Nghiên cứu đa hình di truyền gen CATHL4 mã hóa peptide kháng khuẩn nhóm cathelicidin ở bò vàng bản địa việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ THỊ TƢƠI NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM CATHELICIDIN Ở BÒ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ THỊ TƢƠI NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM CATHELICIDIN Ở BỊ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 8420201.22 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2021 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân – Trƣởng Bộ môn Di truyền học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ngƣời ln tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thiện đề tài Tơi xin trân trọng cảm ơn ThS Trần Thị Thùy Anh – Nghiên cứu viên Bộ môn Di truyền học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu hỗ trợ phƣơng diện q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, học viên cao học Bộ môn Di truyền học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học Phòng chức trực thuộc trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho mơi trƣờng học tập, nghiên cứu để hồn thành tốt chƣơng trình học Cao học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời ln bên chăm sóc, động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 29 tháng 01 năm 2021 Học viên cao học Đỗ Thị Tƣơi Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cathelicidin 1.1.1 Nguồn gốc phát sinh tổ chức hệ gen cathelicidin động vật có vú .3 1.1.2 Cấu trúc hoạt tính chức cathelicidin .4 1.1.3 Cơ chế tác động miễn dịch cathelicidin động vật có vú .7 1.2 Họ gen CATHL tình hình nghiên cứu đa hình di truyền CATHL4 gia súc .11 1.2.1 Tính đa dạng họ gen CATHL trâu bò 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu gen CATHL4 13 1.3 Bò vàng Việt Nam tiềm phân hóa di truyền mở rộng gen CATHL4 15 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Mẫu DNA tổng số 17 2.1.2 Mồi 17 2.3.3 Hóa chất 18 2.3.4 Thiết bị 18 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.5.1 Định hƣớng thiết kế nghiên cứu 19 2.5.2 Phƣơng pháp khuếch đại gen CATHL4 21 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi 2.5.3 Phƣơng pháp phân tích trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR .22 2.5.4 Phƣơng pháp tách dòng gen CATHL4 22 2.5.5 Phƣơng pháp phân tích đa hình exon – CATHL4 dựa kỹ thuật phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (single strand conformation polymorphism – SSCP) 24 2.5.6 Phƣơng pháp phân tích đa hình trình tự gen CATHL4 từ dịng plasmid phân tích 26 2.5.7 Xác định số gen CATHL4 phƣơng pháp Real time PCR 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Khuếch đại tinh gen CATHL4 .29 3.2 Kết phân tích trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR 29 3.3 Tách dòng gen CATHL4 sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp 30 3.4 Phân tích đa hình sợi đơn SSCP vùng exon gen CATHL4 .32 3.5 Kết phân tích đa hình trình tự gen CATHL4 tách dịng .33 3.6 Kết phân tích đa hình số gen CATHL4 có hệ gen bò vàng Việt Nam 36 3.6.1 Xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng số gen CATHL4 .36 3.6.2 Kết xác định đa hình số gen CATHL4 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 KẾT LUẬN .42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 50 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ chế phân tử đƣợc đề xuất nguồn gốc cathelicidin từ cystatin Hình 2: Mơ hình cấu trúc hình thành cathelicidin có hoạt tính chức .5 Hình 3: So sánh trình tự peptide kháng khuẩn phân tử protein CATHL tiền thân bò với lồi động vật có vú khác Hình 4: Vai trị, chức cathelicidin động vật có vú .7 Hình 5: Cơ chế hoạt động