Erythropoietin Tổng quan về Erythropoietin và quy trình sản xuất Erythropoietin người tái tổ hợp

 CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH Tên chuyên đề: SẢN XUẤT ERYTHROPOIETIN NGƯỜI TÁI TỔ HỢP  TP.HCM – 2021 Mục lục Tóm tắt Giới thiệu Nội dung 3 3.1 Erythropoietin cấu trúc chế tác dụng 3.2 Sản xuất Erythropoietin Kết luận 10 Tài liệu tham khảo 11 Tóm tắt Erythropoietin một hormone có cấu trúc glycoprotein, gồm chuỗi polypeptid có gắn nhiều chuỗi carbohydrate Erythropoitein tiết gan thận Khi nồng độ oxi máu giảm thiếu máu kích thích tiết Erythromycin Đây mợt hormone có tác dụng kích hoạt biệt hóa tế bào q trình tạo hồng cầu, từ giúp khắc phục tình trạng thiếu máu Do Erythromycin ứng dụng điều trị một số bệnh lý thiếu máu mạn tính Ngồi Erythropoietin cịn có tác dụng bảo vệ thần kinh não bị thiếu oxi Hiện nay, EPO người thường sản xuất theo phương pháp nuôi cấy tế bào tái tổ hợp gen Với bước khởi đầu, trình tự gen EPO xác định, đưa vào vector tạo dịng Sau vector chuyển vào tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary) để nuôi cấy Erythropoietin tinh khiết thu qua nhiều lần sắc ký Giới thiệu Năm 1977 Miyake Goldwasser tinh chế EPO hoạt tính cao từ nước tiểu bệnh nhân thiếu máu bất sản [1].Nhờ đó mà biết thông tin từ cấu trúc EPO Năm 1985, hai nhóm nghiên cứu đợc lập Lin [2] Jacobs [3] phân lập thành công gen EPO Để tồn lâu cho tác dụng in vivo phân tử erythropoietin phải glycosyl hóa Do q trình glycosyl hóa phức tạp, rhEPO sản xuất chủ yếu tế bào động vật có vú bao gồm CHO, thận chuột non (BHK), tế bào sarcoma xơ người (HT1080) Các vi khuẩn Escherichia coli Bacillus brevis có nhiều lợi điểm hiệu suất sản xuất không có khả glycosylate rhEPO nên hiện không dùng sản xuất Đặc biệt, Pichia pastoris, một loại nấm men methylotropic sử dụng rộng rãi để biểu hiện protein, biểu hiện glycoprotein với glycans mannose cao, có khả gây miễn dịch người làm giảm thời gian bán hủy huyết Dù vậy, tế bào CHO tế bào chủ cho sản xuất rEPO thương mại, hiện bán thị trường ổn định bao gồm Mỹ EU [4] Đây tế bào có số lượng nghiêng cứu lớn, tối ưu hóa cho sản xuất Với phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học, sản phẩm rHuEPO đa glycosyl hóa nghiên cứu giới thiệu gần với tên gọi Protein kích thích sinh hồng cầu hệ mới (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein hay NESP), tên khác Darbepoetinalfa [5] Nội dung 3.1 Erythropoietin cấu trúc chế tác dụng 3.1.1 Cấu trúc Erythropoietin, gọi hematopoietin, một hormon glycopoietin nội sinh, khối lượng phân tử khoảng 30,4 kDa Các chuỗi carbohydrat có vai trò quan trọng việc kéo dài thời gian lưu EPO hệ tuần hoàn giúp EPO thể hiện hoạt tính sinh học in vivo [4] EPO sản xuất chủ yếu nguyên bào sợi kẽ thận một phần gan EPO tự nhiên chiết tách từ nước tiểu EPO tái tổ hợp giống trình tự acid amin, vị trí cầu nối disulfid, vị trí glycosyl hóa cấu trúc bậc (Hình 2.1) EPO tự nhiên trưởng thành có 166 acid amin, sau đó arginin số 166 đầu tận carbonyl cắt bỏ EPO phóng thích vào hệ tuần hồn có chuỗi peptid gồm 165 acid amin – tương tự chuỗi peptid EPO tái tổ hợp [2] Các chuỗi carbohydrat (glycosyl) chiếm 40% khối lượng phân tử EPO, protein có N-glycan O-glycan