Nghiên cứu đa hình kiểu gen EDNRB quy định màu lông trắng của ngựa ở khu vực miền núi đông bắc việt nam

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình kiểu gen EDNRB quy định màu lông trắng ngựa khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam - Mã số: ĐH2012-TN10-01 - Chủ nhiệm: Ma Thị Trang - Cơ quan chủ trì: Đại Học Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: 2012 - 2013 Mục tiêu: Phân tích đa hình kiểu gen EDNRB mối liên quan với màu lông ngựa khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Xác định sai khác kiểu gen EDNRB quy định màu lông trắng ngựa bạch ngựa bạch tạng khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Kết nghiên cứu: Đã khuếch đại vùng gen EDNRB 50 mẫu ngựa lựa chọn ngẫu nhiên phản ứng PCR Kết khuếch đại thành cơng vùng gen EDNRB có kích thước 155bp 50 mẫu nghiên cứu Đã phân tích đa hình sản phẩm cắt giới hạn enzyme BfaI Kết phân tích cho thấy khơng xuất đột biến TC→AG tất 50 mẫu nghiên cứu Cả 50 cá thể ngựa ngựa bạch có gen WW Phân tích đa hình gen EDNRB liên quan tới màu lơng trắng ngựa xác định đa hình gen EDNRB quần thể ngựa nghiên cứu khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Sản phẩm: - 01 Khóa luận tốt nghiệp đại học - 02 báo đăng tạp chí nước (01 đăng tạp chí NN&PTNN, 01 đăng tạp chí Khoa học & cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên) Hiệu quả: Dựa vào kiểu gen xác định màu lông trắng ngựa, đồng thời góp phần tạo dịng ngựa bạch phân biệt với ngựa bạch tạng, giúp nâng cao hiệu công tác chọn giống giảm thiểu rủi ro công tác chọn giống Khả áp dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu: Kết nghiên cứu đề tài ứng dụng sở nuôi ngựa nông hộ nuôi ngựa khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Trong công tác chọn giống, việc xác định cá thể ngựa bạch hay ngựa bạch tạng điều cần thiết giúp cho nhà chọn giống chọn giống tốt nhất, thích hợp Ngày Cơ quan chủ trì tháng năm 2014 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: TO STUDY ON ENDOTHELIN – B RECEPTOR (EDNRB) GENE POLYMORPHISMS DEFINED WHITE COAT OF THE HORSE IN NORTH EAST MOUNTAINOUS AREAS OF VIETNAM Code number: ĐH2012-TN10-01 Coordinator: Ma Thi Trang Implementing institution: Institute of Life Sciences – University of Thai Nguyen Duration: 24 months, from January 2012 to December 2013 Objective(s): Analysis EDNRB genotype polymorphism and the association with coat color of horses in the mountainous area northeast of Vietnam Identifying differences regulations EDNRB genotype of white between albino white horses and horses in the mountainous area northeast of Vietnam Research results: EDNRB gene was amplified region of 50 samples were randomly selected horses by PCR The results were successfully amplified genomic regions EDNRB size 155bp in all 50 samples studied Polymorphisms analyzed the restriction enzyme bfai Results of the analysis showed no mutations occur TC → AG in all 50 samples studied Both 50, these horses are white horses WW gene Analysis EDNRB gene polymorphism related to white coat color of the horse and determine EDNRB gene polymorphisms in horse study populations in mountainous areas northeast Vietnam Products: - 01 Graduation thesis University - 02 paper published in the country journals Effects: Based on genotype can identify white coat color of a horse, and contribute to distinguish lines on white horses with albino horse, raising the fertility of white horses Transfer alternatives of reserach results andapplic ability: Results of research of the study can be applied in the horse farms and horse farms in mountainous areas northeast Vietnam MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.4.1 1.4.1.1 Đặc điểm chung ngựa bạch ngựa bạch tạng Ngựa bạch 1.4.1.2 Ngựa bạch tạng (Albinism) 10 1.4.2 Cơ sở lí luận phương pháp nghiên cứu 10 1.4.2.1 Cấu trúc nucleic acid 10 1.4.2.2 Phương pháp tách DNA 12 1.4.