cathelicidin Hình 6: Ức chế hoạt hóa TLR qua trung gian nội độc tố cathelicidin Hình 7: Cathelicidin (LL-37) tác động ảnh hƣởng đến biệt hóa tế bào kích thích hình thành chemokine định hƣớng tế bào thu hút, thúc đẩy tăng sinh tế bào B 10 Hình 8: So sánh vùng trình tự axitamin biến đổi từ 12 biến thể phát sinh gen CATHL4 trâu 14 Hình 9: Kết PCR khuếch đại gen CATHL4 29 Hình 10: Kết giải trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR đoạn trình tự gen CATHL4 30 Hình 11 Khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector pJET1.2 mang gen CATHL4 vào tế bào E coli môi trƣờng LB ampicilin 31 Hình 12 Kết PCR sàng lọc khuẩn lạc với mồi pJET1.2 31 Hình 13 Kết chạy điện di SSCP gel polyacrylamide .32 Hình 14: Kết PCR xác định tính xác chiều gắn đoạn gen CATHL4 chèn vector pJET1.2 33 Hình 15: Trình tự xác định dự đốn cấu trúc peptide cathelicidin-4 .35 Hình 16: Kết điện di sản phẩn qPCR đƣờng cong nóng chảy gen CATHL4 GAPDH 37 Hình 17: Đƣờng cong khuếch đại đƣờng chuẩn định lƣợng tuyệt đối qRT- PCR 38 Hình 18: Số lƣợng trung bình gen CATHL4 DNA hệ gen bị vàng vùng địa lý Việt Nam 39 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại cấu trúc, chức vị trí biểu gen CATHL xác định bò (Bos taurus) 12 Bảng 2: Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu xác định đa hình CATHL4 bò vàng 17 Bảng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen CATHL4 21 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen CATHL4 21 Bảng Thành phần phản ứng nối 22 Bảng Thành phần phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc 23 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc 23 Bảng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn exon - CATHL4 25 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn exon - CATHL4 25 Bảng 10: Thành phần hóa chất gel polyacrylamide 12%, 0.5X TBE .26 Bảng 11 Thành phần phản ứng Real-Time PCR định lƣợng số gen CATHL4 27 Bảng 12 Chu trình nhiệt phản ứng Real-Time PCR định lƣợng số gen CATHL4 27 Bảng 13: Thống kê đa hình SNP, indel vùng exon gen CATHL4 34 Bảng 14: Kết xác định số gen CATHL4 quần thể bò vàng Việt Nam 39 Bảng 15: Số gen CATHL4 xác định đƣợc cá thể bò vàng Việt Nam 40 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AMP Antimicrobial peptide Peptide kháng khuẩn AMD Antimicrobial domain Miền kháng khuẩn Amp Ampicillin (Kháng sinh) Ampicilin APCs Antigen-presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên APS Ammonium persulphate Amoni persulfate Apolipoprotein L3 Apolipoprotein L3 Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat APOL3 ATP BMAP Bp BTA22 Bovine myeloid antimicrobial Peptide kháng khuẩn dòng tủy peptide bò Base pair Cặp bazơ Bos taurus chromosome 22 Nhiễm sắc thể số 22 Bos taurus CATHL Cathelicidin Cathelicidin cDNA Complementary DNA DNA bổ sung CNV Copy number variation Biến đổi số Cộng Cs Ct CXCL13 Cycle Threshold Chu kỳ ngƣỡng C-X-C Motif Chemokine Ligand Phối tử chemokine 13 13 Dendritic cell Tế bào đuôi gai Deoxyribose Nucleic Acid Axit deoxyribose nucleic ddH2O Deionized distilled H2O Nƣớc cất khử ion dNTP Deoxyribonucleoside Deoxyribonucleosit triphotphat DC DNA triphosphate EDTA EtBr Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etylendiamintetraaxetic Ethidium bromide Ethidium bromide Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Ethanol Cồn Fatty acid binding protein Protein liên kết với axit béo Follicular dendritic cell Tế bào đuôi gai FPRL1 Formyl peptide receptor Thụ thể peptide formyl GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase dehydrogenase IL-6 Interleukin Interleukin Kb Kilo base Kilo base LB Luria Bertani Luria Bertani LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide LTA Lipoteichoic acid Axit lipoteichoic mRNA Messenger RNA RNA thông tin Milimol / Lit Milimol lít Mililit Mililit ng / µl Nanogram / Microlit Nanogam Microlit nsSNP Nonsynonymous EtOH FABP2 fDC mM ml single Đa hình nucleotide đơn sai nghĩa nucleotide polymorphism OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PG / NPG pg qRT-PCR Prognostic gene / non- Gen tiên lƣợng / Gen không tiên prognostic gene lƣợng Picogram Picogam Quantitative real time Phản ứng chuỗi polymerase định polymerase chain reaction lƣợng thời gian thực RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic SDS Sodium dodecylsulphate Natri dodecyl sulfat SEM Standard error of the mean Sai số chuẩn trị số trung bình Luận văn Thạc sĩ ssDNA SSCP Đỗ Thị Tươi Single-stranded DNA Single-strand DNA sợi đơn Conformation Đa hình cấu trúc sợi đơn Polymorphism Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris-Borate-EDTA Tris-Borate-EDTA TEDMED N, N, N’, N’- Tetramethyl- N, N, N’, N’- TetramethylEthylenediamine Ethylenediamine TLR Toll-like receptor Thụ thể giống toll TNFa Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u SYBR Asymmetrical cyanine dye Thuốc nhuộm asymmetrical cyanine U µg / l µl Enzyme unit (μmol/min) Đơn vị enzyme (μmol/min) Microgram / Lit Microgam / lít Microlit Microlit Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Hình 16: Kết điện di sản phẩn qPCR đường cong nóng chảy gen CATHL4 (A,C) GAPDH (B, D) Kí hiệu: C1 – C11 sản phẩm qPCR gen CATHL4; C12 mẫu đối chứng âm (không chứa khuôn DNA); G1 – G11 sản phẩm qPCR gen GAPDH; G12 mẫu đối chứng âm; M: ladder DNA 100 bp; Gen CATHL4 GADPH có nhiệt độ nóng chảy ổn định 76.6 oC 82.92 oC Plasmid tái tổ hợp đƣợc pha loãng gấp mƣời lần cho gen GAPDH CATHL4 với nồng độ từ 107 đến 104 sao/μL để tạo đƣờng cong chuẩn cho phân tích định lƣợng Nồng độ log DNA plasmid đƣợc vẽ dựa giá trị Ct đo đƣợc (Hình 17A, B) Giá trị Slope thu đƣợc từ đƣờng chuẩn lần chạy nằm khoảng -3,66 đến - 3.30, cho hiệu suất phản ứng đạt 88 – 101% Hệ số tƣơng quan đƣờng cong chuẩn xấp xỉ 0,99 gen nội chuẩn GADPH gen CATHL4 Điều cho thấy sản phẩm đƣợc khuếch đại điều kiện tối ƣu tính đặc hiệu mồi thiết kế, nồng độ, thành phần phản ứng giảm thiểu tối đa lỗi trình thao tác Hàm lƣợng sản phẩm gen CATHL4 tăng lên q trình khuếch đại cho thấy có khác rõ rệt giá trị Ct quần thể bị khác (Hình 17C) Kết chứng tỏ số gen CATHL4 có mẫu DNA tổng số cá thể bò đa dạng 37 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Hình 17: Đường cong khuếch đại đường chuẩn định lượng tuyệt đối qRTPCR (A), (B) Đường chuẩn gen GAPDH CATHL4 (C) Đường cong biểu thị mức độ khuếch đại gen CATHL4 mẫu bò vùng khác 3.6.2 Kết xác định đa hình số gen CATHL4 Số tuyệt đối gen CATHL4 quần thể bò vàng đƣợc xác định từ phƣơng trình tuyến tính đƣờng chuẩn tƣơng ứng, đƣợc chuyển đổi giá trị log10 đƣợc chuẩn hóa gen tham chiếu GADPH Số thu đƣợc hệ gen cá thể giá trị trung bình ± S.E.M thu đƣợc phân tích qRT-PCR mẫu cá thể thuộc quần thể bò vàng Phú Yên, Hà Giang, Thanh Hóa Nghệ An 38 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Bảng 14: Kết xác định số gen CATHL4 quần thể bò vàng Việt Nam Quần thể/Vùng địa lý Số mẫu Số chuẩn hóa (Mean ± SEM) Số cao Phú Yên 2.89 ± 0.006 5.30 Hà Giang 2.56 ± 0.011 6.69 Thanh Hóa 2.53 ± 0.002 3.61 Nghệ An 2.84 ± 0.002 3.60 Hình 18: Số lượng trung bình gen CATHL4 DNA hệ gen bò vàng vùng địa lý Việt Nam Số tuyệt đối gen CATHL4 xác định sử dụng GADPH làm gen tham chiếu Các hiển thị ý nghĩa cho sai số chuẩn giá trị trung bình (± SEM) Kết định lƣợng gen CATHL4 từ quần thể bò vàng với 16 cá thể cho thấy số lƣợng trung bình thể tính tƣơng đồng di truyền quần