Nghiên cứu phương pháp cố định enzyme urease và phân tích ure

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGÔ THỊ TY NA NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE VÀ PHÂN TÍCH URE CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM & ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2009 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS TRẦN BÍCH LAM Cán chấm nhận xét 1: GS TSKH NGUYỄN THỊ KÊ Cán chấm nhận xét 2: PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU Luận văn thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngày 14 tháng 01 năm 2009 LỜI CẢM ƠN Với lịng tơi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến tập thể cá nhân giúp đỡ suốt thời gian qua: Cơ TS TRẦN BÍCH LAM tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Các Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Phịng quản lý thư viện sau Đại học Trường Đại học Bách Khoa Tập thể bạn học viên lớp cao học Cơng nghệ Thực phẩm & Đồ uống khóa 2006 giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè thân ln động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập HV Ngô Thị Ty Na NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE VÀ PHÂN TÍCH URE TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu chọn chất mang phương pháp cố định enzyme urease, từ khảo sát số tính chất enzyme cố định Ngồi ra, chúng tơi bước đầu sử dụng enzyme urease cố định việc phân tích ure Qua q trình nghiên cứu lựa chọn chất mang phương pháp cố định enzyme urease, xác định phương pháp cố định enzyme urease chất mang chitosan liên kết cộng hóa trị cho hoạt tính tổng enzyme cố định cao Tiếp theo, tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hiệu q trình cố định enzyme urease, từ chúng tơi xác định hiệu suất cố định hoạt tính: 68.6931% Sau cố định enzyme enzyme urease, khảo sát số tính chất enzyme urease cố định, thu số kết sau: ™ Thông số động học: Km vmax enzyme urease cố định có giá trị 0,2652 (M) 1,7034 (µmol NH3/phút/µg protein enzyme) Nhiệt độ tối thích pH tối thích enzyme urease cố định có giá trị Topt = 65oC pHopt khoảng ™ Độ bền nhiệt, khả bảo quản enzyme cố định cao so với enzyme tự ™ Khả tái sử dụng enzyme cố định cao (5 lần sử dụng, hoạt tính thay đổi không đáng kể) Bước đầu sử dụng enzyme urease việc phân tích ure tạo mơ hình Urea biosensor dựa màng urease cố định ống nghiệm thủy tinh sử dụng đầu dò máy đo pH để xác định tín hiệu Từ xác định giới hạn phát ure 50ppm Đồng thời ứng dụng enzyme urease để xác định hàm lượng ure mẫu thực phẩm sữa, nước mắm…theo hai phương pháp: so màu biosensor, kết thu tương đồng Research methods for immobilizing urease enzyme and analyzing urea Abstract This research is used to select the membrane and method for immobilizing urea enzyme, then based on the results some properties are investigated In addition, the immobilized urease enzyme is begun to use to analyze urease enzyme According to our research, we identify the method to immobilize urease enzyme on chitosan membrane by using their covalent binding which gives the highest active summation After that, the factors which influence to the efficiency of process are investigated Based on the investigation, we identify the efficiency of the immobilizing process is 68.6931% After immobilizing urease enzyme, we investigate some properties of immobilized urease enzyme The results are given below: ™ The dynamic parameters: The Km and vmax of immobilized urease enzyme are 0,2652 (M) and 1,7034 respectively (µmol NH3/minute/µg protein enzyme) ™ The optimal temperature and PH of immobilized urease enzyme are Topt = 65oC and pHopt = approximately ™ Thermal stress, storage ability of enzyme immobilized urease enzyme is higher than free enzyme ™ The recyclable ability of enzyme immobilized urease enzyme is rather high (It can be used for times without changing the properties) At the beginning, urease enzyme is used to analyze urea then the model of urea biosensor is built based on the membrane of immobilized urea on glass tube and the signal from PH meter The result is that the limit to identify Urea is 50ppm In addition, the urease enzyme is used to measure the urease quantity in some food product such as milk, fish sauce…by two methods color comparison and using biosensor, the results we get are quite similar MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE 1.1.1 Sơ lược trình nghiên cứu enzyme urease 1.1.2 Giới thiệu chung enzyme urease .3 1.1.2.1Danh pháp 1.1.2.2Cấu tạo enzyme urease .4 1.1.2.3Cơ chế xúc tác 1.1.2.4Cơ chất enzyme urease .6 1.1.2.5Các tính chất hóa lý urease .7 1.1.2.6Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease .8 1.1.2.7Nguồn phân bố enzyme urease .11 1.1.2.8Ứng dụng enzyme urease 15 1.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 17 1.2.1 Giới thiệu 17 1.2.1.1Định nghĩa .17 1.2.1.2Tính chất enzyme cố định 17 1.2.1.3 Ưu, nhược điểm enzyme cố định 18 1.2.2 Các phương pháp cố định enzyme 19 1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH .20 1.3.1 Các phương pháp cố định enzyme urease .20 1.3.2 Tính chất enzyme urease cố định .24 1.3.2.1 Hoạt độ xúc tác enzyme urease cố định 24 1.3.2.2 Tính chất động học enzyme urease cố định 25 1.3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến enzyme urease cố định 27 1.3.2.4 Ảnh hưởng pH đến enzyme urease cố định 29 1.3.2.5 Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt tính urease cố định 31 1.4 TỔNG QUAN VỀ ĐIỆN CỰC SINH HỌC 32 1.4.1 Lịch sử phát triển điện cực sinh .32 1.4.2 Cấu tạo điện cực sinh học .33 1.4.2.1 Khái niệm điện cực sinh học (biosensor) 33 1.4.2.2 Cấu tạo điện cực sinh học 33 1.4.2.3 Yêu cầu điện cực sinh học .36 1.4.2.4 Nguyên lý hoạt động điện cực sinh học 36 1.4.2.5 Cố định enzyme điện cực sinh học .44 1.4.3 Một số loại điện cực sinh học 44 1.4.3.1Điện cực điện hóa (electrochemical biosensor) 48 1.4.3.2Điện cực bán dẫn (Semiconductor biosensor) 49 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .49 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 49 2.1.1 Nguyên liệu 49 2.1.2 Hóa chất 52 2.1.3 Dụng cụ – Thiết bị 52 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.2.1 Nội dung nghiên cứu .52 2.2.2 Nghiên cứu xác định phương pháp cố định enzyme urease 54 2.2.2.1 Cố định enzyme urease phương pháp nhốt gel 54 2.2.2.2 Cố định enzyme urease phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị 55 2.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định enzyme urease lên chất mang chitosan phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị .57 2.2.3.1 Ảnh hưởng bề dày màng chitosan 58 2.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch glutaraldehyde ngâm màng 58 2.2.3.3 Ảnh hưởng thời gian ngâm màng dung dịch glutaraldehyde .59 2.2.3.4 Ảnh hưởng pH dung dịch enzyme urease .59 2.2.3.5 Ảnh hưởng thời gian ngâm màng dung dịch enzyme urease .60 2.2.4 Xác định hiệu suất cố định 61 2.2.5 Khảo sát số tính chất enzyme urease cố định chất mang chitosan phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị 62 2.2.5.1 Khảo sát tính chất động học enzyme urease cố định .62 2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease cố định .63 2.2.