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 13 1.4.2.4 Enzyme giới hạn 16 1.4.2.5 Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism DNA) 19 1.4.3 Đặc điểm gen EDNRB 20 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 21 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 21 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 PHẦN Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu 30 2.1 Cách tiếp cận 30 2.2 Nội dung nghiên cứu 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 31 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 31 2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 31 2.3.3 Phương pháp PCR-RFLP phân tích đa hình gene Endothelin-B Receptor (EDNRB) 32 2.3.4 Phương pháp phân tích kết 35 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Chọn cá thể ngựa lấy mẫu dựa theo đặc điểm ngoại hình 36 3.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu 37 3.3 Phân tích sai khác di truyền 38 3.3.1 Kết khuếch đại đoạn gen EDNRD cá thể ngựa kỹ thuật PCR 38 3.3.2 Kết phân tích tính đa hình sản phẩm PCR enzyme giới hạn BfaI 39 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1 KẾT LUẬN 43 4.2 KIẾN NGHỊ 43 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 5.1 Tiếng Việt 44 5.2 Tiếng Anh 45 1.1 PHẦN I MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngựa động vật nuôi nhiều nhà chăn nuôi quan tâm hữu ích chúng Nước ta có nhiều giống ngựa với màu lông khác màu trắng, đen, vàng, hạt dẻ… Đặc biệt giống ngựa bạch dòng ngựa q, hiếm, có số lượng nước ta nay, phân bố rải rác số tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam[3] Ngựa bạch coi nguồn dược liệu dùng vào việc bồi bổ, nâng cao thể lực, chữa trị số chứng bệnh nan y cho người Số lượng ngựa bạch khơng cịn nhiều bị săn tìm để giết thịt, suất sinh sản ngựa giảm sút việc chọn lọc, quản lý đàn ngựa bạch không trọng, chất di truyền chưa đánh giá[4] Bên cạnh đó, q trình nhân giống đàn ngựa bạch thường dễ bị nhầm lẫn cá thể ngựa bạch cá thể ngựa bị bạch tạng có màu lơng trắng, mà cá thể ngựa bạch tạng thường sinh ngựa bị chết Cho đến chưa có nghiên cứu phân tích kiểu gen liên quan tới màu lơng ngựa nhằm phát mối liên quan kiểu gen với số màu sắc ngựa Hiện với phát triển kỹ thuật nghiên cứu gen, xác định kiểu gen liên quan tới màu lông ngựa Trong chăn nuôi, nhiều ngựa sinh mang màu lông trắng bị bạch tạng Điều gây khó khăn việc phân biệt ngựa bạch ngựa bạch tạng Ngựa bạch tạng thường khả sinh sản, ngựa màu trắng sinh thường bị chết (hội chứng OLWS) Vấn đề nhiều nhà khoa học giới quan tâm Các tác giả Yang (1998), Santschi (1998) Metallinos (1998) cho đột biến hai nucleotid (TC353-354AG) gen Endothelin-B receptor (EDNRB) liên quan với hội chứng chết ngựa màu trắng (OLWS-overo lethal white symdrom) Đột biến dẫn đến thay đổi axit amin từ Isoleusine sang Lysine G- protein couple receptor Hội chứng ngựa chết phát đột biến đồng hợp tử, bố mẹ mang kiểu gen dị