thể Số ƣớc tính đƣợc dao động khoảng 2,53 – 2,89 sao/quần thể (Bảng 14, Hình 18) Tuy nhiên, xét cá thể riêng biệt, số lƣợng gen CATHL4 xuất cao hệ gen có khác biệt cá thể (khoảng – 6.69 sao/cá thể bò vàng, Bảng 15) So với kết phát đƣợc - kiểu sai khác cấu hình sợi đơn, quần thể bò Phú Yên, Hà Giang, Thanh Hóa Nghệ An thể độ nhân lặp cao, với số gen CATHL4 nhiều ƣớc tính đƣợc lần lƣợt 5.30; 6.69; 3.61 3.60 (Bảng 14) So với giống BosTau7 đƣợc xác định có gen CATHL4 xuất hệ gen [53] bị vàng Việt Nam 39 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi có 50% số cá thể đƣợc xác định mang nhiều gen CATHL4 (Bảng 15) Tuy nhiên, so sánh với - 11 CNV gen CATHL4 xác định đƣợc giống bò địa phƣơng Châu Âu [22] bị vàng Việt Nam có khác biệt số gen Đa hình số gen CATHL4 cá thể bị vàng có liên quan đến nguồn gốc giống vật ni xảy với áp lực điều kiện môi trƣờng sống Nhìn chung, số gen CATHL4 thể tính đa hình cao bị vàng Việt Nam Bảng 15: Số gen CATHL4 xác định cá thể bò vàng Việt Nam Tên mẫu Tỉ lệ số CATHL4/GAPDH T1 2.31 T2 2.39 T3 3.61 T4 1.82 T5 2.55 H1 1.39 H2 1.22 H3 6.69 H4 2.46 H5 1.05 P1 1.72 P3 1.55 P4 5.30 U1 2.69 U2 3.60 U4 2.23 40 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Với vai trò nhƣ biến thể di truyền quan trọng, thay đổi số lƣợng CNV thay đổi cấu trúc gen, biểu chí ảnh hƣởng đến chức gen Sự tăng giảm số lƣợng hệ gen khơng tƣơng ứng với tăng giảm nồng độ mRNA protein Các kết trƣớc số lƣợng gen gây thay đổi mức độ biểu mRNA Một số lƣợng biến thể gen tỷ lệ với mức biểu gen tăng cƣờng [54], số ngƣợc lại [58] Với giả thiết số lƣợng gen CATHL4 có liên quan tích cực đến biểu biện peptide kháng khuẩn cathelicidin-4, thúc đẩy tăng cƣờng chức miễn dịch cách điều chỉnh mức độ biểu gen CATHL4 Điều tƣơng quan với số nghiên cứu công nhận CNV nguồn biến đổi gen phổ biến đóng vai trị quan trọng việc thích nghi tiến hóa với mơi trƣờng khác động vật khỏe mạnh [54] Những phát nghiên cứu số phát tiền đề cho xác nhận mô tả đặc điểm biến đổi cấu trúc phức tạp gen CATHL4 hệ gen bò vàng Việt Nam đặt tảng cho nghiên cứu liên kết số lƣợng gen với tác động, chức CNV q trình bệnh bị Đồng thời, đa hình trình tự phát đƣợc có liên quan đến đa dạng CNVs nghiên cứu cung cấp thêm nguồn thông tin CNVs cho đánh giá toàn diện tình trạng CNVs CATHL4 nhiễm sắc thể bổ sung liệu độ bao phủ CNV kích thƣớc hệ gen bị 41 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã khuếch đại tinh đƣợc gen CATHL4 có kích thƣớc ~1,37 kb từ 30 mẫu DNA tổng số thuộc quần thể bò vàng Phú Yên, Hà Giang, Thanh Hóa Nghệ An Đã giải trình tự trực tiếp phát gen CATHL4 thể đa hình trình tự số gen Đã tách dịng thành cơng gen CATHL4 sử dụng vector pJET1.2 phân tích đa hình SSCP vùng exon – CATHL4 cho thấy tối đa kiểu sai khác cấu hình sợi ssDNA cá thể bị vàng, bƣớc đầu xác định có nhiều gen CATHL4 hệ gen nhiều cá thể quần thể nghiên cứu Đã giải trình tự DNA từ 17 dịng plasmid mang gen CATHL4 xác định đƣợc 25 biến thể SNP, indel, vùng chèn đoạn 24 nucleotide vùng lặp lại (TG)n khác biệt toàn chiều dài gen Đã phát đƣợc SNP indel, với đột biến sai nghĩa đƣợc dự đốn làm thay đổi trình tự exon – CATHL4 dẫn đến thay đổi tính chất biến thể peptide cathelicidin-4 Đã xác định đa hình số gen CATHL4 qRT-PCR ƣớc tính đƣợc – 6.69 sao/cá thể KIẾN NGHỊ Mở rộng nghiên cứu đa hình gen CATHL4 gen khác thuộc họ cathelicidin bị vàng Việt Nam kích thƣớc mẫu lớn Tiếp tục nghiên cứu biểu gen mã hóa peptide kháng khuẩn CATHL4 bị vàng Việt Nam 42 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Viết Ly, Hoàng Kim Giao, Mai Văn Sánh, Võ Văn Sự Lê Minh Sắt, 1999 Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt nam, Tập Nhà xuất Nơng nghiệp Phạm Dỗn Lân, 