Trong đó, chuỗi gắn vào đầu nitơ ASP số 24, 38, 83, chuỗi glycosyl lại gắn vào đầu oxi SER số 126 Mỗi chuỗi glycosyl đầu nitơ aspartat chia làm vùng, theo thứ tự từ phía đầu nitơ aspartyl là: vùng lõi, vùng nhánh vùng tận Vùng lõi gồm nhiều phân tử mannose N-acetylglucosamin, có vai trị việc hồn chỉnh cấu trúc EPO Vùng nhánh gồm tiểu đơn vị N- acetylglucosamin, giúp EPO ổn định hệ tuần hồn, mức đợ phân nhánh cho tương quan với mức độ thể hiện hoạt tính sinh học, ngồi vùng nhánh cịn có vai trị bổ trợ cho vùng tận Vùng tận cấu tạo đơn vị acid sialic, poly-N-acetyllactosamin galactose, có vai trị trị việc gắn kết EPO với receptor, tương tác với phân tử sinh học khác liên quan trực tiếp đến hoạt tính sinh học in vivo Nói chung gắn chuỗi glycosyl vô cần thiết cho ổn định phân tử, tăng thời gian lưu hệ tuần hoàn (T1/2 lên đến giờ) khả biểu hiện hoạt tính sinh học Điều vơ ý nghĩa lâm sàng cho phép giảm liều giảm số lần tiêm EPO, từ đó giảm nguy tác dụng phụ, gia tăng tuân thủ trị liệu [6] Hình 3.1 Cấu trúc EPO [5] 3.1.2 Cơ chế tác dụng EPO có vai trị điều hịa q trình tạo hồng cầu Đây mợt cytokine quan trọng việc hình thành tế bào tiền hồng cầu tủy xương [7] Sự thiếu hụt oxy máu dẫn đến kích thích phiên mã gen EPO, làm tăng EPO máu EPO tác động lên tế bào BFU-E CFU-E (chủ yếu CFU-E), thúc đẩy biệt hóa tạo tế bào hồng cầu trưởng thành [8] Hình 3.2 Vị trí tham gia EPO q trình biệt hóa tế bào hơng cầu [7] EPO thể hiện tác dụng sinh học cách gắn vào receptor erythropoietin, tḥc nhóm receptor cytokin Số lượng receptor erythropoietin thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn biệt hóa hồng cầu Số lượng receptor tăng cao vào giai đoạn có tế bào dòng hồng cầu tế bào tiền hồng cầu Sự gắn EPO vào receptor chuyên biệt dẫn đến dimer hóa receptor, sau đó gây tín hiệu tế bào thơng qua hệ thống JAK2/STATS, G- protein, kênh calci kinase [5] Hình 3.3 Cơ chế tác dụng EPO [4]s 3.2 Sản xuất Erythropoietin 3.2.1 Tạo dòng tế bào Vector tạo dòng Vector mang gen tái tổ hợp gồm có: - Promoter SV40 với vai trò promoter cho phiên mã biểu hiện EPO, mang trình tự tăng cường khởi đầu chép - Vùng gân SV40 qui định chuỗi polyadenyl (trình tự kết thúc) - Minigen mã hóa việc tạo dihydrofolat reductase chuột Minigen gắn chung với gen EPO, nên kích thích nhân đơi minigen tạo dihyfrofolat reductase kích thích gen EPO (gen DHFR tế bào bị bất hoạt kỹ thuật zinc-finger nuclease [9]) Methotrxat thêm vào môi trường nuôi cấy để ứng chế enzyme dihydrofolat reductase Lúc đó, chế điều hịa ngược thiếu hụt dihyrofolat reductase hoạt hóa minigen [10], [11] - pBR322: chứa điểm khởi đầu chép gen kháng ampicillin (Amp) từ plasmid để nhân lên chọn lọc E coli (vector nhân lên vi khuẩn) - Vị trí cắt giới hạn BamHI Hình 3.4 Vector mang gen EPO tái tổ hợp [10] Dòng tế bào chủ chọn CHO DUK XB 11, mợt dịng nhỏ từ tế bào buồng trứng cḥt lang Trung Hoa CHO K1 Các tế bào sau chuyển gen liên tục sàng lọc để xác định tế bào có hiệu suất cao Các tế bào tối ưu dùng để lập ngân hàng tế bào để dùng cho hoạt động sản xuất Tối ưu hóa dịng tế bào Như đề cập phía trên, glycosyl hóa mợt bước quan trọng để tạo nên Erythrompoietin có hoạt tính in vivo Với N-acetylglucosaminyltransferases