hợp tử[22] Theo nghiên cứu Santschi (1998) đàn ngựa 945 màu trắng cho thấy: tất ngựa có hội chứng OLWS dạng đồng hợp tử đột biến endothelin-B receptor Ile118Lys khơng tìm thấy ngựa trưởng thành mang kiểu gen đồng hợp tử Màu lông trắng liên kết chặt chẽ với kiểu gen EDNRB Kiểm tra ADN (kiểu gen EDNRB) cách để xác định chắn liệu ngựa màu trắng sinh ngựa bị mắc hội chứng OLWS hay không Theo nghiên cứu Haase (2007, 2009), phát có đột biến độc lập gen KIT ngựa chịu trách nhiệm kiểu hình màu lơng trắng trội nhiều giống ngựa Trong họ ngựa nghiên cứu, họ ngựa trắng có mang đột biến kiểu gen Những đột biến phát gồm hai đột biến dịch khung, hai đột biến nhầm nghĩa ba đột biến vị trí ghép cặp (c.338-1G>C; c.2222-1G>A; c.2684+1G>A) Thực tế, số lượng alen gen KIT ngựa mô tả đến mức độ phân tử nhiều gen khác lồi vật ni khác Qua kết cho thấy sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử giải trình tự gen, PCR-RFLP xác định kiểu gen quy định màu sắc lông khác ngựa Đặc biệt, từ kết nghiên cứu phân biệt giống ngựa bạch ngựa bạch tạng Từ đó, giúp người chăn ni ngựa loại bỏ ngựa bạch tạng khỏi đàn ngựa giống để tránh sinh ngựa bị chết Do nghiên cứu gen EDNRB ngựa sở khoa học cho việc xác định kiểu gen quy định màu sắc lông ngựa phân biệt, chọn lọc giống ngựa bạch không bị nhầm với ngựa bị bạch tạng 1.2 Mục tiêu đề tài Phân tích đa hình kiểu gen EDNRB mối liên quan với màu lông ngựa khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Xác định sai khác kiểu gen EDNRB quy định màu lông trắng ngựa bạch ngựa bạch tạng khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài mở triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học vào chọn lọc dòng ngựa bạch chủng, phân biệt với ngựa bạch tạng 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Góp phần xây dựng phương pháp phân biệt nhanh xác ngựa bạch với ngựa bạch tạng, góp phần bảo tồn, nhân giống hiệu giống ngựa bạch 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.4.1 Đặc điểm chung ngựa bạch ngựa bạch tạng 1.4.1.1 Ngựa bạch Tổ tiên ngựa xuất cách 60 triệu năm, dòng ngựa nhà triệu năm Ngựa nhà thuộc chủng Equus domesticus, hậu duệ nhiều đời chủng Equus mà nguồn gốc từ Châu Á Ngựa Á Đơng có nguồn gốc từ chủng ngựa rừng Equus Caballus Trgewlsky, ngựa thuộc phụ móng guốc Eohippus - Equus (Theo Vetuni, 1934, Antomliso, 1954, Nobit, 1955) Hầu hết loài ngựa giới loại nhỏ (hay gọi ngựa Pony ngựa địa phương) chiều cao vây từ 90 – 147 cm, thích nghi tốt với khí hậu, thời tiết, thức ăn, nước uống, sử dụng thức ăn theo mùa, di động hợp lý địa hình, địa mạo, miễn dịch tốt với bệnh thường có chỗ, giữ cân thần kinh thể dịch, nội tiết, chịu đựng tốt yếu tố môi trường sinh thái bất lợi, tuổi 30 - 35 năm sinh đẻ; hố, chọn lọc, ni dưỡng khác mà hình to, nhỏ khác tuỳ theo mục đích sử dụng, ngựa địa phương nguồn gen quý báu góp phần làm phong phú vốn gen nước[1] Ngựa Bạch Việt Nam dòng thuộc giống ngựa địa phương Việt Nam, phân bố rải rác tỉnh miền núi vùng cao biên giới phía Bắc, qua số liệu điều tra ngựa bạch số địa phương: Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Bắc Giang cho thấy số lượng ngựa Bạch có khoảng ba trăm 30% du nhập từ Trung Quốc Tầm vóc ngựa Bạch thuộc loại nhỏ con, cao vây 110-115 cm, khối lượng 165 - 180kg (lúc trưởng thành); Ngựa có hình vng đứng (cao vây gần dài thân) chưa cân đối, bụng to, ngực lép, đầu to, cổ nhỏ, tồn thân lơng trắng cước, da trắng hồng, mắt