Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA * TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT ISOFLAVONE TỪ BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÓ HỖ TRỢ SIÊU ÂM SVTH: MAI THỊ THU SƯƠNG Đà Nẵng – Năm 2017 TĨM TẮT Tên đề tài: Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Sinh viên thực hiện: Mai Thị Thu Sương MSSV: 107120156 Lớp: 12H2 Đề tài nghiên cứu trình bày kết điều kiện chiết isoflavone phương chiết có hỗ trợ siêu âm Nguyên liệu bã đậu nành thu nhận địa bàn thành phố Đà Nẵng Qua khảo sát chọn môi trường chiết trung tính, nồng độ dung mơi ethanol 80% Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố tồn phần (QHTN TYT 23) tối ưu hóa, tìm điều kiện chiết tốt 70,50C, 78 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1, hàm lượng isoflavone tổng số 147,060 μg/g Từ kết trên, tiến hành QHTN TYT 22 nghiên cứu điều kiện siêu âm hỗ trợ cho phương pháp Kết chọn điều kiện chiết khuấy có hỗ trợ siêu âm: biên độ siêu âm 80%, thời gian siêu âm 15 phút, nhiệt độ khuấy 70,50C, thời gian khuấy 78 phút tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1, hàm lượng isoflavone thu 162,726 μg/g ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN NGHIÊN CỨU TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: MAI THỊ THU SƯƠNG Số thẻ sinh viên: 107120156 Lớp: 12H2 Đề tài Khoa: HĨA Ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu ban đầu Tham khảo kết nghiên cứu trước Nội dung phần thuyết minh − Mở đầu − Chương 1: Tổng quan tài liệu − Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu − Chương 3: Kết thảo luận − Kết luận kiến nghị − Tài liệu tham khảo − Phụ lục Các vẽ Không Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh ThS Trần Thị Ngọc Thư Ngày giao nhiệm vụ: 01/01/2017 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 22/05/2017 Đà Nẵng, ngày tháng 05 TRƯỞNG BỘ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) PGS.TS Đặng Minh Nhật năm 2017 NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu “Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm” nhờ vào giúp đỡ lớn từ thầy cô bạn bè Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS TS Trương Thị Minh Hạnh người hướng dẫn em thực đề tài nghiên cứu, người tận tình hướng dẫn em suốt trình Nhờ em học hỏi nhiều kiến thức từ áp dụng vào thực tiễn, tăng khả tư kỹ thao tác phịng thí nghiệm Em xin cảm ơn cô ThS Trần Thị Ngọc Thư - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Sinh học - Trường Cao đẳng Cơng nghệ hướng dẫn, hết lịng giúp đỡ, dẫn em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn qúy thầy cô phịng thí nghiệm khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng thầy phịng thí nghiệm khoa Hóa trường Cao đẳng Cơng Nghệ, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng tạo điều kiện, giúp đỡ, hỗ trợ em thời gian qua Em xin cảm ơn Phịng phân tích nhà máy sữa đậu nành Vinasoy – Công ty Cổ phần Đường Quảng Ngãi tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè giúp đỡ em nhiều để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày 22 tháng 05 năm 2017 Sinh viên thực Mai Thị Thu Sương i LỜI CAM ĐOAN Với danh dự trách nhiệm cá nhân, em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu độc lập riêng thân em hướng dẫn cô PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh cô ThS Trần Thị Ngọc Thư Việc hồn thành chun đề tốt nghiệp có tham khảo từ tài liệu khác soạn thảo hoàn thành cách độc lập, sáng tạo, không chép từ chuyên đề tốt nghiệp nào, không chép người khác, nguồn tài liệu trích dẫn, số liệu sử dụng nội dung chuyên đề tốt nghiệp trung thực Đà Nẵng, ngày 22 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Mai Thị Thu Sương ii MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bã đậu nành 1.2 Isoflavone 1.2.1 1.2.2 Cấu trúc Hoạt tính isoflavone 1.2.3 1.2.4 1.3 Tác dụng isoflavone phòng điều trị bệnh Sự chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone Các phương pháp trích ly isoflavone 1.3.1 Phương pháp cổ điển 1.3.2 Phương pháp đại 1.4 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 12 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.5 Cơ sở lý thuyết 12 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 12 Các thơng số đặc trưng q trình sắc ký 14 Hóa chất sử dụng phân tích HPLC 16 Phương pháp phân tích isoflavone hệ thống HPLC 16 Các nghiên cứu nước 17 1.5.1 Trong nước 17 1.5.2 Ngoài nước 17 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 19 iii 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavone 22 2.2.2 Phương pháp trích ly isoflavone 23 2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25 2.2.4 Phương pháp xác định điều kiện tối ưu trình chiết khuấy 25 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu trình chiết khuấy có siêu âm hỗ trợ 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavone kỹ thuật HPLC 27 3.2 Khảo sát ảnh hưởng môi trường chiết nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng isoflavone 29 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường chiết đến hàm lượng isoflavone 29 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng isoflavone 31 3.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone phương pháp chiết khuấy 32 3.3.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu 33 3.3.2 Các bước thực toán quy hoạch 33 3.3.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết phương pháp leo dốc mặt mục tiêu Box Wilson 37 3.4 Nghiên cứu q trình chiết khuấy có hỗ trợ siêu âm 40 3.4.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu 40 3.4.2 Các bước thực toán quy hoạch 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc phân tử isoflavone Hình 1.2 Các dạng đồng phân Hình 1.3 Sự thủy phân isoflavone glycoside bazơ axit Hình 1.4 Quá trình hình thành, phát triển vỡ bọt khí 11 Hình 1.5 Thời gian lưu cấu tử phân tích 15 Hình 2.1 Bã đậu nành tươi, bã khô bột bã 19 Hình 2.2 Hạt bột đậu nành khô 19 Hình 2.3 Tủ sấy đối lưu Memmert 20 Hình 2.4 Tủ lạnh sâu 20 Hình 2.5 Thiết bị khuấy 20 Hình 2.6 Máy bơm chân không 21 Hình 2.7 Máy ly tâm 21 Hình 2.8 Thiết bị quay chân không 21 Hình 2.9 Máy lắc 21 Hình 2.10 Thiết bị HPLC 21 Hình 2.11 Thiết bị siêu âm 22 Hình 2.12 Quy trình1: quy trình chiết isoflavone phịng thí nghiệm 23 Hình 2.13 Quy trình 2: quy trình chiết isoflavone phương pháp khuấy có hỗ trợ siêu âm phịng thí nghiệm 24 Hình 3.1 Biểu đồ đường chuẩn 29 Hình 3.2 Ảnh hưởng môi trường chiết đến hàm lượng isoflavone 30 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng isoflavone 32 Bảng 1.1 Các gốc thay cuả đồng phân Bảng 2.1 Nồng độ chất chuẩn làm việc (µg/ml) 22 Bảng 3.1 Phương trình đường chuẩn 29 Bảng 3.2 Các mức yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết isoflavone 33 Bảng 3.3 Mơ hình thí nghiệm trực giao cấp kết thí nghiệm theo mơ hình 34 v Bảng 3.4 Kết tổng bình phương độ lệch giá trị thực nghiệm PTHQ 36 Bảng 3.5 Bảng xác định |bj λj|max 38 Bảng 3.6 Bước chuyển động yếu tố ảnh hưởng 39 Bảng 3.7 Thực nghiệm theo hướng dốc đứng 39 Bảng 3.8 Mức quy hoạch thực nghiệm yếu tố 41 Bảng 3.9 Mơ hình thí nghiệm trực giao cấp kết thí nghiệm theo mơ hình 41 vi Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm MỞ ĐẦU Ngày nay, nhu cầu sống người ngày cao, đặc biệt nhu cầu thực phẩm Thực phẩm không cung cấp đầy đủ dinh dưỡng mà phải đáp ứng phần nhu cầu phịng trị bệnh Vì vậy, năm gần nhiều loại thực phẩm chức đời, nhu cầu sản