I, II, IV, V enzyme xúc tác cho q trình glyconsyl hóa này, vậy khả biểu hiện gen enzyme cần cải thiện để gia tăng hiệu sản xuất Trong Mgat1 Mgat4 lựa chọn để nghiêng cứu có mức đợ biểu hiện thấp Các gen chuyển vào tế bào, từ chọn lọc dịng tế bào có khả sialyl hóa tốt [12] Các tế bào CHO-K1 xử lý với độc tố Ricinus communis agglutinin I (RCA-I) để chọn lọc tế bào thiếu N-acetylglucosaminyltransferase I (GnT I) Để khơi phục lại GnT1 từ gia tăng sialyl hóa Những tế bào đặt tên CHO-Gmt4 Dòng tế bào CHOGmt4 bị bất hoạt dihydrofolat reductase (DHFR) kỹ thuật zinc-finger nuclease [9] để tạo dòng tế bào nhận vector chọn lọc 3.2.2 Qui trình sản xuất [11] Việc nuôi cấy dịch truyền tuân theo quy trình vận hành tiêu chuẩn Tập đồn Dược phẩm sinh học Shandong E-Hua, Ltd Việc nuôi cấy tiến hành bồn nuôi cấy CelliGen 5-L (New Brunswick Scientific, Edison, NJ), trang bị Đĩa Fibra-Cel® để hỗ trợ đính tế bào Nồng đợ oxy hịa tan kiểm sốt đợ bão hịa khơng khí 60%, pH nuôi cấy giữ 7,0 ± 0,05 cách bổ sung NaOH khí CO2 Nhiệt đợ ni cấy kiểm sốt 37 ± 0,1 ° C Tốc độ truyền dịch điều chỉnh để trì nồng đợ glucose mơi trường ni cấy mức 0,5–1,0 g / L suốt Trong nuôi cấy quy mô lớn, tế bào nuôi chai lăn Đây công nghệ giúp đơn giản quy trình với tốc đợ quay thích hợp Phương phấp chai lăn tự đợng hóa với nhiều ưu điểm: tính lặp lại lơ, suất cao, dễ kiểm soát quy trinh theo dõi phát triển tế bào, giảm nguy nhiễm Hệ thống sản xuất đặt phòng thiết kế để hạn chế nhiễm yếu tố ngoại lai protein, chí nhiệt tố, vi khuẩn [13] Ni cấy chia thành hai giai đoạn, giai đoạn tăng trưởng giai đoạn sản xuất Trong giai đoạn tăng trưởng, tế bào phát triển theo cấp số nhân tám chai lăn thu thập cấy khoảng × 106 tế bào / mL vào lị phản ứng sinh học với thể tích làm việc 3,5 L phép gắn vào Đĩa Fibra-Cel® Các tế bào nuôi cấy chế độ tưới máu DMEM / F12 với FBS nồng độ huyết giảm dần từ 10, 8, xuống 6,5% trước môi trường chuyển sang môi trường không có huyết Trong giai đoạn sản xuất, hệ thống nuôi cấy rửa hai lần PBS để loại bỏ hàm lượng huyết Sau đó, CHO-S-SFM II (Life Technologies) với 0,5 mM natri butyrat sử dụng để trì sản xuất EPO Tốc đợ truyền dịch điều chỉnh theo tốc đợ hấp thu glucose lị phản ứng sinh học Tốc độ khuấy bánh công tác trì 120 vịng / phút Hiệu giá EPO đo bộ EPO ELISA (Hệ thống R&D, MN, Hoa Kỳ) 3.2.3 Tinh chế [11] Mỗi lần thu hoạch 20 L lọc với 0,45 µm để loại bỏ mảnh vụn tế bào, sau đó dịch nuôi cấy có chứa EPO nạp vào một cột chứa gel CM Affi-Gel Blue (BioRad) để thu giữ hầu hết protein bao gồm EPO Hầu hết chất màu, axit nucleic một số protein không liên kết với cột loại bỏ bước EPO liên kết với cột rửa giải khử muối cột Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) trước đó nạp vào cột dietylaminoetanol (DEAE) Sepharose (Bio-Rad) để loại bỏ hầu hết protein khác Do quy trình khơng tối ưu hóa để tinh chế EPO phần phía thu từ nuôi cấy CHO-Gmt4D-GnT I, EPO tinh chế bước sắc ký DEAE Sepharose không tinh khiết EPO tinh chế từ dịng tế bào thơng thường nuôi cấy giai đoạn Do đó, cột pha đảo C4 (Amersham Pharmacia Biotech) cột QSephadex (Bio-Rad) sử dụng để tiếp tục loại bỏ mảnh protein tế bào mà không làm EPO Để tinh chế đồng dạng sialyl hóa cao EPO loại bỏ đồng