có màu trắng mây trắng cùi nhãn, xung quanh vành mắt có vành màu đồng lửa bao ngươi, lỗ tự nhiên có màu hồng đỏ, móng chân trắng ngà, thông thường ngày trời nắng từ 11h30' đến 13h30' ánh nắng mặt trời gần vuông góc với mặt đất ngựa bạch bị mù màu không phân biệt đường đi[13] 1.4.1.2 Ngựa bạch tạng (Albinism) Ngựa bạch tạng thường khơng có khả sinh sản, ngựa màu trắng sinh thường bị chết (hội chứng OLWS) [25] Các tác giả Yang, 1998., Santschi, 1998 Metallinos, 1998 cho đột biến hai nucleotid (TC353-354AG) gen Endothelin-B receptor (EDNRB) liên quan với hội chứng chết ngựa màu trắng (OLWS-overo lethal white symdrom) Đột biến dẫn đến thay đổi axit amin từ Isoleusine sang Lysine G- protein couple receptor Hội chứng ngựa chết phát đột biến đồng hợp tử, bố mẹ mang kiểu gen dị hợp tử 1.4.2 Cơ sở lí luận phương pháp nghiên cứu 1.4.2.1 Cấu trúc nucleic acid DNA (Desoxyribonucleic acid) Phân tử DNA chuỗi xoắn kép gồm hai chuỗi đơn Mỗi chuỗi đơn chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường deoxyribose bốn base thường ký hiệu chữ base (A-adenine, C- cytosine, G-guanine T- thymine) Hai chuỗi đơn kết hợp với nhờ liên kết hydro hình thành base bổ sung nằm hai chuỗi: A bổ sung cho T C bổ sung cho G Mỗi chuỗi đơn có trình tự định hướng với đầu 5’phosphate tự do, đầu 3’ 10 - Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 µl/ml cho dung dịch DNA sợi đơi Trong đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA= 50 (µl/ml) - Để kiểm tra độ tinh DNA dung dịch, đo giá trị OD bước sóng 280 (OD280) 280 bước sóng protein có mức hấp thụ cao nhất, protein hấp thụ ánh sáng 260 phân tử acid nucleic làm sai lệch giá trị nồng độ thật acid nucleic - Độ tinh mẫu DNA tính tỷ số bước sóng 260nm/280nm Một dung dịch DNA coi (không tạp nhiễm protein) tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1.8-2.0 2.3.3 Phương pháp PCR-RFLP phân tích đa hình gene Endothelin-B Receptor (EDNRB) Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng gen EDNRB Sử dụng cặp mồi ps2/hex1 (Yang cs, 1998) nhân phân đoạn gene EDNRB nằm NST 17 ngựa (www.geneome.ucsc.edu), phản ứng PCR thực với thành phần phản ứng sau: Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng PCR để nhân đoạn gen EDNRB Số lượng thành phần Thành phần phản ứng PCR phản ứng PCR H2O 10,8 µl PCR 10X Buffer 3,5 µl MgCl2 25 mM 1,7 µl dNTP 10mM 0,7 µl Primer ( Xuôi ngược 10 pmol/ µl) 1,1 µl Taq polymerase ( UI/µl) 1,5 µl DNA khn µl Tổng thể tích 25 µl 32 Trình tự cặp mồi ps2/hex1: Mồi xi (ps2): 5’AGTGTTCGTGCTGGGCATC’3 Mồi ngược (hex1): 5’ TCAAGATATTAGGGCCGTTCC’3 Chu trình nhiệt thực theo bước: biến tính 94 0C 15 phút, 30 chu kỳ lặp lại gồm: biến tính 94 0C 40 giây; gắn mồi 63 0C 40 giây, tổng hợp chuỗi DNA 72 0C 40 giây; kết thúc phản ứng 72 0C phút, sau chuyển nhiệt độ 0C Sản phẩm PCR sau nhân lên kiểm tra điện di agarose 1,5% (trong thời gian 45 phút, hiệu điện 60 vôn), Cắt sản phẩm PCR enzym giới hạn Sản phẩm PCR gen EDNRB xử lý với enzyme giới hạn tương ứng thành phần cần thiết (bảng 2.2) sau ủ qua đêm nhiệt độ 37oC Bảng 2.2 Sản phẩm PCR gen EDNRB xử lý enzyme giới hạn BfaI Thành phần Số lượng thành phần dùng để cắt sản phẩm PCR gen EDNRB Buffer Tango 10X 1,5µl H2O 2,8µl Enzyme (10 UI/ µl) 0,7µl Sản phẩm PCR 10µl Kết cắt sản phẩm PCR đoạn gen EDNRB enzyme giới hạn BfaI kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 4% Điện di gel agarose Trong nghiên cứu này, để xác định đa