T-nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạ[r]
(1)Tổng quan vector tách dòng 1.A Các đặc điểm vector.
Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: Các pGEM-T pGEM-T Easy Vectors thiết kế với 3’- thymidine hai đầu T-nhơ vị trí gắn tăng hiệu trình gắn sản phẩm PCR cách ngăn chặn việc tự gắn vòng vector cung cấp đầu T tương thích với đầu A sản phẩm PCR tạo enzyme tổng hợp
Lựa chọn thể biến nạp Xanh / Trắng: Các vector Các pGEM-T pGEM-T Easy vector có số lượng copy cao, chứa promoter T7 SPS6 RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR, bên đoạn mã cho α-peptite đoạn mã cho enzyme β-galactosidase Sự bất hoạt hoạt động chèn vào đoạn α-peptite cho phép xác định thể chuyển nạp hay không chuyển nạp cách sàng lọc màu sắc xanh/trắng đĩa thạch
Vị trí enzyme giới hạn cho việc cắt đoạn sản phẩm gắn: Vector chứa số lớn vị trí cắt enzyme giới hạn vùng đa chọn lọc (MCR = Multiple Cloning Region) Vị trí MCR Vector pGEM-T Easy nằm dọc theo vị trí nhận biết enzyme EcoRI, BstZI NotI, cho phép enzyme riêng rẽ cắt đoạn chèn Vùng lựa chọn Vector pGEM-T nằm dọc theo vị trí nhận biết BstZI Cuối cùng, vị trí cắt đơi sử dụng để giải phóng đoạn chèn từ vector hay vector khác
Gắn nhanh chóng: Vector cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer Phản ứng gắn ủ vòng nhiệt độ phòng Khoảng thời gian ủ tăng them để tăng số lượng khuẩn lạc biến nạp Thông thường, trình ủ qua đêm 4oC cho số
lượng thể biến nạp cao
Hình Promoter trình tự đa nối vector pGEM-T Easy Sợi phía chịu trách nhiệm tổng hợp ARN nhờ enzym T7 ARN polymerase Sợi phía chịu trách nhiệm tổng hợp ARN nhờ SP6 ARN polymerase
(2)Các điểm trình tự tham khảo vector pGEM-T Easy Vị trí khởi đầu phiên mã nhờ T7 ARN polymerase
Vùng đa nhân dòng 10-128
Promoter SP6 ARN polymerase (-17 đến +3) 139-158 Vị trí khởi đầu phiên mã SP6 ARN polymerase 141 Vị trí liên kết mồi có trình tự đảo ngược pUC/M13 176-197
Bộ ba mở đầu gen lacZ 180
Operator gen lac 200-216
Vùng mã hóa beta-lactamase 1337-2195
Vùng phage f1 2380-2835
Trình tự operon lac 2836-2996, 166-395