2012 Nghiên cứu khác biệt di truyền nhóm bị Vàng địa phƣơng thị phân tử Thƣ viện Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn-9528 Trần Văn Tƣờng, 2000 Giáo trình chăn ni Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh Azim, S., McDowell, D., Cartagena, A., Rodriguez, R., Laughlin, T F., Ahmad, Z., 2016 Venom peptides cathelicidin and lycotoxin cause strong inhibition of Escherichia coli ATP synthase Int J Biol Macromol 87:246-51 doi: 10.1016/j.ijbiomac Aley, S B., Zimmerman, M., Hetsko, M., Selsted, M E., Gillin, F D., 1994 Killing of Giardia lamblia by cryptdins and cationic neutrophil peptides Infect Immun 62:5397–5403 Ballester, M., Castello, A., Ibanez, E., Sanchez, A., Folch, J M., 2004 Real-time quantitative PCR-based system for determining transgene copy number in transgenic animals Biotechniques 2004, 37, 610-613 Barros, E., Goncalves, R M., Cardoso, M H., Santos, N C., Franco, O L., Canadido, E S., 2019 Snake venom cathelicidins as natural antimicrobial peptides Front Pharmacol 10: 1415 doi: 10.3389/fphar.2019.01415 Bickhart, D M., Hou, Y., Schroeder, S G., Alkan, C., Cardone, M F., Matukumalli, L K., Song, J., Schnabel, R D., Ventura, M., Taylor, J F., Garcia, J F., Van Tassell, C P., Sonstegard, T S., Eichler, E E., Liu, G E., 2012 Copy number variation of individual cattle genomes using next-generation sequencing Genome Res, 22:778-790 Brahma, B., Patra, M.C., Karri, S., Chopra, M., Mishra, P., Chandra De, B., Kumar, S., Mahanty, S., Thakur, K., Poluri, K.M., Datta, T.K., De, S., 2015 Diversity, 43 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi antimicrobial action and structure activity relationship of Buffalo cathelicidins doi:10.1371/journal.pone.0144741 10 Bera, A., Singh, S., Nagaraj, R., Vaidya, T., 2003 Induction of autophagic cell death in Leishmania donovani by antimicrobial peptides Mol Biochem Parasitol 127:23–35 11 Benincasa, M., Scocchi, M., Pacor, S., Tossi, A., Nobili, D., Basaglia, G., Busetti, M., Gennaro, R., 2006 Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts J Antimicrob Chemother 58:950–959 12 Bals, R., Wilson, J M., 2003 Cathelicidins - a family of multifunctional antimicrobial peptides Cell Mol Life Sci 60: 711 –720 13 Cardoso, M H., Candido, E S., Chan, L Y., Der Torossian Torres, M., Oshiro, K G N., Rezende, S B., et al., 2018a A computationally designed peptide derived from Escherichia coli as a potential drug template for antibacterial and antibiofilm therapies ACS Infect Dis (12), 1727–1736 doi: 10.1021/acsinfecdis.8b00219 14 Christine, G., Elsik, Ross, L., Tellam, Kim, C., Worley, 2009 The Genome Sequence of Taurine Cattle: A window to ruminant biology and evolution Science 324(5926): 522–528 doi: 10.1126/science.1169588 15 Costa, F., Teixeira, C., Gomes, P., Martins, M C L., 2019 “Clinical application of AMPs,” in Antimicrobial Peptides: Basics for Clinical Application Ed Matsuzaki, K (Singapore: Springer Singapore), p 281–298 doi: 10.1007/978-981-13-35884_15 16 Cho, H., Yum, J., Lariviere, A., Leveque, N., Quy Van Chanh Le, Ahn, B Y., Jeon, H., Hong, K., Soundrarajan, N., Kim, J H., Bodet, C., Park, C., 2020 Opossum Cathelicidins Exhibit Antimicrobial Activity Against a Broad Spectrum of Pathogens Including West Nile virus Front Immunol 2020; 11: 347 17 Davidson, D J., Currie A J., Reid G S D., Bowdish D M E., MacDonald K L., Ma R C., Hancock R E W., Speert D P., 2004 The cationic antimicrobial peptide ll-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced t cell polarization J Immunol 172:1146–1156 doi: 10.4049/jimmunol.172.2.1146 18 Dorin, J R., McHugh, B J., Cox, S L., Davidson, D J., 2015 Mammalian Antimicrobial