hình DNA: sản phẩm PCR từ cặp mồi Ps2/Hex1 cắt enzyme BfaI Độ lớn đoạn DNA xác 33 định phương pháp điện di gel Agarose 4% nhuộm ethidium bromide với điện 60V 45 phút hệ đệm TBE 1X Các băng điện di đối chứng với thang DNA chuẩn Xác định kiểu gen cho cá thể dựa vào kết điện di [7] Cách tiến hành chạy điện di: + Chuẩn bị gel agarose Cân lượng agarose cần đổ cho vào lọ thủy tinh có nặp nhựa kín, hịa tan dung dịch đệm TBE 1x Đun lò vi sóng đến tan hết hồn tồn Để nguội khoảng 50-60oC, rót dung dịch vào khay lắp lược sẵn, độ dày gel khoảng 3-5mm, sau khoảng 20-30 phút dung dịch đơng hồn tồn Rút lược theo phương thẳng đứng Đặt khay gel vào bồn điện di đổ đệm TBE 1x, đổ đệm ngập mặt gel 0,5-1cm Tra mẫu DNA: Mẫu DNA trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1:6 thể tích (5µl DNA + 1µl đệm tra mẫu), sau tra vào giếng gel Tiến hành chạy điện di với thị DNA để ước lược kích thước phân tử DNA Chạy điện di: Đặt chế độ chạy điện di U=60V, DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát di chuyển DNA màu đệm tra mẫu Kết thúc điện di, gel lấy nhẹ nhàng khỏi bồn ngâm dung dịch EtBt có nồng độ 0.5µl/ml khoảng 15-20ph, rửa nhẹ nước cất quan sát gel đèn chiếu UV để phát DNA Quan sát chụp ảnh gel hệ thống chụp ảnh tự động 34 2.3.4 Phương pháp phân tích kết * Tỷ lệ kiểu gen quần thể tính theo cơng thức sau: Số cá thể mang kiểu gen tương ứng Tỷ lệ kiểu gen = Tổng số cá thể quần thể * Tần số alen A, kí hiệu f(A) tính theo cơng thức sau: f(A) = f(AA) + 1/2 f(AB) +1/2 f(AC) + …+1/2 f(AN) Trong đó: f(AA): tần số xuất kiểu gen đồng hợp tử alen A quần thể f(AB),…, f(AN): tần số xuất kiểu gen dị hợp alen A với alen khác 35 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chọn cá thể ngựa lấy mẫu dựa theo đặc điểm ngoại hình Kết chọn 50 cá thể ngựa lấy mẫu thực cán nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cán Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật - Viện Chăn nuôi Quốc gia Với tiêu chí chọn hai nhóm cá thể ngựa nhóm ngựa bạch nhóm cá thể ngựa có màu lơng trắng khơng xác định xác ngựa bạch hay khơng – nhóm gọi nhóm ngựa nghi ngờ bị bạch tạng Kết chọn phân loại 50 cá thể ngựa lấy mẫu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết chọn ngựa lấy mẫu STT Nhóm ngựa Ngựa bạch Ngựa nghi ngờ bạch tạng Số cá thể Đánh số mẫu (n) 42 08 1-4; 6-18; 22-32; 34-40; 44-50 5, 19, 20, 21, 33, 41, 42, 43 Theo kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cho biết ngựa bạch có số đặc điểm ngoại hình đặc trưng sau: kết cấu ngoại hình săn, toàn thân màu trắng hồng trắng mây, xung quanh có vành màu đồng lửa, mắt màu xanh đen ban đêm soi đèn có màu đỏ rực, bốn móng có màu trắng ngà, lỗ tự nhiên có màu hồng nhuận Đặc điểm khơng có sai khác đời bố mẹ (Đặng Đình Hanh cs, 2009) Nhóm ngựa bạch chọn dựa theo tiêu chí trên, cịn nhóm ngựa nghi ngờ bạch tạng chủ yếu chọn dựa kinh nghiệm nghiên cứu, chủ yếu chọn ngựa sinh hay bị chết non 36 chúng để lấy mẫu, nhiên khơng phân biệt xác hai nhóm ngựa Theo số nhà nghiên cứu ngựa giới khó để phân biệt ngựa bạch với ngựa bạch tạng, thơng thường tồn thân chúng có màu trắng tuyết, da màu hồng, ngựa bạch tạng mang dạng đồng hợp đột biến gene EDNRB sinh tính trạng gây chết ngựa màu trắng 3.