào tuýp 1,5 ml bước Trộn Vortex 15 giây Ủ ấm 560C đến mẫu tan, trộn Vortex 15 giây Cho thêm 200 µl Bufer AL, trộn Vortex Cho thêm 200 µl cồn tuyệt đối vào mẫu, sau Vortex 15 giây Cho toàn phần dung dịch từ bước vào cột QIAamp Mini Spin tránh làm dung dịch dính lên nắp Đóng nắp tp, ly tâm 8.000 vòng/ phút Đặt cột tuýp 2ml mới, bỏ tuýp có chứa phần dịch lọc Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini Spin, cho thêm 500 µl dung dịch đệm AW1 Đóng nắp tp, ly tâm 8.000 vòng/ phút Đặt cột vào tuýp 2ml mới, bỏ tuýp có chứa dung dịch lọc Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini Spin, cho thêm 500 µl dung dịch đệm AW2 Đóng nắp tp, ly tâm 13.000 vòng/4 phút Loại bỏ dịch chuyển cột lọc sang 1,5ml (khơng có sẵn) 10 Thêm 50 µl dung dịch đệm AE Đóng nắp để nhiêt độ phòng phút Ly tâm 8.000 vịng/1 phút Thu 100 µl DNA, bảo quản -200C PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐO HÀM LƯỢNG DNA BẰNG MÁY ĐO QUBIT 2.0 Bước 1:Chuẩn bị tuýp 0,5 ml cho ống tiêu chuẩn mẫu cần đo hàm lượng DNA Bước 2: Pha dung dịchQubitTM working solution theo tỉ lệ QubitTM dsDNA HG Reagent 1:200 QubitTM dsDNA HS Buffer Bước 3: Thêm190 µl of QubitTM working solution cho tupe chuẩn bị cho mẫu chuẩn Bước 4: thêm 10 µl dung dịch chuẩn QubitTM 1,2 cho tuýp riêng biệt, sau trộn 2-3 giây, cẩn thận tránh tạo bọt Bước 5: Thêm QubitTM working solution cho tuýp sử dụng để đo nồng độ DNA mẫu, thể tích 200µl Bước 6: Thêm mẫu vào tuýp có dung dịch QubitTM working solution chuẩn bị trước đó, với thể tích dao đọng - 20µl, trộn 2-3 giây Bước 7: Đặt nhiệt độ phòng phút Bước 8: Cài đặt máy đo Qubit 2.0 cách chọn DNA, sau ấn chọn dsDNA high Sensitivity Ở hình chính, chọn Yes No để tiến hành xác định đường chuẩn Bước 9: Thiết lập đường chuẩn - Đặt tuýp có chứa dung dịch chuẩn vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tuýp - Đặt tuýp có chứa dung dịch chuẩn vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tuýp Bước 10: Đặt tuýp chứa mẫu vào để đo Bước 11: Xác định nồng độ DNA công thức Nồng độ DNA = QF value x 200/A Trong đó: QF value: Giá trị hiển thị máy Qubit A thể tích DNA cho vào ban đầu PHỤ LỤC ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% (Invitrogen, Mỹ) nhuộm với Ethidium Bromide - Chuẩn bị gel agarose 1,5% : Cân 0,68 g agarose cho vào 40mL đệm TBX 1X chứa bình tam giác 100 mL, đun sơi lị vi sóng gel tan hoàn toàn Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 700C chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai Thêm 1,5 µL Ethidium bromide, lắc nhẹ tránh tạo bọt trộn Ethidium bromide vào gel (hóa chất độc hại cần tuyệt đối cẩn thận thao tác) Đổ gel khuôn lắp sẵn lược (lược giếng 15 giếng) Khi gel nguội hồn tồn đơng cứng lại, rút nhẹ lược theo phương thẳng đứng để tránh rách giếng - Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di thêm đệm TBE 1X ngập gel Dùng micropipette mix µL mẫu với µL loading dye 6X, load vào giếng gel Hút µL DNA Ladder (thang DNA) vào giếng Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 500A 20 phút - Đọc kết quả: Sau chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator xem band DNA tia cực tím Thư viện DNA tạo từ phương pháp EzRAD có dải kích thước từ 350-550bp, kích thước adapter chèn vào 120bp trình tự trung bình mẫu 380bp Thư viện DNA bảo quản từ -200C đến -800C PHỤ LỤC MẪU VÀ NỒNG ĐỘ DNA TƯƠNG ỨNG CỦA TỪNG CÁ THỂ CÁ PHÈN VÀNG An Giang Tênmẫu Nồngđộ (ng/µl) AG1 5.67 AG2 7.80 AG3 3.60 AG4 11.25 AG5 4.97 AG6 5.48 AG7 10.08 AG8 7.40 AG9 5.15 AG10 12.03 AG11 15.06 AG12 5.04 AG13 6.95 AG14 7.77 AG15 15.04 AG16 11.08 AG17 5.67 AG18 3.95 AG19 8.90 AG20 9.56 AG21 12.03 AG22 6.78 AG23 8.75 AG24 11.09 AG25 12.30 AG26 6.28 AG27 4.60 AG28 10.10 AG29 8.97 AG30 8.90 AG31 9.56 AG32 8.90 ĐồngTháp Tênmẫu Nồngđộ (ng/µl) ĐT1 7.75 ĐT2 5.36 ĐT3 5.65 ĐT4 8.34 ĐT5 9.15 ĐT 11.23 ĐT 6.40 ĐT8 10.05 ĐT9 12.85 ĐT10 7.85 ĐT11 13.06 ĐT12 6.08 ĐT13 5.90 ĐT14 3.67 ĐT15 7.85 ĐT16 5.56 ĐT17 4.50 ĐT18 4.36 ĐT19 5.05 ĐT20 11.07 ĐT21 5.89 ĐT22 8.06 ĐT23 15.60 ĐT24 6.65 ĐT25 5.60 ĐT26 7.85 ĐT27 5.89 ĐT28 8.06 ĐT29 5.90 ĐT30 3.67 ĐT31 13.06 ĐT32 6.08 Bến Tre Tênmẫu Nồngđộ (ng/µl) BT1 3.82 BT2 2.58 BT3 4.82 BT 6.52 BT 5.52 BT 3.75 BT 4.02 BT 3.96 BT 2.48 BT10 5.52 BT11 5.21 BT12 8.09 BT13 5.04 BT14 3.69 BT15 3.52 BT16 8.08 BT17 2.34 BT18 1.90 BT19 5.88 BT20 5.65 BT21 4.50 BT22 5.22 BT23 2.56 BT24 3.70 BT25 3.40 BT26 2.51 BT27 6.74 BT28 6.02 BT29 5.29 BT30 4.97 BT31 4.25 BT32 3.46 BT33 6.80 Trà Vinh Tênmẫu Nồngđộ (ng/µl) TV1 7.28 TV2 13.18 TV3 6.90 TV4 10.05 TV5 9.48 TV6 14.4 TV7 3.67 TV8 18.04 TV9 6.72 TV10 3.60 TV11 7.32 TV12 19.4 TV13 22.4 TV14 17.52 TV15 19.0 TV16 3.18 TV17 7.76 TV18 16.2 TV19 9.64 TV20 22.32 TV21 7.96 TV22 16.02 TV23 8.88 TV24 3.90 TV25 3.84 TV26 10.3 TV27 4.40 TV28 12.5 TV29 6.25 TV30 11.2 TV31 6.25 TV32 5.70 TV33 13.6 PHỤ LỤC BẢNG ADAPTER ĐƯỢC GẮN CHO TỪNG CÁ THỂ Quần thể An Giang Quần thể Đồng Tháp AG1 AGCGATAG-TATAGCCT ĐT1 ATTCAGAA-TATAGCCT AG2 AGCGATAG-ATAGAGGC ĐT2 ATTCAGAA-ATAGAGGC AG3 AGCGATAG-CCTATCCT ĐT3 ATTCAGAA-CCTATCCT AG4 AGCGATAG-GGCTCTGA ĐT4 GAGATTCC-TATAGCCT AG5 TCCGCGAA-AGGCGAAG ĐT5 ATTCAGAA-AGGCGAAG AG6 AGCGATAG-AGGCGAAG ĐT ATTCAGAA-TAATCTTA AG7 GAGATTCC-TAATCTTA ĐT TCCGCGAA-AGGCGAAG AG8 TCCGCGAA-TAATCTTA ĐT8 ATTCAGAA-CAGGACGT AG9 CGGCTATG-AGGCGAAG ĐT9 ATTCAGAA-GTACTGAC AG10 CGGCTATG-TAATCTTA ĐT10 TCCGCGAA-TATAGCCT AG11 CGGCTATG-GTACTGAC ĐT11 GAGATTCC-TATAGCCT AG12 AGCGATAG-TAATCTTA ĐT12 GAGATTCC-GGCTCTGA AG13 TAATGCGC-GTACTGAC ĐT13 TCCGCGAA-ATAGAGGC AG14 CTGAAGCT-GTACTGAC ĐT14 TCTCGCGC-AGGCGAAG AG15 GAGATTCC-GGCTCTGA ĐT15 TCTCGCGC-TAATCTTA AG16 AGCGATAG-CAGGACGT