xuất thực phẩm giàu hàm lượng isoflavone, “phytoestrogen” mang ý nghĩa lớn Đậu nành từ xưa đến nguồn thực phẩm truyền thống Nhiều nghiên cứu cho thấy, đậu nành tốt cho sức khỏe, đặc biệt nữ giới nhờ vào hàm lượng isoflavone Phần lớn lượng đậu nành tiêu thụ làm sữa, riêng TP Hồ Chí Minh có nhiều sở sản xuất lớn như: Công ty cổ phần Vinasoy, Công ty cổ phần nước giải khát Sài Gịn Tribeco, Cơng ty Unipresident,… Lượng bã đậu nành thải ngày số khổng lồ, công ty Tribeco thải khoảng bã đậu/ngày, công ty Vinasoy thải 15-17 tấn/tháng [1]… Trong bã đậu lại lượng không nhỏ chất dinh dưỡng, quan trọng có mặt isoflavone (30-50% isoflavone cịn sót lại bã) Tuy nhiên, việc chấp nhận bã đậu nành sản phẩm thực phẩm hạn chế, mà đa phần chúng làm thức ăn gia súc phân bón Khối lượng bã thải lớn, phần nhỏ khối lượng bã thải sử dụng làm thức ăn chăn ni, phân bón, chế biến thành thực phẩm chay thay phần nguyên liệu sản xuất bánh mì, bún Mặt khác, isoflavone biết đến hoạt chất sinh học quý, có cấu tạo tương tự nội tiết tố nữ đóng vai trị quan trọng với phụ nữ tiền mãn kinh, ngăn ngừa bệnh tim mạch v.v Việc ứng dụng bã đậu nành để khai thác isoflavone mở hướng đồng thời đem lại lợi ích cho người Có nhiều phương pháp trích ly isoflavone, từ truyền thống đến đại Sử dụng sóng siêu âm trích ly isoflavone kỹ thuật đại góp phần khắc phục số nhược điểm phương pháp truyền thống giảm lượng dung mơi, giảm thời gian chiết, an tồn hiệu thân thiện với môi trường so với phương pháp truyền thống Vì vậy, việc tìm phương pháp thu nhận tối đa hàm lượng isoflavone cịn sót lại bã mang ý nghĩa dinh dưỡng kinh tế Do đó, hướng dẫn giáo viên hướng dẫn em tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm” SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm 116.720 114.908 3.285 103.690 106.288 6.747 102.240 104.733 6.213 99.390 96.113 10.742 922.320 28.065 ∑ 922.320 𝑢=1 𝑆𝑡𝑡 = ∑𝑁 𝑢=1((Yu − Y᷉u)^2 𝑁−𝐿 = 28,065 = 7,016 N: số thí nghiệm nhân phương án, N=8 L: số hệ số có nghĩa PTHQ, L=4 Ftn = 7,016 5,179 = 1,355 Tra bảng phân bố phân vị chuẩn Fisher Fb (f1, f2) với mức ý nghĩa p= 0,05; f1 = N-L = 4, f2 = m-1 = 2; Fb = F(0,05; 4; 2)= 19,3 So sánh Ftn Fb ta thấy Ftn < Fb Vậy phương trình hồi qui (2*) tương thích với thực nghiệm phương trình sử dụng để tìm kiếm tối ưu Nhận xét: + Phương trình hồi quy có dạng tuyến tính, yếu tố nhiệt độ khuấy, thời gian khuấy tỉ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng isoflavone Vậy phương trình hồi quy mơ tả khoảng yếu tố chọn tăng nhiệt độ, thời gian khuấy, tăng tỉ lệ dung mơi/ ngun liệu hàm lượng isoflavone tăng + Phương trình hồi quy tìm tuyến tính miền chọn Mặt mục tiêu mô tả phương trình hồi quy tuyến tính Khi tiến dần đến gần miền cực trị mơ tả tương thích khơng cịn phù hợp [23] Vì sử dụng tốn tối ưu để tìm 𝑜𝑝𝑡 𝑜𝑝𝑡 𝑜𝑝𝑡 ̃ = f(x1, x2, x3) tọa độ điểm cực trị (𝑥1 , 𝑥2 , 𝑥3 ) mặt mục tiêu Y 3.3.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết phương pháp leo dốc mặt mục tiêu Box Wilson Với mục đích tìm điều kiện chiết tốt để hàm lượng isoflavone tổng số thu cao nhất, cần tối ưu điều kiện chiết với hàm mục tiêu hàm lượng isoflavone để tìm giải pháp công nghệ hiệu Vậy nên, em tiến hành tối ưu điều kiện chiết khuấy phương pháp leo dốc Box Wilson • Chọn điểm xuất phát Điểm xuất phát điểm thực nghiệm ứng với k yếu tố ảnh hưởng SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 37 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm lừa chọn có tọa độ xj (x1, x2, …xk), điểm đặc biệt chọn điểm xuất phát người nghiên cứu phải có định hướng rõ ràng dựa vào số thông tin ban đầu Thông thường người ta chọn tâm thực nghiệm điểm xuất phát Vậy nên, chọn điểm xuất phát tâm: Z1= 600C, Z2= 60 phút, Z3= 