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu 10 mẫu DNA ngẫu nhiên sau tách, kiểm tra độ tinh hàm lượng DNA phương pháp đo mật độ quang OD bước sóng 260 nm 280 nm máy quang phổ kế NaNoDrop 2000 Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (OD260nm) mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA dung dịch Đồng thời để kiểm tra độ tinh DNA đo thêm giá trị OD 280nm (OD280nm) xác định tỷ số OD260nm/ OD280nm Kết thu bảng 3.2 Bảng 3.2 Tỉ số OD260nm/OD280nm nồng độ DNA Mẫu nghiên cứu Tỉ số OD260nm/OD280nm Nồng độ DNA ng/µl 1,95 26,7 1,88 30,4 10 1,75 29,3 14 1,93 28,6 20 1,82 31,5 25 1,68 30,8 32 1,80 27,2 43 1,99 25,7 47 1,84 28,9 37 50 1,78 29,8 Trung bình 1,842 28,89 Kết bảng 3.2 cho thấy tỷ số OD260nm/OD280nm dao động từ 1,68 đến 1,99 (trung bình 1,8423) kết chứng tỏ DNA thu tương đối đồng có độ cao Chúng tơi thấy có tới 90% mẫu có tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,8-2,0 mẫu thu hoàn toàn thực phản ứng PCR nghiên cứu 3.3 Phân tích sai khác di truyền 3.3.1 Kết khuếch đại đoạn gen EDNRD cá thể ngựa kỹ thuật PCR Để khuếch đại vùng gen EDNRB từ DNA tổng số cá thể ngựa, sử dụng cặp mồi ps2/hex1 Yang, 1998 thiết kế sử dụng phản ứng PCR Kết PCR kiểm tra điện di gel agarose 1,5% cho kết hình 3.1 Hình 3.1 Hình ảnh điện di Sản phẩm PCR nhân gen EDNRB từ cặp mồi ps2/hex1 M: Thang DNA chuẩn 100bp; Giếng 1,2,3,4,5,6,7: Sản phẩm PCR nhân gen EDNRB có kích thước 155bp 38 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 3.1 cho thấy đường chạy 1,2,3,4,5,6,7 xuất băng DNA vị trí 155bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo công bố Yang, 1998 [25] Kết cho phép khẳng định khuếch đại thành công đoạn gen EDNRB mẫu ngựa nghiên cứu Sản phẩm PCR tiếp tục sử dụng để thực phản ứng cắt enzyme giới hạn để phân tích tính đa hình gen EDNRB 3.3.2 Kết phân tích tính đa hình sản phẩm PCR enzyme giới hạn BfaI Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen EDNRB xử lý enzyme giới hạn BfaI ủ 37oC 20h Sản phẩm cắt giới hạn kiểm tra phương pháp điện di gel agarose % Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn thể hình 3.2 PCR M 155 bp 100 bp Hình 3.2: Phân tích đa hình gene EDNRB enzyme BfaI M: Marker 100 bp; sản phẩm PCR đối chứng; Mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6: Kiểu gene EDNRB cắt enzyme BfaI Sản phẩm PCR cắt enzym giới hạn BfaI thu kiểu gene sau (Yang cs, 1998): Kiểu gene đồng hợp ENEN (kiểu gene bình thường khơng mang đột biến, có kích thước băng 155 bp); kiểu gene đồng hợp EMEM (kiểu gene mang đột biến, PCR bị cắt enzym 39 giới hạn BfaI, thu hai băng có kích thước 136 bp 19 bp); kiểu gene dị hợp ENEM (gồm alen bình thường alen đột biến, sản phẩm cắt thu ba băng có kích thước 155 bp, 136 bp 19 bp Nếu chọn cá thể ngựa làm giống đời có nguy cao bị mắc hội chứng OLWFS) Trong nghiên cứu này, sau sử dụng enzyme gjới hạn BfaI cắt sản phẩm PCR thu băng có kích thước 155bp trùng với kích thước sản phẩm nhân gen EDNRB Điều chứng tỏ cá thể ngựa nghiên cứu có kiểu gen đồng hợp ENEN (kiểu gene bình thường khơng mang đột biến Từ kết luận cá thể ngựa nghiên cứu không mang kiểu gene gây bệnh bạch tạng Theo nghiên cứu Yang, 1998 xuất kiểu hình bạch tạng xuất đột biến nucleotide liên tiếp TC→AG Đột biến tạo nên vị trí nhận biết ennzyme BfaI enzyme cắt đoạn gen EDNRB thành đoạn DNA có kích thước 136bp 19 bp Trường hợp ngựa có kiểu hình bình thường (ngựa bạch) trình tự gen EDNRB khơng chứa vị trí nhận biết enzyme giới hạn BfaI Hình 3.3 Kích thước đoạn DNA thu cắt sản phẩm PCR gen EDNRB enzyme BfaI theo Yang, 1998 Kết nghiên cứu Yang, 1998 tiến hành 19 mẫu ngựa có màu lơng trắng