ĐT16 TCCGCGAA-CCTATCCT AG17 GAGATTCC-AGGCGAAG ĐT17 TCCGCGAA-GGCTCTGA AG18 GAGATTCC-CAGGACGT ĐT18 AGCGATAG-ATAGAGGC AG19 GAGATTCC-GTACTGAC ĐT19 TCCGCGAA-TAATCTTA AG20 CGGCTATG-CAGGACGT ĐT20 TAATGCGC-CCTATCCT AG21 GAATTCGT-TATAGCCT ĐT21 CGGCTATG-TATAGCCT AG22 CTGAAGCT-TATAGCCT ĐT22 TAATGCGC-TATAGCCT AG23 GAATTCGT-ATAGAGGC ĐT23 GAGATTCC-ATAGAGGC AG24 GAATTCGT-CCTATCCT ĐT24 TCTCGCGC-CAGGACGT AG25 GAATTCGT-GGCTCTGA ĐT25 TCTCGCGC-GTACTGAC AG26 GAATTCGT-AGGCGAAG ĐT26 ATTCAGAA-TAATCTTA AG27 GAATTCGT-TAATCTTA ĐT27 TCCGCGAA-AGGCGAAG AG28 GAATTCGT-CAGGACGT ĐT28 ATTCAGAA-CAGGACGT AG29 GAATTCGT-GTACTGAC ĐT29 TCTCGCGC-GTACTGAC AG30 GAATTCGT-ATAGAGGT ĐT30 ATTCAGAA-TAATCTTA Quần thể Bến Tre Quần thể Trà Vinh BT1 ATTCAGAA-GTACTGAC TV1 TCTCGCGC-CAGGACGT BT2 ATTCAGAA-CAGGACGT TV2 AGCGATAG-GTACTGAC BT3 ATTCAGAA-TAATCTTA TV3 GAGATTCC-AGGCGAAG BT AGCGATAG-AGGCGAAG TV4 TCTCGCGC-GTACTGAC BT ATTCAGAA-AGGCGAAG TV5 CGCTCATT-TATAGCCT BT ATTACTCG-ATAGAGGC TV6 TCTCGCGC-TAATCTTA BT ATTCAGAA-GGCTCTGA TV7 TCTCGCGC-AGGCGAAG BT ATTCAGAA-CCTATCCT TV8 GAATTCGT-CAGGACGT BT ATTCAGAA-ATAGAGGC TV9 CGCTCATT-ATAGAGGC BT10 ATTCAGAA-TATAGCCT TV10 CGCTCATT-CCTATCCT BT11 ATTACTCG-CCTATCCT TV11 CGCTCATT-GGCTCTGA BT12 AGCGATAG-TAATCTTA TV12 CGCTCATT-AGGCGAAG BT13 AGCGATAG-GTACTGAC TV13 CGCTCATT-TAATCTTA BT14 AGCGATAG-CAGGACGT TV14 GAGATTCC-TAATCTTA BT15 CGGCTATG-TATAGCCT TV15 GAGATTCC-CAGGACGT BT16 CGGCTATG-ATAGAGGC TV16 GAGATTCC-GTACTGAC BT17 AGCGATAG-CAGGACGT TV17 GAATTCGT-TATAGCCT BT18 ATTCAGAA-TAATCTTA TV18 GAATTCGT-ATAGAGGC BT19 CGGCTATG-GGCTCTGA TV19 GAATTCGT-CCTATCCT BT20 CGGCTATG-AGGCGAAG TV20 GAATTCGT-GGCTCTGA BT21 CGGCTATG-TAATCTTA TV21 GAATTCGT-AGGCGAAG BT22 ATTCAGAA-CAGGACGT TV22 GAATTCGT-TAATCTTA BT23 CGGCTATG-GTACTGAC TV23 CGCTCATT-CAGGACGT BT24 TCTCGCGC-CCTATCCT TV24 CGCTCATT-GTACTGAC BT25 TCTCGCGC-GGCTCTGA TV25 ATTACTCG-TATAGCCT BT26 ATTCAGAA-TATAGCCT TV26 ATTACTCG-AGGCGAAG BT27 AGCGATAG-TATAGCCT TV27 ATTACTCG-TAATCTTA BT28 ATTCAGAA-ATAGAGGC TV28 ATTACTCG-CAGGACGT BT29 AGCGATAG-GGCTCTGA TV29 ATTACTCG-GTACTGAC BT30 AGCGATAG-AGGCGAAG TV30 GAGATTCC-GGCTCTGA BT31 ATTCAGAA-CCTATCCT TV31 GAGATTCC-AGGCGAAG BT32 ATTCAGAA-GGCTCTGA TV32 ATTCAGAA-GGCTCTGA BT33 ATTCAGAA-AGGCGAAG TV33 ATTCAGAA-AGGCGAAG ... Bảng 3.3 Các thông số đa dạng di truyền quần thể cá phèn vàng dựa thị SNP 52 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền quần thể cá phèn ĐBSCL 53 Bảng 3.5 Kết phân nhóm quần thể cá phèn (k=3)... điểm hình thái phân loại cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 46 3.2 Nghiên cứu di truyền cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) 46 3.2.1 Tách DNA... Tơi xin cam đoan luận văn: ? ?Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) Đồng Sông Cửu Long? ?? Là cơng trình nghiên cứu thực cá nhân hướng dẫn TS.Đặng