20/1 • Tìm hướng grady từ điểm sở Từ điểm xuất phát tâm thực nghiệm, xác định mức yếu tố, xây dựng kế hoạch thực nghiệm trực giao cấp I: TYT 23 Tiến hành thí nghiệm theo ma trận để thu nhận thông tin, xây dựng mô hình tốn học, tìm phương trình hồi quy (2*) Từ phương trình hồi quy (2*) ta có grady = 5,854; 6,912; 13,283 • Chuyển động theo hướng grady - Tính bước chuyển động Si cho yếu tố i≠j; i,j = 1,2,…,k Từ phương trình hồi quy ta lập tích bjλj; j = 1,2,…,k λj: khoảng biến thiên yếu tố j bj: hệ số tuyến tính PTHQ - Xác định ∣ bjλj∣max làm sở để tính Ki theo cơng thức: Ki = 𝑏𝑖 𝜆𝑖 𝑏𝑗 𝜆𝑗 Từ phương trình hồi quy (2*) ta xác định tích bjλj (bảng 3.5) Bảng 3.5 Bảng xác định |bj λj|max Yếu tố Điều kiện - Z1 Z2 Z3 𝑋𝑗0 600C 60 phút 20/1 λj 100C 15 phút 5/1 bj 5,854 6,912 13,283 bjλj 58,541 103,681 66,423 ∣ bjλj∣ 58,541 103,681 66,423 Từ bảng ta thấy: |bj λj|max = b2λ2 = 103,681 Tính bước chuyển động yếu tố: Chọn bước chuyển động Sj cho yếu tố thứ j có |bj λj|max Thơng thường người ta chọn bước chuyển động Sj cho yếu tố thứ j sau: Sj = (0,25 ÷ 0,7)λj Chọn Sj= S2= 0,4 x λ2 = 0,4x 15 = Yếu tố lại chuyển động theo yếu tố chọn với bước chuyển động tính theo cơng thức: SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 38 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Si = Ki Sj với Ki = Khi i=j=2 K2= Khi i=1 K1= Khi i=3 K3 = 𝑏𝑖 𝜆𝑖 𝑏𝑗 𝜆𝑗 103,681 103,681 58,541 103,681 66,641 =1 =0,565 103,681 = 0,641 Vậy S2= 6, ta có S1= x 0,565 = 3,5; S2= x 0,641 = 3,8 Bước chuyển động yếu tố tính bảng 3.6 Bảng 3.6 Bước chuyển động yếu tố ảnh hưởng - Yếu tố bj λj bj λj |bj λj| Ki Si 5,854 10 58,541 58,541 0,565 3,5 6,912 15 103,681 103,681 13,283 66,423 66,423 0,641 3,8 - Lập kế hoạch thực nghiệm theo hướng grady Thí nghiệm thực tâm phương án 𝑍𝑗0 (𝑍10 , 𝑍20 , …,𝑍𝑘0 ) Thí nghiệm thứ thực điểm 𝑍𝑗1 (𝑍11 , 𝑍21 , …,𝑍𝑘1 ) có tọa độ sau: 𝑍11 = 𝑍10 + S1 , 𝑍21 = 𝑍20 + S2 , …, 𝑍𝑘1 = 𝑍𝑘0 + Sk Thí nghiệm N thực điểm 𝑍𝑗𝑁 ứng với tọa độ: 𝑍1𝑁 = 𝑍1𝑁−1 + S1 , 𝑍21 = 𝑍2𝑁−1 + S2 , …, 𝑍𝑘𝑁 = 𝑍𝑘𝑁−1 + Sk Bảng 3.7 Thực nghiệm theo hướng dốc đứng N x1 Z1(0C) x2 Z2 (phút) x3 Z3 Y (µg/g) 60 60 20 119,044 0,35 63,5 0,4 66 0,76 23,8 135,032 0,7 67 0,8 72 1,52 27,6 144,550 1,05 70,5 1,2 78 2,28 31,4 147,060 1,4 74 1,6 84 3,04 35,2 168,800 Trong đó: x1, x2, x3 biến mã Z1, Z2, Z3 biến thực • Điều kiện dừng - Khi làm N thí nghiệm theo hướng dốc đứng giá trị thực nghiệm thu yN < yN-1 (bài tốn max) dừng làm thí nghiệm theo hướng nghiên cứu điểm 𝑍𝑗𝑁 - Giá trị điểm thứ N-1(yN-1) cực trị điều kiện dừng ứng với thí nghiệm thứ N-1 có tọa độ 𝑍𝑗𝑁−1 điều kiện tốt theo hướng nghiên cứu SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 39 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Nhận xét: Theo bảng thực nghiệm 3.7, hàm lượng isoflavone tăng dần theo bước nhảy, kết thí nghiệm cao 4, ta chọn điều kiện tối ưu thí nghiệm thứ Vì lập kế hoạch thực nghiệm theo hướng grady cho biến thực biến mã, biến mã cho phép dao động khoảng -3< xgh< +3 [23], biến mã thí nghiêm khơng phù hợp (x3 >3) Từ đó, điều kiện tối ưu phương pháp chiết khuấy: nhiệt độ khuấy 70,50C, thời gian 78 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1 với hàm lượng isoflavone thu 147,060 µg/g 3.4 Nghiên cứu q trình chiết khuấy có hỗ trợ siêu âm Sau tìm điều kiện chiết khuấy tối ưu, với hiệu phương pháp siêu âm nhờ vào tác động học sóng siêu âm tạo điều kiện phá vỡ màng tế bào sinh học giải phóng vật chất bên cách dễ dàng rút ngắn thời gian chiết so với phương pháp chiết truyền thống Mục đích nhằm chiết hàm lượng isoflavone tối đa, ta tiến hành nghiên cứu trình chiết quấy có siêu âm hỗ trợ phương pháp quy hoạch thực nghiệm, với điều kiện chiết khuấy tối ưu mục 3.3 3.4.