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt enzyme urease cố định 64 2.2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme urease cố định .64 2.2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng loại đệm khác đến hoạt tính enzyme cố định .64 2.2.5.6 Khảo sát chế độ bảo quản enzyme urease cố định .65 2.2.5.7 Khảo sát khả tái sử dụng enzyme urease cố định 65 2.2.6 Các phương pháp hóa sinh 66 2.2.6.1Xác định hoạt tính enzyme urease phương pháp so màu Nessler 66 2.2.6.2Định lượng protein phương pháp Bradford 69 2.2.7 Phân tích urea 71 2.2.7 Phương pháp so màu .71 2.2.7.2Phương pháp biosensor 73 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .76 3.1 CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE 76 3.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE LÊN CHẤT MANG CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ 78 3.2.1 Bề dày màng chitosan .78 3.2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch glutaraldehyde ngâm màng .80 3.2.3 Thời gian ngâm màng dung dịch glutaraldehyde 82 3.2.4 Ảnh hưởng pH dung dịch enzyme ngâm màng 83 3.2.5 Thời gian ngâm màng dung dịch enzyme .84 3.3 HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN CHẤT MANG CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ 86 3.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ 88 3.4.1 Khảo sát tính chất động học enzyme urease cố định 88 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease cố định 90 3.4.3 Khảo sát độ bền nhiệt enzyme urease cố định 92 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính enzyme urease cố định 3.4.5 .94 Khảo sát ảnh hưởng loại đệm khác đến hoạt tính enzyme urease cố định 96 3.4.6 Khảo sát khả bảo quản enzyme urease cố định .97 3.4.7 Khảo sát chế độ bảo quản enzyme urease cố định 99 3.4.8 Khảo sát khả tái sử dụng enzyme urease cố định .101 4.5 Phân tích ure 102 4.5.1 Xác định giới hạn phát ure màng urease 103 4.5.2 Bước đầu ứng dụng phương pháp biosensor (sử dụng enzyme cố định) phát ure mẫu thực phẩm 106 4.5.2.1Xác định hàm lượng ure sữa tươi 106 4.5.2.2Xác định hàm lượng urea nước mắm phương pháp biosensor 110 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .114 4.1 KẾT LUẬN 114 4.2 KIẾN NGHỊ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO .119 PHỤ LỤC .131 Tài liệu tham khảo 59 CBHD: TS Trần Bích Lam M.H.Gil et al (1992) Covalent binding of urease on ammonium-selective potentiometric membranes Biosensors & bioelectronics, 7, 645-652 60 M.L.Hamlaoui et al (2002) Development of a urea bisensor based on a polymeric membrane including zeolite Biosensors & bioelectronics, 9, 39-45 61 M Srinivasa Rao, M Chellapandian and M.R.V Krishnan (1995) Immobilization of urease on gelatin – poly (HEMA) copolymer Bioprocess Engineering, 13, 211-214 62 Miroslav Stred’anský et al (2000) Amperometric pH-sensing biosensor for urea, penicillin, and oxalacetate Analytica Chimica Acta , 415, 151157 63 Mustafa Teke et al (2007) A bio-imprinted urease biosensor: Improved thermal and operatical stabilities Talanta, 1-20 64 N.F.Olson and Richardson (1974) Symposium: Immobilized enzymes in food processing and analysis Journal of Food Science, 39, 653-660 65 N Tinkilic, O Cubuk and I Isildak (2002) Glucose and urea biosensors based on all solid-state PVC-NH2 membrane electrodes Analytica Chimica Acta , 452, 29-34 66 Nilanjana Das et al (1997) Enzyme entrapped inside the reversed micelle in the fabrication of a new urea sensor Biotechnol Bioeng , 54, 329-332 67 Norman F.Sheppard, Jr and David J.Mears (1996) Model of an immobilized urease conductimetric urea biosensor Biosensors & Bioelectronics, 11, 967-979 68 O.A Boubriak (1995) Determination of urea