Peptides; Defensins 44 and Cathelicidins Molecular Medical Luận văn Thạc sĩ Microbiology Đỗ Thị Tươi Chapter 30, Volume 1, Pages 539-565 doi: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-397169-2.00030-5 19 Dobson, R J., Munroe, P B., Caulfield, M J., Saqi, M A S., 2006 Predicting deleterious nsSNPs: an analysis of sequence and structural attributes BMC Bioinformatics 7, 217, doi:10.1186/1471-2105-7-217 20 Finlay, E., 2005 Bovini mitrochondrial DNA: demograohic history and recombination PhD Thesis Dublin University, Dublin, Ireland 21 Feng, F., Chen, C., Zhu, W., He, W., Guang, H., Li, Z., Wang, D., Liu, J., Chen, M., Wang, J., and Yu, H., 2011 Gene cloning, expression and characterization of avian cathelicidin orthologs, Cc-CATHs, from Coturnix coturnix FEBS Journal 278 (2011) 1573–1584 22 Flores, Gillenwaters, E., 2011 Characterization of the Bovine Cathelicidin Gene Family Doctoral dissertation, Texas A&M University 23 Gillenwaters, E N., Seabury, C M., Elliott, J S., Womack, J E., 2009 Sequence analysis and polymorphism discovery in members of the bovine cathelicidin gene family J Hered, doi:101093/jhered/esn112 24 Gennaro, R., Skerlavaj, B., Romeo, D., 1989 Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils Infect Immun 5:3142–3146 25 Hultmark, D., Steiner, H., Rasmuson, T., Boman, H.G, 1980 Insect immunity Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia Eur J Biochem 106:7–16 26 Kumar, M P., Du, J., Lagoudas, G., Jiao, Y., Sawyer, A., Drummond, D.C., Lauffenburger, D.A., and Raue, A., 2018 Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics Cell Rep 25, 1458-1468.e4 27 Kim, S.H., Kim, Y.N., Jang, Y.S., 2017 Cutting edge: Ll-37–mediated formyl peptide receptor-2 signaling in follicular dendritic cells contributes to b cell activation in peyer’s patch germinal centers J Immunol 198:629–633 doi: 10.4049/jimmunol.1600886 28 Kosciuczuk, E M., Lisowski, P., Jarczak, J., Strzałkowska, N., Jozwik, A., Horbanczuk, J., Krzyzewski, J., Zwierzchowski, L., Bagnicka, E., 2012 45 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi Cathelicidins: family of antimicrobial peptides A review Mol Biol Rep 39(12): 10957–10970 doi: 10.1007/s11033-012-1997-x 29 Leontiadou, H., Mark, A.E., Marrink, S.J., 2006 Antimicrobial peptides in action J Am Chem Soc, 128:12156-12161 30 Lee, P H A., Ohtake, T., Zaiou, M., Murakami, M., Rudisill, J A., Lin, K H., Gallo, R L., 2005 Expression of an additional cathelicidin antimicrobial peptide protects against bacterial skin infection Proc Natl Acad Sci U S A 2005 Mar 8;102(10):3750-5 doi: 10.1073/pnas.0500268102 31 Mookherjee, N., Brown, K L., Bowdish, D M., Doria, S., Falsafi, R., Hokamp, K., Roche, F M., Mu, R., Doho, G H., Pistolic, J., Powers, J.P., Bryan, J., Brinkman, F S., Hancock, R E., 2006 Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37 J Immunol, 176: 2455–2464 32 Mishra A K., Choi J., Moon E., Baek K H., 2018 Tryptophan-rich and prolinerich antimicrobial peptides Molecules 23 (4), 815 33 Mwangi, J., Hao, X., Lai, R., Zhang, Z Y., 2019 Antimicrobial peptides: new hope in the war against multidrug resistance Zool Res 2019 Nov 18; 40(6): 488–505 34 Mahlapuu, M., Hakansson, J., Ringstad, L., Bjorn, C., 2016 Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents Front Cell Infect Microbiol 27;6:194 doi: 10.3389/fcimb.2016.00194 35 Murphy, W J., Pevzner, P A., O'Brien, S J., 2004 Trends Genet 20: 631–639 36 Mookherjee, N., Wilson, H L., Doria, S., Popowych, Y., Falsafi, R., et al., 2006 Bovine and human cathelicidin cationic host defense peptides similarly suppress transcriptional responses to bacterial lipopolysaccharide