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu Trong trình chiết khuấy cố định với điều kiện siêu âm thay đổi, hàm lượng isoflavone thu chịu tác động chủ yếu yếu tố quan trọng chọn: - Z1: thời gian siêu âm, phút - Z2: biên độ siêu âm, % Và hàm mục tiêu lựa chọn: - Y: hàm lượng isoflavone đo kĩ thuật HPLC (µg/g) Trong điều kiện công nghệ định mục tiêu đặt hàm lượng isoflavone thu cao Vì ta biểu diễn mối quan hệ yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu sau: Y = f( Z1, Z2) Y Max 3.4.2 Các bước thực toán quy hoạch - Chọn phương án quy hoạch: Để xác định hướng đề tài em chọn phương án quy hoạch trực giao cấp I (TYT 2k) thực nghiệm yếu tố toàn phần hai mức, k yếu tố ảnh hưởng Dựa vào kết qủa khảo sát đơn biến nghiên cứu điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp siêu âm kết hợp chiết lắc Trần Thị Ngọc Thư Trương Thị Minh Hạnh, điều kiện siêu âm thích hợp: thời gian siêu âm 15 phút, biên độ siêu âm 80%, chu kỳ siêu âm 0,8s [17] Điều kiện chọn làm mức SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 40 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm phương pháp nghiên cứu trình chiết khuấy có hỗ trợ siêu âm, ta chọn mức quy hoạch thực nghiệm cho yếu tố sau (với điều kiện chiết khuấy kết tối ưu mục 3.3.2) - Thời gian siêu âm (X1): – 15 phút - Biên độ siêu âm (X2): 60 – 80 % Bảng 3.8 Mức quy hoạch thực nghiệm yếu tố Các yếu tố ảnh hưởng Mức yếu tố Khoảng Mức (+) Mức (0) Mức (-) biến thiên Thời gian X1(phút) 15 10 5 Biên độ 80 70 60 10 (λ) X2(%) - Tổ chức thí nghiệm trực giao cấp I: Theo [23] số thí nghiệm nhân phương án 22 = (k = 2) thí nghiệm tâm, điều kiện thí nghiệm ghi bảng 3.8 Từ cách chọn phương án điều kiện thí nghiệm, ta xây dựng ma trận thực nghiệm Kết bảng 3.9 Bảng 3.9 Mơ hình thí nghiệm trực giao cấp1 kết thí nghiệm theo mơ hình STT X0 X1 X2 Y (µg/g) + + + 162,726 + - + 146,413 + + - 145,084 + - - 141,939 T1 + 0 130,304 T2 + 0 128,548 T3 + 0 129,445 Trong đó: T1, T2, T3 thí nghiệm tâm - X0,X1,X2 biến không thứ nguyên Y hàm mục tiêu: hàm lượng isoflavone (µg/g) Xây dựng mơ tả tốn học cho q trình thực nghiệm • Chọn phương trình hồi quy Phương trình hồi quy có dạng: SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 41 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (3.2) [23] đó: b0: hệ số hồi quy b1, b2: hệ số tuyến tính b12: hệ số tương tác đơi • Tính hệ số b Vì ma trận trực giao nên hệ số b phương trình (3.2) tính theo công thức: b0 = bj = bij = 𝑁 𝑁 𝑁 ∑𝑁 𝑢=1 𝑥0𝑢 𝑌𝑢 ∑𝑁 𝑢=1 𝑥𝑗𝑢 𝑌𝑢 ∑𝑁 𝑢=1 𝑥𝑖𝑢 𝑥𝑗𝑢 𝑌𝑢 với i ≠ j = 1,2 [24] Tính b theo cơng thức từ số liệu bảng 3.9 ta được: b0 = b1 = b2 = 4 ∑4𝑢=1 𝑥0𝑢 𝑌𝑢 = 149,041 ∑4𝑢=1 𝑥1𝑢 𝑌𝑢 = 4,865 ∑4𝑢=1 𝑥2𝑢 𝑌𝑢 = 5,529 b12 = ∑4𝑢=1 𝑥1𝑢 𝑥2𝑢 𝑌𝑢 = 3,292 - Kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình (3.2) • Các hệ số kiểm định theo chuẩn Student (t) tj = ∣𝑏𝑗 ∣ 𝑆𝑏𝑗 • So sánh tj với tb(f) Trong đó: tb(f) chuẩn Student tra bảng ứng với xác suất tin cậy p bậc tự f, f = m – 1, m số thí nghiệm tâm bj: hệ số phương trình hồi quy chọn Sbj: độ lệch hệ số bj Nếu tj > tb(f) hệ số bj có nghĩa Nếu tj < tb(f) hệ số bj bị loại khỏi phương trình Đây phương án thí nghiệm tâm nên để kiểm tra ý nghĩa hệ số b PTHQ, ta sử dụng kết qủa tâm thực nghiệm bảng 3.9 để tính 𝑆𝑡ℎ Quá trình kiểm tra theo bước sau: Kết thí nghiệm tâm: 𝑦10 = 130,304, 𝑦20 = 128,548, 𝑦30 = 129,445 SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 42 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Kết trung bình tâm thí nghiệm: 𝑦𝑡𝑏 = ∑3𝑢=1 𝑦𝑢0 = 129,432 Phương sai tái 𝑆𝑡ℎ 𝑆𝑡ℎ = 0 ∑𝑚 𝑢=1(𝑦𝑢− 𝑦𝑡𝑏 )^2 Trong 𝑚−1 𝑌𝑖0 giá trị đo lần 𝑌𝑡𝑏 giá trị trung bình lặp thứ i m lần đo m số lần lặp Phương sai tái 𝑆𝑡ℎ 𝑆𝑡ℎ = 𝑦 )^2 ∑3𝑢=1(𝑦𝑢− 𝑡𝑏 = 0,771 Phương sai tái hệ số bj (𝑆 2𝑏𝑗 ) 𝑆 2𝑏𝑗 = 𝑆𝑡ℎ 𝑁 = 0,771 = 0,192 Sai số chuẩn hệ số bj (Sbj) Sbj= √𝑆𝑏𝑗 = √0,192 = 0,439 Tính chuẩn Student thực nghiệm Áp dụng công thức: tj = ∣𝑏𝑗 ∣ 𝑆𝑏𝑗 , ta có: t0= 339,474, t1 = 11,08, t2 = 12,594, t12 = 12,159 Tra bảng phân bố phân vị chuẩn student (tb): tb(p,f), với p = 0,05 f = 2, t(0,05; = 4,3 So sánh chuẩn Student thực nghiệm (ttn) chuẩn Student tra bảng (tb) So sánh ta thấy t0 >tb, t1> tb, t2>tb, t12> tb tất hệ số có nghĩa phương trình hồi qui Vậy phương trình hồi qui tìm là: Y = 149,041 + 4,865 x1 + 5,529 x2 + 3,292 x12 (3*) Vì phương trình hồi quy tìm với đầy đủ hệ số b0, b1, b2, b12 quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp TYT 22, nên phương trình tương thích với thực nghiệm [23] Nhận xét: 2) + Từ phương trình (3*) ta thấy hàm lượng isoflavone bị ảnh hưởng đồng thời tỉ lệ thuận yếu tố: biên độ siêu âm thời gian siêu âm + Phương trình hồi quy tìm tuyến tính nên sử dụng để tìm kiếm tối ưu Nếu xét khoảng chọn, từ bảng 3.9, ta chọn điều kiện chiết isoflavone tốt từ bã đậu nành phương pháp chiết có siêu âm hỗ trợ: biên độ siêu âm SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 43 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm 80%, thời gian siêu âm 15 phút, nhiệt độ khuấy 70,50C, thời gian khuấy 78 phút tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1, hàm lượng isoflavone thu 162,726 μg/g + Ta nhận thấy, sau kết hợp siêu âm với điều kiện chiết khuấy tối ưu, hàm lượng isoflavone tổng số 162,726 μg/g Với điều kiện chiết khuấy tối ưu ta thu hàm lượng isoflavone tổng số 147,060 µg/g Điều cho thấy hàm lượng isoflavone thu từ phương pháp chiết khuấy kết hợp siêu âm không tăng lên nhiều so với phương pháp chiết khuấy thông thường Khi sử dụng chiết khuấy kết hợp siêu âm, ta nhận thấy thêm thời gian chiết, sử dụng thêm thiết bị siêu âm hiệu không tăng nhiều Nguyên nhân hàm lượng isoflavone bã cịn sót lại khơng nhiều trích ly gần triệt để điều kiện chiết khuấy chọn SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 44 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Khảo sát sơ ảnh hưởng môi trường chiết với dung môi etanol Từ chọn mơi trường chiết thích hợp mơi trường trung tính - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ etanol đến hàm lượng isoflavone tổng số Kết chọn nồng độ dung mơi ethanol thích hợp etanol 80% - Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố: phương pháp qui hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần TYT 23 xây dựng phương trình hồi quy mơ tả ảnh hưởng nhiệt độ khuấy, thời gian khuấy tỉ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất chiết isoflavone là: Y = 115,290 + 4,310 x1 + 5,088 x2 + 9,780 x3 - Kết phân tích tối ưu hóa cho thấy điều kiện chiết isoflavone tốt từ bã đậu nành phương pháp chiết khuấy nhiệt độ 70,50C, thời gian 78 phút tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1 Ở điều kiện này, thực nghiệm hàm lượng isoflavone thu 147,060 µg/g với hàm lượng daizein 35,575µg/g genistin 47,745 μg/g Lượng isoflavavone dạng hai đồng phân cao so với nghiên cứu Trần THị Ngọc Thư Trương Thị Minh Hạnh (2016) với daizein 29 µg/g genistin 30,07 μg/g - Bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần TYT 22 xây dựng phương trình hồi quy mơ tả ảnh hưởng biên độ siêu âm thời gian siêu âm đến hàm lượng isoflavone phương pháp chiết khuấy có hỗ trợ siêu âm là: Y = 149,041 + 4,865 x1 + 5,529 x2 + 3,292 x12 - Tìm điêù kiện chiết cho hàm lượng isoflavone cao phuong pháp chiết có siêu âm hỗ trợ: biên độ siêu âm 80%, thời gian siêu âm 15 phút, nhiệt độ khuấy 70,50C, thời gian khuấy 78 phút tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 31,4/1, hàm lượng isoflavone thu 162,726 μg/g với hàm lượng daizein 