in blood serum by a urease biosensorb based on an ion-sensitive field-effect transistor Sensors and Actuators B, 26-27, 429-431 125 Tài liệu tham khảo 69 CBHD: TS Trần Bích Lam P.Bertocci and D.Compagnone (1996.) Amperometric ammonium ion and urea determination with enzyme based probes Biosemors & Bioelecfronics, Vol 11, No l/2, l-10 70 P.C.Pandey et al (2000) A new solid state pH sensor and its application in the construction of all solid state urea biosensor Electroanalysis, 12, 517-521 71 Piedade A.P., Guthrie J.T and Kazlauciunas A (1995) Characterization of cellulose derivatives-relevance to sensor development Cellulose , 2, 243-263 72 Pier Giorgio Pietta et al (1997) Assay of urea by immobilized urease coupled to a differential pH-meter Annals New York Academy of Sciences, 257-263 73 Pogorilyi et al (2007) Immobilization of urease on the silica gel surface by Sol – Gel method Russian Journal of Applied Chemistry, 80, 330-334 74 R.Ilanggovan et al (2006) Enzyme based biosensor for heavy metal ions determination Biotechnol & Biotechnol , 159, 184-189 75 R.Schler, M.W.ittkampf and G.C.Chemnitius (1999) Modified gaspermeable silicone rubber membranes for covalent immobilisation of enzymes and their use in biosensor development Biomaterials, 25, 654662 76 Rachana Sahney et al (2006) A comparative study of immobilization techniques for urease onglass-pH-electrode and its application in urea detection in blood serum Analytica Chimica Acta , 578, 156-161 77 Rajesh et al (2005) An Amperometric urea biosensor based on covalent immobilization of urease onto an electrochemically prepared copolymer poly(N-3-aminopropyl pyrrole-co-pyrrole) film Biomaterials, 26, 36833690 126 Tài liệu tham khảo 78 CBHD: TS Trần Bích Lam Robert Koncki, Gerhard J.Mohr and Otto S.Wolfbeis (1995) Enzyme biosensor for urea based on a novel pH bulk optode membrane Biosensors & Bioelectronics, 10, 653-659 79 Robert Koncki, Agnieszka Chudzik and Izabela Walcerz (1999) Urea determination using pH-enzyme electrode Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21, 51-57 80 Robert Koncki et al (1992) Urea sensors based on glass pH electrodes with physically immobilized urease Analytica Chemica Acta , 257, 6772 81 S.Bolal Butt and Karl Cammann (1992) Enzyme urea biosensor based on a modified potentiometric PVC-Nonactin membrane electrode for assay of urea in blood Analytical letters, 25, 1597-1615 82 S.George et al (1996) Flow rate dependent kinetics of urease immobilized onto diverse matrices Bioprocess Engineering, 15, pp.311315 83 S.I.Dikhtyarev et al (1983) Isolation of a urease from watermelon seeds and the study of its properties Khimiya PrirodnykhSoedlnenll, 5, 624628 84 S.Milardovic, I.Kruhak and B.S.Grabaric (1999) Urea determination in FIA mode by a newly designed urease-based biosensor LRA, 11, 266– 271 85 S.Rejikumar and Surekha Devi (1998) Preparation and characterization of urease bound on crosslinked poly(vinyl alcohol) Journal of Molecular Catalysis B: Enzyme, 4, 61-66 86 S.Zamponi et al (1996) Urea solid-state biosensor suitable for continuous dialysis control Talanta , 43, 1373-1377 127 Tài liệu tham khảo 87 CBHD: TS Trần Bích Lam Sang-Mok Lee and Won-Yong Lee (2002) Determination of heavy metal ions using conductometric biosensors based on sol-gel-immobilixed urease Bull Korean Chem Soc , 23, 1169-1172 88 Sedov A.A et al (1977) Cellulose acetate fibre containing immobilized urease J Biol Chem , 4, 39-40 89 Sevdalina Turmanova, Tzonka Godjevargova and Nastia Vasileva (2005) Immobilization of urease on cation-exchange membranes prepared by