xác định cá thể ngựa bạch tạng, cá thể có sản phẩm cắt giới hạn kích thước 136bp 40 Kết cho thấy tất 50 mẫu ngựa nghiên cứu ngựa bạch (không mang đột biến TC→AG) nên không bị cắt enzyme giới hạn BfaI Kết phân tích đa hình gene EDNRB từ 50 mẫu ngựa nghiên cứu thu tỷ lệ kiểu gene tần số alen trình bày bảng 3.3: Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene tần số alen gene EDNRB Tỷ lệ kiểu gene (%) STT Nhóm ngựa Ngựa bạch Ngựa nghi ngờ bạch tạng Tần số alen Số cá N M thể (n) ENEN EMEM ENEM E (Bình E (Đột thường) biến) 42 100 0 1,0 08 100 0 1,0 Qua bảng cho thấy phân tích đa hình gene EDNRB hai nhóm ngựa thu kiểu gene đồng hợp: 100% ENEN– kiểu gene không bị cắt enzyme giới hạn BfaI, tất 50 cá thể không mang alen gây chết Như vậy, tần số alen f(EN)=1,0 f(EM)=0 Kết thu cho thấy ngựa trắng nhóm hai khơng phải ngựa bạch tạng Metallinos cs (1998) phân tích đa hình gene EDNRB 138 cá thể giống ngựa Frame Overo kết thu được: 3/138 ngựa lơng trắng bị chết có kiểu gene đột biến EMEM, 40/138 ngựa mang kiểu gene dị hợp tử đột biến ENEM, alen đột biến xuất phổ biến ngựa trắng Châu Mỹ Yang cs (1998) phân tích đa hình gene EDNRB 19 cá thể ngựa Overo (Mỹ) kết quả: 10 cá thể ngựa mắc OLWFS cá thể ngựa bình thường Tất ngựa có hội chứng OLWFS có kiểu gene đồng hợp tử 41 đột biến Ile118Lys khơng tìm thấy ngựa trưởng thành mang kiểu gene đồng hợp tử Mối liên quan kiểu gene với màu lông trắng ngựa: Phân tích mối liên quan kiểu gene EDNRB với tính trạng màu lông trắng 50 cá thể ngựa nghiên cứu kết thu được: 100% cá thể ngựa nghiên cứu có kiểu gene ENEN EDNRB quy định màu lông trắng 42 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Đã chọn lấy mẫu 50 cá thể ngựa lông trắng dựa theo đặc điểm ngoại hình, gồm hai nhóm: 42 ngựa bạch 08 ngựa nghi ngờ bạch tạng Phân tích đa hình gene EDNRB phương pháp PCR – RFLP 50 cá thể ngựa nghiên cứu, thu 100% kiểu gene ENEN 50 cá thể ngựa thí nghiệm có kiểu gene bình thường khơng mang đột biến gây chết, cá thể ngựa nhóm khơng phải ngựa bạch tạng Không phát đột biến thay hai nucleotit -TC thành -AG vị trí nucleotit 353-354 từ kết nghiên cứu đa hình gene EDNRB 50 cá thể ngựa nghiên cứu Kết 100% cá thể ngựa trắng nghiên cứu có kiểu gene ENEN EDNRB quy định màu lông trắng 4.2 KIẾN NGHỊ Đề nghị tiếp tục nghiên cứu đa hình Gen EDNRB số lượng mẫu lớn Cần mở rộng nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều đồng thời tiếp tục nghiên cứu quan sát quần thể ngựa với số lượng lớn nhiều hệ để đánh giá ảnh hưởng kiểu gen EDNRB tới kiểu hình màu lơng trắng ngựa nhằm giúp nhà chăn nuôi phân biệt ngựa bạch ngựa bạch tạng 43 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 5.1 Tiếng Việt Tô Du, Chăn nuôi ngựa làm việc sinh sản NXB Nông nghiệp, Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Đặng Đình Hanh “Ngựa bạch việt nam thực trạng cảnh báo tương lai”, Tạp chí chăn ni, số - 08 24 Đặng Đình Hanh, Nguyễn Đức Chuyên, Võ Văn Sự, Vũ Văn Tý, Nguyễn Đức Ước, Nguyễn hữu Trà, Nguyễn Thị Tuyết (2006) “Nghiên cứu số đặc điểm ngoại hình, khả sinh trưởng, sinh sản sinh lý, sinh hóa máu ngựa bạch Trung tâm nghiên cứu phát triển chăn nuôi miền núi”, Báo cáo khoa học Viện Chăn nuôi, Hà Nội Đặng Đình Hanh (2002), Kết nghiên cứu chọn lọc lai tạo giống ngựa khai thác tiềm sinh học Việt Nam giai đoạn 1960 – 2002, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm thành Hổ (2001), Di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Viết