35,432 μg/g genistin 59,501 μg/g Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu trình thủy phân tinh isoflavone thu Nghiên cứu trình chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết siêu âm SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 45 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lại Mai Hương (2008), Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp thành phố “Nghiên cứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ”, Cơ quan chủ trì Trường Đại học Bách khoa TPHCM [2] Liu, KeShun Soybeans: Chemistry, technology and Utilization; Chapaman & Hall: New York, 1997, 1216-1218 [3] Wang H.L, Cavins J.F Yield and amino acid composition of fractions obtained during tofu production Cereal Chem 1989, 66, 359-361, Biol Abstra 88, 129853 [4] Bo Li, Fei Lu, Haijuan Nan and Yang Liu, Isolation and Structural Characterisation of Okara Polysaccharides, 2012, 753-761 [5] http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-chiet-xuat-va-phan-lap-isoflavonoid-tu-caydau-nanh-glycine-max-8672/ [6]Devanand L Luthria, Ronita Biswas, Savithiry Natarajan Comparison of extraction solvents and techniques used for the assay of isoflavones from soybean, Food Chemistry 105 (2007) 325-333 [7] Nguyễn Thị Việt Hà, Nghiên cứu số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone, luận văn thạc sĩ khoa học (2012), Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội [8] Jin-Ae Kim, Seung – Beom Hong, Woo-Suk Jung, Chang- Yeo Yu, KyungHo Ma, Jae- Goon Guag, I11- Min Chung Comparision of isoflavones composition in seed, embryo, cotyledon and seed coat of cooked with rice and vegetable soybean (Glycine maxL) varieties Food chemistry 102 (2007) 738-744 [9] Trương Hương Lan, Nguyễn Thị Việt Hà, Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Văn Quyên Nghiên cứu chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglycone đậu tương trình ngâm nước Tạp chí Khoa học Phát triển 2012 Tập 10, số 3: 478-493 [10] Marina Cardoso Nemitz, Renata Cougo Moraes, Letı'cia Scherer Koester, Valquiria Linck Bassani , Gilsane Lino von Poser, Helder Ferreira Teixeir Bioactive soy isoflavones: Extraction and purification procedurse, potential dermal use and nanotechnology based delivery systems Phytochem Rev (2015)14: 849-869 [11] Mengfan Wang, Jian Guo, Wei Qi, Rongxin Su, and Zhimin He An Effective and Green Method for the Extraction and Purification of Aglycone Isoflavones from Soybean Food Sci Biotechnol 22(3): 705-712 (2013) SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 46 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm [12] http://wsc.com.vn/tim-hieu-ve-may-khuay-tron-co-khi.html (ngày truy cập 3/2/2017) [13] Jarupan Kuldiloke, M.Sc (Eng.), Effect of Ultrasound, Temperature and Pressure Treatments on Enzyme Activity and Quality Indicators of Fruit and Vegetable Juices, 2002, 83-154 [14] Đặng Minh Nhật, Bài giảng Phân tích thực phẩm, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng (2014) [15] Mark W Collison, Archer Daniels Midland Co., Research Division, Analytical Chemistry, Decatur, IL 62521-1656; J AOAC Int 2008; 91(3): 489–500 [16] Trương Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ngọc Thư (2016) Nghiên cứu điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành dung mơi ethanol, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số chuyên đề “Nông nghiệp xanh”, 219-224 [17] Tran Thi Ngoc Thu, Truong Thi Minh Hanh (2016) Research on conditions for isoflavones extration from okara using ultrasound in combination with conventional shaking, Kỷ yếu hội thảo khoa học toàn quốc 2016 “Tiến kỹ thuật thực phẩm kỹ thuật sinh học: từ nghiên cứu đến sản xuất”, 