radiation-initiated graft copolymerization of acrylic acid on polyethene thin films Polymer Bulletin, 55, 467–475 90 Shul’ga A.A., Soldatkin A.P and El’skaya A.V (1994) Thin-film conductometric biosensors for glucose and urea determination Biosensors & bioelectronics, 9, 217-223 91 Sibel Sungur, Murat Elỗin and Ural Akbulut (1992) Immobilization of urease into carboxymethulcellulose Journal of Macromolecular Science A, 29, 251-265 92 Soldatkin A.P., Volotovsky V and Martelet C (2000) Improvement of urease based biosensor characteristics using additional layers of charged polymers Analytica Chimica Acta , 403, 25-29 93 Sumner J.B (1932) The isolation and crystallization of the enzyme urease Corell University Medical College, Ithaca, 316 – 325 94 Tadeusz Krawczyński vel Krawczyk, Malgorzata Moszczyń ska and Marek Trojanowicz (2000) Inhibitive determination of mercury and other metal ions by potentiometric urea biosensor Biosensors & Bioelectronics, 15, 681-691 95 Thomas Jahns (1995) Purification and properties of urease from Sporobolomyces roseus Antonie van Leeuwenhoek, 68, 209-214 128 Tài liệu tham khảo 96 CBHD: TS Trần Bích Lam Timothy D.Rhines and M A.Arnold (1999) Fiber-optic biosensor for urea based on sensing of ammonia gas Analytica Chimica Acta , 227, 387-396 97 U.Bilitewski, W.Drewes R.D.Schimid (1992) Thick film biosensors for urea Sensors and Actuators B, 7, 321-326 98 Udo Klaus Schfer and Heinrich Kaltwasser (1994) Urease from Staphylococcus saprophyticus: Purification, characterization and comparison to Staphylococcus xylosus urease Arch Microbiol , 161, 393-399 99 Vandana Gupta (2003) Design, fabrication and performance evaluation of an impedimetric urea biosensor system, 191 100 Viatcheslav Volotovsky, Young Jung Nam and Nam soo Kim (1997) Urease – based biosensor for mercuric ions determination Sensors and Actuators B, 42, 233-237 101 Won-Yong Lee et al (2000) Microfabricated Conductometric Urea BiosensorBased on Sol-Gel Immobilized Urease Electroanalysis, 12, 7882 102 Xiangfang Xie, Ahmad A Suleiman and George G.Guilbault (1990) A urea fiber optic biosensor based on absorption measurement Analytical letters, 23, 2143-2153 103 Yingjie Qin and Joaquim M.S.Cabral (2002) Review Properties and Applications of Urease Biocatalysis and Biotransformation, 20, 1-14 104 Yukitaka Yamamoto (1995) Amperometric ammonium ion sensor and its application to biosensors Sensors and Actuators B, 13-14, 57-60 INTERNET 105 http://www.chemie.uniregensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keus ch/chembox_urease-e.htm 129 Tài liệu tham khảo CBHD: TS Trần Bích Lam 106 www.doflick.com 107 http://www.funpecrp.com.br/GMR/year2005/vol2-4/Pb14_full_text.html 108 http://www.medscape.com/viewarticle/488068_2 109 http://ocw.tufts.edu/Content/48/lecturenotes/598665/598722 110 http://geoweb.princeton.edu/research/biocomplexity/collier.html 111 http://www.scienceinschool.org/2008/issue9/urease 112 http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?go=page&name=Pages 1&pid=83 113 http://www.ufrgs.br/laprotox/cntx-urease-eng.htm 114 www.uni-regensburg.de/chembox_urease.htm 115 http://www.urc.cc/bio_r.htm 116 http://vi.wikipedia.org/wiki/Ur%C3%AA 117 http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/categoryId 11/productId 1838/ 130 Phụ lục CBHD: TS Trần Bích Lam PHỤ LỤC Một số phương pháp công thức tính tốn 1.1 Các cơng thức tính tốn ¾ Giá trị nồng độ trung bình ¾ Giá trị tín hiệu trung bình: ¾ Độ lệch chuẩn giá trị đo: Hoặc ¾ Độ lệch chuẩn giá trị trung bình: ¾ Khoảng tin cậy: CI = ¾ Độ biến động phép đo: RSD = Kết chấp nhận RSD độ