Đánh giá Chẩn đoán ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ bằng các phương pháp dựa trên PCR

Đánh giá - Chẩn đoán ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ phương pháp dựa PCR (PCR-based diagnostic methods for ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ – Review ) Seyed Mahyar Mirmajlessi* Email: seyedmahyar.mirmajlessi@ugent.be Received: October 15, 2018 Accepted: May 28, 2019 GVHD: Lê Thanh Toàn Tháng 04/2020 Sinh viên thực hiện: Lê Quốc Cảnh B1604463 Võ Tấn Phát B1703887 Nguyễn Thị Cẩm Tú B1703905 ✔ Tổng quan ✔ Phạm vi nghiên cứu ✔ Các phương pháp PCR ✔ Các phương pháp xác định mầm bệnh ✔ Thảo luận ✔ Kết luận ✔ Tài liệu tham khảo NỘI DUNG I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU Tổng hợp, so sánh, đánh giá  53 nghiên cứu  Các phương pháp dựa PCR  Các phương pháp xác định mầm bệnh trình tự gen “Candidatus Liberibacter solanacearum” => Real-time PCR/gen16SrRNA tối ưu II ĐỐI TƯỢNG: “Candidatus Liberibacter solanacearum” (Clso) Những lát củ khoai tây bị bệnh sọc nâu Nguồn: Dr Lia Liefting Chồi khoai tây bị nhiễm Ca L solanacearum Nguồn: Dr Lia Liefting Cà chua bị nhiễm Ca L solanacearum Nguồn: Dr Lia Liefting Các giai đoạn vectơ TPP Nguồn: Mike Lewis (a), Joseph E Munyaneza (b) and J Kelly Clark (c, d) • Gram âm, khơng ni cấy • Vectơ: rầy The potato psyllish (TPP) (Bactericera Cockerelli) • Trong máu, tuyến nước bọt TPP => mạch libe Chuẩn bị mẫu DNA Mẫu thu thập nhiều khu vực quốc gia • Lá non • DNA độ cao Dùng kit trích xuất DNA • Ảnh hưởng lớn Không khác biệt đến kết • Dương tính giả X Phương pháp CTAB III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR) PCRđa đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/mPCR) (Multiplex PCR/mPCR) PCRđịnh địnhlượng lượng PCR (Real-time PCR/rtPCR) (Real-time PCR/rtPCR) PCRlồng lồng PCR (Nested PCR/nPCR) (Nested PCR/nPCR) PCRvòm vòm PCR (loop-mediated isothermal amplification) (loop-mediated isothermal amplification) III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR)  Dùng (hoặc vài) cặp mồi đặc hiệu  Sử dụng rộng rãi để phát CLso Tốn độgen nhạy không  Mồithời thiếtgian, kế cho 16SrRNA ổn định, dễ nhiễm bẩn => Thêm enzym III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR) PCRđa đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/mPCR) (Multiplex PCR/mPCR)  Khuếch đại nhiều trình tự DNA phản ứng  Sử dụng nhiều cặp mồi  Độ tin cậy cao, giảm âm tính giả X Độ nhạy khơng ổn định tốn thời gian III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR) PCRđa đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/mPCR) (Multiplex PCR/mPCR) PCR lồng PCR (Nested lồng PCR/nPCR) (Nested PCR/nPCR)  Dùng cặp mồi khuếch đại 01 trình tự DNA  Sản phẩm vịng làm khn cho vòng 2 Độ PCRnhạy cao, giảm tác dụng chất ức chế PCR X Gây dương tính giả nhiễm chéo hổn hợp phản ứng III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR) PCRđa đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/mPCR) (Multiplex PCR/mPCR)  Dựa cường độ phát huỳnh quang  Cho biết lượng DNA thời điểm phản ứng PCR lồng PCR lồng (Nested PCR/nPCR) (Nested PCR/nPCR) PCRđịnh địnhlượng lượng PCR (Real-time PCR/rtPCR) (Real-time PCR/rtPCR) Vùng gen 16SrRNA sử dụng phổ biến để thiết kế mồi rtPCR để phát Lso Độ nhạy gấp từ 10 đến 100 lần so với xét nghiệm cPCR III.Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/cPCR) (Conventional PCR/cPCR) PCRđa đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/mPCR) (Multiplex PCR/mPCR) PCR lồng PCR lồng (Nested PCR/nPCR) (Nested PCR/nPCR) PCRđịnh địnhlượng lượng PCR (Real-time PCR/rtPCR) (Real-time PCR/rtPCR) PCRvòm vòm PCR (loop-mediated isothermal amplification) (loop-mediated isothermal amplification) Dùng mồi đặc hiệu dể nhận biết vùng khác gen đích từ khn Chỉ đáng tin cậy sử dụng mồi đặc hiệu cho gen 16SrRNA Đòi hỏi kỹ thuật cao thiết bị IV Xác định mần bệnh kiểu gen Kỹ thuật giải trình tự Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản Kỹ thuật giải trình tự gen nhiều locus Kỹ thuật giải trình tự Gen 16SrRNA Gen 16S/23S rDNA Khoảng đệm 16S-23S cóđể biến thểbiệt cao - Dùng để thiết kế mồi phân biến đổichiều gen dài trình tự so với 16SrDNA  Phân 16S để xáckhó địnhxác cácđịnh mốimối => đa tích dạng di truyền thấp, quan hệ loài.  loài di truyền + MồiOA2 LsoTXF/R - Mồi / OI2c cho gen 16S-23S-ITS rDNA gen 50SrRNA => Phát đa hình nucleotide liên => E gen 16SrRNA kết xác giữađịnh mồiLso OA2hotype vị trí + Mồi OA2 / OI2c Lso haplotypes C cho B.gen 16S rRNA mồi CL514F/R cho 50S rplJ-rplL => làm giảm độgen đặcribosome hiệu độ nhạy mồi => Xác định haplotypes D E OA2 / OI2c Kết phân tích mẫu bệnh Phần Lan  Trong carot, đồng nhiễm haplotypes D E củ, haplotype D hạt  Trong mẫu khoai tây, đồng nhiễm haplotypes A B Pháp  Mồi thiết kế cho gen 16S-23S-ITS rRNA gen 50S rRNA  Trong cà rốt => Lso haplotype C củ D hạt 2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản Phát xác định kiểu gen chủng Lso họ solanaceous Phát đồng thời khác biệt haplotype liên quan đến bệnh vằn nâu  Ít tốn nhanh hơn, độ nhạy phát cao X Không thể phân biệt tất haplotype 3 Kỹ thuật giải trình tự gen nhiều locus Dùng đoạn DNA “gen giữ nhà” xác định kiểu gen đánh giá đa dạng di truyền quần thể Lso  Kiểm tra alen gen giữ nhà: Giải trình tự nucleotide phân đoạn 500 đến 600 bp Dữ liệu phân tích để xác định giống di truyền V Thảo luận So với cPCR, rtPCR xác, đáng tin cậy dễ phát thông lượng DNA mục tiêu mức thấp diện tiềm ẩn mầm bệnh Công nghệ rtPCR khuếch đại đoạn DNA ngắn (70 đến 100 bp) cho hiệu cao so với cPCR Các mồi phương pháp cPCR điều chỉnh để sử dụng rtPCR VI Kết luận Từ đánh giá, rtPCR ưu tiên sử dụng dự báo bệnh với độ tin cậy, độ nhạy cao cung cấp liệu định lượng cần thiết việc phân tích biện pháp kiểm soát Candidatus Liberibacter solanacearum ... III .Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/ cPCR) (Conventional PCR/ cPCR) PCR? ?a đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/ mPCR) (Multiplex PCR/ mPCR) PCR. .. III .Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/ cPCR) (Conventional PCR/ cPCR) PCR? ?a đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/ mPCR) (Multiplex PCR/ mPCR)  Dựa. .. nghiệm cPCR III .Các Cácphương phươngpháp phápPCR PCR III PCRthông thôngthường thường PCR (Conventional PCR/ cPCR) (Conventional PCR/ cPCR) PCR? ?a đamồi mồi PCR (Multiplex PCR/ mPCR) (Multiplex PCR/ mPCR)