11/2016, 199-207 [18] Đỗ Thị Hoa Viên (2004) Quy trình chiết tách phytoestrogen từ đậu tương Báo cáo kết nghiên cứu Đề tài KC 04-17-2004 “Nghiên cứu giải pháp công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam”, 10-16 [19] Lê Hồng Dũng, Lê Thị Hồng Hảo, Báo cáo kết đề tài khoa học công nghệ : Bước đầu xác định hàm lượng daidzen, denistein 17 acid amin đậu tương sản phẩm chế biến, 2007, Cơ quan chủ quản: Viện dinh dưỡng, Hà Nội [20] Lena Jankowiak, Nikolaos kantzas, Remko Boom, Atze Jan van der Goot (2014), Isoflavone extraction from okara using water as extractant, Food Chemistry 160, 372-373 [21] Elizabeth Jingman Zhang, Ka Ming Ng, Kathy Qian Luo, “Extraction and purification of Isoflavones from Soybeans and Characterization of Their Estrogenic Activities”, Agricultural and food chemstry (2007) 55: 6940-6950 [22] Lena Jankowiak, Olivera Trifunovic, Remko M.Boom, Atze J van der Goot (2014), The potential of crude okara for isoflavone production, Journal of Food Engineering, 124, 166-167 [23] Nguyễn Thị Lan, giảng “Mơ hình thống kê tối ưu hóa”, (2014), Đại học Bách Khoa Đà Nẵng SVTH: Mai Thị Thu Sương GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh NCS Trần Thị Ngọc Thư 47 PHỤ LỤC PHA CỒN THÀNH CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU TỪ CỒN TUYỆT ĐỐI (99%) Theo phụ chương số [KS Nguyễn Văn Phước, (1984), “Kỹ thuật sản xuất rượu ethylic”, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội.], ta có:  Trong 100 thể tích rượu 99% có chứa 1,293 thể tích nước  Trong 100 thể tích rượu X% có chứa x thể tích nước Gọi a thể tích nước cần thêm vào 100 thể tích rượu 99% để thu thể tích rượu X% là: a = x – 1,293 (thể tích nước) Gọi b thể tích rượu cần thêm vào để 100 lít hỗn hợp: b = 100 – a (thể tích rượu) ❖ Nồng độ cồn 60% Cũng từ phụ chương 4, tra bảng ta có:  Trong 100 thể tích rượu 60% có chứa 43,637 thể tích nước Lượng nước cần thêm vào: a60 = 43,637 – 1,293 = 42,344 (thể tích nước) Suy ra, thể tích rượu 99% cần thêm vào để 100 lít hỗn hợp có nồng độ ethanol 60%: b60 = 100 – 42,344 = 57,656 (thể tích rượu) ❖ Tính tương tự cho nồng độ ethanol cịn lại: 70%, 80% Ta có bảng tổng hợp kết sau: Bảng1 Kết hàm lượng cồn nước hỗn hợp Nồng độ rượu (%) Hàm lượng 100 lít hỗn hợp (lít) Hàm lượng 100 ml hỗn hợp (ml) Rượu Nước Rượu Nước 60 57,656 42,344 57,656 42,344 70 67,933 32,067 67,933 32,067 80 78,463 21,537 78,463 21,537 ❖ Cách tiến hành pha cồn: Pha cồn 60%  Dùng pipet hút 57,656 ml cồn 99% cho vào bình định mức, sau dùng nước cất định mức tới vạch thành 100ml Pha cồn 70%  Dùng pipet hút 67,933ml cồn 99% cho vào bình định mức, sau dùng nước cất định mức tới vạch thành 100ml Pha cồn 80%  Dùng pipet hút 78,463ml cồn 99% cho vào bình định mức, sau dùng nước cất định mức tới vạch thành 100ml PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU CHUẨN Hình 2.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số Hình 2.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số Hình 2.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số 3 Hình 2.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số Hình 2.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số Hình 2.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn số ... Ngọc Thư 11 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Tóm lại có nhiều phương pháp trích ly loại isoflavone, phương pháp truyền thống có số nhược... 21 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Hình 2.11 Thiết bị siêu âm 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavone. .. Thư 24 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm lệ khảo sát trình chiết khuấy) Sau cắm ngập đầu dị siêu âm vào hỗn dịch thực trình siêu âm Hỗn dịch