J Leukoc Biol 80: 15631574 37 Nakatsuji, Gallo, 2012 Antimicrobial Peptide Database http://aps.unmc.edu/AP/main.php 38 Putsep, K., Carlsson, G., Boman, H G., Andersson, M., 2002 Deficiency of antibacterial peptides in patients with morbus Kostmann: an observation study Lancet 360:1144–1149 46 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi 39 Paolo, A M., Garcia, J F., Johannes, L., 2010 On the origin of cattle: How aurochs became domestic and colonized the world Evolutionary Anthropology 19: 148–157 doi:10.1002/evan.20267 40 Robinson, W E., Mcdougall, B R., Dat Tran, Selsted, M E., 1998 Anti-HIV-1 activity of indolicidin, an antimicrobial peptide from neutrophils Journal of Leukocyte Biology 63(1):94-100 41 Ruan, Y., Shen, T., Wang, Y., Hou, M., Li, J., Sun, T., 2013 Antimicrobial peptide ll-37 attenuates lta induced inflammatory effect in macrophages Int Immunopharmacol 15:575–580 doi: 10.1016/j.intimp.2013.01.012 42 Singh N., Abraham J., 2014 Ribosomally synthesized peptides from natural sources J Antibiot 67, 277 43 Scocchi, M., Bontempo, D., Boscolo, S., Tomasinsig, L., Giulotto, E., Zanetti, M., 1999 Novel cathelicidins in horse leukocytes FEBS Lett 457:459–464 44 Selsted, M E., Novotny, M J., Morris, W L., Tang, Y Q., Smith, W., Cullor, J S., 1992 Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils J Biol Chem 267:4292–4295 45 Selsted, M E., Ouellette, A J., 2005 Mammalian defensins in the antimicrobial immune response Nat Immunol 6:551–557 46 Storici, P., Tossi, A., Lenarcic, B., Romeo, D., 1996 Purification and structural characterization of bovine cathelicidins, precursors of antimicrobial peptides Eur J Biochem 15;238(3):769-76 47 Treffers, C., Chen, L., Anderson, R C., Yu, P L., 2005 Isolation and characterisation of antimicrobial peptides from deer neutrophils Int J Antimicrob Agents 26:165–169 48 Tomasinsig, L., De Conti, G., Skerlavaj, B., Piccinini, R., Mazzilli, M., D’Este, F., Tossi, A., Zanetti, M., 2010 Broad-spectrum activity against bacterial mastitis pathogens and activation of mammary epithelial cells support a protective role of neutrophil cathelicidins in bovine mastitis Infect Immun 78:1781–1788 49 Tajbakhsh, M., Karimi, A., Tohidpour, A., Abbasi, N., Fallah, F., Akhavan, M M., 2018 The antimicrobial potential of a new derivative of cathelicidin from Bungarus fasciatus against methicillin-resistant Staphylococcus aureus J Microbiol 2018 Feb;56(2):128-137 doi: 10.1007/s12275-018-7444-5 47 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi 50 Tossi, A., Sandri, L., Giangaspero, A., 2000 Amphipathic, alphahelical antimicrobial peptides Biopolymers 55:4–30 51 Tomasinsig, L., Zanetti, M., 2005 The cathelicidins – structure function and evolution Curr Protein Pept Sci 6:23–34 52 van Harten, R M., van Woudenbergh, E., van Dijk, A., Haagsman H P., 2018 Cathelicidins: Immunomodulatory Antimicrobials Vaccines (Basel) 6(3): 63 doi: 10.3390/vaccines6030063 53 Whelehan, C J., Barry-Reidy, A., Meade, K G., Eckersall, P D., Chapwanya, A., Narciandi, F., et al, 2014 Characterisation and expression profile of the bovine cathelicidin gene repertoire in mammary tissue BMC Genomics 15:128 doi:10.1186/1471-2164-15-128 54 Wong, K.K.; deLeeuw, R.J.; Dosanjh, N.S.; Kimm, L.R.; Cheng, Z.; Horsman, D.E.; MacAulay, C.; Ng, R.T.;Brown, C.J.; Eichler, E.E.; et al, 2007 A comprehensive analysis of common copy-number variations in the humangenome Am J Hum Genet 80, 91–104 55 Wuerth, K., Hancock, R E., 2011 New insights into cathelicidin modulation of adaptive immunity Eur J Immunol 41:2817–2819 56 Whelan, J A., Russel, N B., Whelan, M A., (2003) A method for the absolute