dạng sialyl hóa hơn, mẫu tinh chế thêm một cột DEAE Sepharose khác Kết luận Erythropoietin một chế phẩm sinh học có tác đụng điều trị hỗ trọ nhiều bệnh lý nguy hiểm Cùng với EPO nghiên cứu từ lâu với tảng phát triền sinh học phân tử, sản phẩm erythropoiettin ngày cải tiến Trong sản xuất, điểm mấu chốt lựa chọn tế bào chủ phải glycosyl hóa đúng, từ chuyển vector tạo dòng vào tế bào chọn lọc lại Để tối ưu hóa quy trình cần ln cải tiến kiểm tra tế bào chủ quy trình tạo dịng Từ đó, tối ưu nắm vững thơng số q trình ni cấy Cuối cùng, giai đoạn tinh chế chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cải tiến để có số bước đạt hiệu suất cao 10 Tài liệu tham khảo [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Miyake T et al (1977), "Purification of human erythropoietin", Journal of Biological 252 (15), pp 5558-5564 Lin F.-K et al (1985), "Cloning and expression of the human erythropoietin gene", Proceedings of the National Academy of Sciences 82 (22), pp 7580-7584 Jacobs K et al (1985), "Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin", Nature 313 (6005), pp 806-810 Lee J S et al (2012), "Current state and perspectives on erythropoietin production", Applied microbiology biotechnology 95 (6), pp 1405-1416 Ng T et al (2003), "Recombinant erythropoietin in clinical practice", Postgraduate Medical Journal 79 (933), pp 367-376 Jelkmann W J P r (1992), "Erythropoietin: structure, control of production, and function", Physiological reviews 72 (2), pp 449-489 Socolovsky M et al (1998), "Control of hematopoietic differentiation: lack of specificity in signaling by cytokine receptors", Proceedings of the National Academy of Sciences 95 (12), pp 6573-6575 Đông T C (2019), Sản xuất nguyên liệu dược Công nghệ sinh học, NXB Y học, pp 69-74 Doyon Y et al (2008), "Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases", Nature biotechnology 26 (6), pp 702-708 Inoue N et al (1995), "The production of recombinant human erythropoietin", Biotechnology Annual Review, Elsevier, pp 297-313 Goh J S et al (2014), "Highly sialylated recombinant human erythropoietin production in large‐scale perfusion bioreactor utilizing CHO‐gmt4 (JW152) with restored GnT I function", Biotechnology Journal (1), pp 100-109 Gurramkonda C et al (2018), "Improving the recombinant human erythropoietin glycosylation using microsome supplementation in CHO cell‐free system", Biotechnology bioengineering 115 (5), pp 1253-1264 Chu L et al (2001), "Industrial choices for protein production by large-scale cell culture", Current opinion in biotechnology 12 (2), pp 180-187 11 ... Hiện nay, EPO người thường sản xuất theo phương pháp nuôi cấy tế bào tái tổ hợp gen Với bước khởi đầu, trình tự gen EPO xác định, đưa vào vector tạo dòng Sau vector chuyển vào tế bào CHO (Chinese... EPO [4]s 3.2 Sản xuất Erythropoietin 3.2.1 Tạo dòng tế bào Vector tạo dòng Vector mang gen tái tổ hợp gồm có: - Promoter SV40 với vai trò promoter cho phiên mã biểu hiện EPO, mang trình tự tăng... Trong sản xuất, điểm mấu chốt lựa chọn tế bào chủ phải glycosyl hóa đúng, từ chuyển vector tạo dòng vào tế bào chọn lọc lại Để tối ưu hóa quy trình cần ln cải tiến kiểm tra tế bào chủ quy trình