Ly (1999), Chuyên khảo Bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phan Cự Nhân, nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh (1999), Di truyền học, NXB giáo dục, Hà Nội 10 Minh Ngọc (2000), Con ngựa với dân miền núi, Chuyên san chăn nuôi gia súc ăn cỏ Hội chăn nuôi Việt Nam 11 Khuất Hữu (2006), Kỹ thuật gen Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 44 12 Nguyễn Văn (2009), Sinh học phân tử, NXB giáo dục, Hà Nội 13 Nguyễn Văn Thiện, Nguyễn Hữu Trà (1998), Kết điều tra ngựa bạch Bắc Kạn Thái Nguyên - Báo cáo Khoa học Viện Chăn nuôi, Hà Nội 14 Nguyễn Hữu Trà, Nguyễn Thu Hà, Vũ Đình Ngoan (2007), Kết điều tra chăn nuôi ngựa bạch Chi Lăng, Lạng Sơn - Báo cáo Khoa học Viện Chăn nuôi 15 Viện Khoa học sống - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên, Bộ môn Sinh học phân tử & công nghệ gen (2013) “Tiêu chuẩn sở tách chiết DNA động vật phịng thí nghiệm” Tháng năm 2013 5.2 Tiếng Anh 16 Faostat (2011), http://faostat.fao.org 17 Haase B., Brooks S.A., Schlumbaum A., Azor P.J., Bailey E., Alaeddine F., Mevissen M., Burger D., Poncet P.A., Rieder S., Leeb T (2007), Allelic heterogeneity at the equine KIT locus in dominant white (W) horses, PLOS Genet, 3, e195, 1–8 18 Haase B., Brooks S.A., Tozaki T., Burger D., Poncet P.A., Rieder S., Hasegawa T., Penedo C., Leeb T.(2009), Seven novel KIT mutations in horses with white coat colour phenotypes Anim Genet, 40, 623–629 19 Marklund S., Moller M.J., Sandberg K., Andersson L (1996): A missense mutation in the gene for melanocyte- stimulating hormone receptor (MC1R) is associated with the chestnut coat color in horses Mamm Genome, 7, 895–899 20 Metallinos D.L., Bowling A.T., Rine J (1998), A missense mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with lethal white foal syndrome: an equine version off hirschsprung disease, Mamm Genome, 9, 426–431 21 Rieder S., Taourit S., Mariat D., Langlois B., Gue´rin G (2001): Mutations in the agouti (ASIP), the extension (MC1R) and the brown (TYRP1) loci and their association to coat colour phenotypes in horses, Mamm Genome, 12, 450–455 45 22 Santschi E.M., Purdy A.K., Valber S.J., Vrotsos P.D., Kaese H., Mickelson J.R (1998), Endothelin receptor B polymorphism associated with lethal white foal syndrome in horses, Mamm Genome, 9, 306–309 23 Stefan Rieder (2009), Molecular tests for coat colours in horses, J Anim Breed Genet 126 , 415–424 24 Wagner H.J., Reissmann M (2000), New polymorphism detected in the horse MC1R gene, Anim Genet., 31, 289-290 25 Yang G.C., Croaker D., Zhang A.L., Manglick P., Cartmill T., Cass D (1998), A dinucleotide mutation in the endothelin-B receptor genes associated with lethal white foal syndrome (LWFS) – a horse variant of Hirschsprung – disease (HSCR), Hum Mol Genet, 7, 1047-1052 46 ... miền núi Đông Bắc Việt Nam Xác định sai khác kiểu gen EDNRB quy định màu lông trắng ngựa bạch ngựa bạch tạng khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên. .. lơng trắng tỉnh: Thái Nguyên, Bắc Kạn, Bắc Giang thuộc khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam Nội dung 2: Nghiên cứu đa hình kiểu gen EDNRB mối liên quan với màu lông ngựa cá thể ngựa khu vực miền núi. .. kết nghiên cứu đa hình gene EDNRB 50 cá thể ngựa nghiên cứu Kết 100% cá thể ngựa trắng nghiên cứu có kiểu gene ENEN EDNRB quy định màu lông trắng 4.2 KIẾN NGHỊ Đề nghị tiếp tục nghiên cứu đa hình