quantification of cDNA using realtime PCR J Immunol Methods, 278: 261–269 PMID: 12957413 57 Wang, J., Wong, E S., Whitley, J C., Li, J., Stringer, J M., Short, K R., Renfree, M B., Belov, K., Cocks, B G., 2011 Ancient antimicrobial peptides kill antibioticresistant pathogens: Australian mammals provide new options PLoS ONE, 6: e24030 doi:101371/journalpone0024030 58 Xu, Y.; Shi, T.; Cai, H.; Zhou, Y.; Lan, X.; Zhang, C.; Lei, C.; Qi, X.; Chen, H, 2014 Associations of MYH3 genecopy number variations with transcriptional expression and growth traits in Chinese cattle Gene2014,535,106–111 59 Zhu, S., 2008 Did cathelicidins, a family of multifunctional host - defense peptides, arise from a cysteine protease inhibitor? Trends in Microbiology Vol.16 No.8 60 Zhang, L., Boeren, S., van Hooijdonk, A C M., Vervoort, J M., and Hettinga, K A., 2014 A proteomic perspective on the changes in milk proteins due to high 48 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi somatic cell count J Dairy Sci 98:5339–5351 http://dx.doi.org/10.3168/jds.20149279 61 Zanetti, M., 2005 The role of cathelicidins in the innate host defenses of mammals Curr Issues Mol Biol 7:179–196 62 Zanetti, M., Gennaro, R., Romeo, D., 1995 Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain FEBS Lett 374:1–5 63 Zhang, L., Jie, H., Xiao, Y., Zhou, C., Lyu, W., Bai, W., 2019 Genomic Identification and Expression Analysis of the Cathelicidin Gene Family of the Forest Musk Deer Animals 9(8), 481 https://doi.org/10.3390/ani9080481 64 Zasloff, M., Magainins, 1987 A class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor Proc Natl Acad Sci USA 84:5449–5453 65 Zhao, L., Seth, A., Wibowo, N., Zhao, C X., Mitter, N., Yu, C., Middelberg, A P J., 2014 Nanoparticle vaccines 10.1016/j.vaccine.2013.11.069 49 Vaccine 32:327–337 doi: Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi PHỤ LỤC Bảng bổ sung 1: Nồng độ sản phẩm PCR tinh gen CATHL4 Tên mẫu Nồng độ [ng/µl] A260/280 A260/230 H1 30.00 1.81 2.23 H2 20.70 1.79 1.99 H3 37.30 1.97 2.19 H4 32.00 1.83 2.04 H5 28.80 1.95 2.21 H6 32.00 1.82 2.02 H7 25.77 1.81 2.08 U1 38.10 1.79 2.10 U2 30.70 1.73 1.98 U3 44.40 1.84 2.07 U4 12.20 1.90 2.14 U5 30.30 1.88 2.09 U6 31.00 1.80 1.98 T1 25.00 1.82 1.99 T2 26.00 1.80 2.26 T3 30.00 2.00 2.30 T4 24.50 1.81 2.26 T5 20.40 1.77 1.95 T6 28.90 1.80 1.98 T7 33.00 1.84 2.23 P1 28.70 1.89 2.03 P2 26.00 1.83 2.17 P3 32.10 1.75 1.90 P4 43.50 1.82 2.11 P5 26.90 1.94 2.32 50 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Thị Tươi P6 19.88 1.80 2.01 P7 27.60 1.79 1.99 P8 33.23 1.82 2.08 P9 21.10 1.80 2.00 P10 20.90 1.87 2.12 Bảng bổ sung 2: Nồng độ plasmid mang gen CATHL4 tinh Tên mẫu Nồng độ [ng/µl] A260/280 A260/230 H1.3 105 1.81 2.00 H3.26 150 1.78 1.98 H4.3 90 1.90 2.21 H4.4 180 1.83 2.01 H4.5 125 1.80 2.00 H4.8 210 1.82 1.90 P1.3 112 1.79 2.20 P1.5 98 1.87 2.03 P1.15 198 1.87 1.91 P3.19 130 1.85 1.93 P3.24 250 1.80 2.11 P5.1 217 1.81 2.27 P5.9 136 1.83 2.00 U2.7 88 1.92 2.04 U2.9 135 1.80 1.98 U2.11 173 1.87 2.06 T3.9 105 2.00 2.32 T3.13 223 1.80 2.02 51 ... CATHL4 bị vàng Việt Nam cần thiết Do đó, đề tài: ? ?Nghiên cứu đa hình di truyền gen CATHL4 mã hóa peptide kháng khuẩn nhóm cathelicidin bị vàng địa Việt Nam? ?? đƣợc thực Mục tiêu nghiên cứu đề tài... HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ THỊ TƢƠI NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM CATHELICIDIN Ở BÒ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201.22 LUẬN... tích đa hình di truyền gen CATHL4 từ mẫu bò vàng địa Việt Nam Nghiên cứu đa hình gen CATHL4 đƣợc thực 30 cá thể bò vàng thuộc quần thể P, H, T N DNA tổng số đƣợc tinh từ mẫu nghiên cứu gen CATHL4