Thật vậy sự thúc đẩy để lƣợng định tính khả chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt là tế bào thực vật đã đƣợc loại bỏ vách tế bào bằng enzym nhƣ trong trƣờng hợp tế bào trầ[r]
(1)Chƣơng NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
5.1 Giới thiệu chung nuôi cấy tế bào trần
Việc giới thiệu quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật (Cooking 1960) đƣa mặt đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật nuôi cấy mô mở lĩnh vực sinh học tế bào thực vật Điều làm cho tế bào trần có tác động mạnh nhƣ hệ thống thí nghiệm hệ enzyme phân hủy vách tế bào làm lộ bề mặt màng tế bào nhƣ rào cản mơi trƣờng bên ngồi thành phần bên tế bào Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa thí nghiệm đƣợc thiết lập để nghiên cứu thao tác thuộc tính màng tế bào điều mà khơng thể thực đƣợc bị bao phủ vách tế bào Tế bào trần đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu tính chất vật lý màng sinh chất (Ruesink 1973) đến nghiên cứu nhập bào hấp thu phần tử (Willison et al 1971), bào quan (Potrykus 1975) vi sinh vật (Davey Power 1975) Hơn nữa, tính sẵn sàng sử dụng tế bào trần cho phƣơng pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận bào quan đại phân tử mà không gặp phải biến dạng hƣ hỏng nhƣ phƣơng pháp ly trích thơng thƣờng (Howland et al 1975) Rất dễ nhanh chóng nhận thấy tính chất màng sinh chất dƣới số điều kiện thuận lợi chịu dung hợp có khả hình thành tế bào lai, cuối dẫn đến tạo tế bào lai sinh dƣỡng liên quan đến cải thiện suất thu hoạch mùa vụ (Nickell Torey 1969) Do tế bào cách ly với tế bào khác quần thể tế bào trần hệ thống đơn bào nên thao tác tƣơng tự nhƣ quần thể vi sinh vật Tính chất đƣợc khai thác thành cơng thí nghiệm cho nhiễm đồng loạt virus (Takebe 1975), nuôi cấy nhân giống vơ tính tế bào phân lập tế bào đột biến
(2)trƣờng nuôi cấy Mơ sẹo đƣợc hình thành thúc đẩy tạo thành cành non sau thuốc nguyên vẹn (Takebe et al 1971) Cùng thời gan Kao et al (1970) quan sát tái tạo phân chia tế bào trần đậu nành môi trƣờng nuôi cấy Cuối năm 1970 chứng minh rõ ni cấy tế bào trần để tạo tập đồn tế bào cuối hoàn chỉnh trở nên quy trình nhiều phịng thí nghiệm, có nhiều lồi đƣợc nhân bội ổn định Tuy nhiên, cịn có số vấn đề cần khắc phục đƣợc nêu Evans Cocking (1978) môi trƣờng nuôi cấy, yếu tố vật lý môi trƣờng, yếu tố di truyền
(3)đƣợc mƣời năm gần việc tái tạo nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập từ nhƣng từ dịch treo nuôi cấy tế bào (Abdullah et al 1986) Thành công ban đầu lấy tế bào trần thuốc Petunia để tái tạo vách tế bào trải qua phân chia để tạo thành mô sẹo, sau phân hóa thành quan để tạo thành rể chồi non, làm lộ đƣờng nghiên cứu sai loại ngủ cốc Năm 1980 nhìn thấy đƣợc phƣơng pháp tinh vi mở rộng tái tạo lại nguyên vẹn từ gia tăng vững số loài sản xuất tế bào lai sinh dƣỡng cybrids, bao gồm ví dụ nhƣ cá thể khác lồi khơng có khả giao phối, Petunia parodii Petunia parviflora (Powder et al 1980) Quy trình đƣợc phát triển để tái tạo lại nguyên vẹn từ tế bào trần cô lập, khơng cho lúa, nhƣng cịn cà chua, đậu nành, hạt lanh, cải bắp, rau diếp lai sinh dƣỡng loài khác nhau, có máy di tuyền khác Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Glycine, Citrus, Brassica, Medicago Trifolium spp (Bajaj 1989a) Thêm vào quy trình đƣợc phát triển xa cho kỹ thuật vi tiêm, dung hợp điện, flow cytometry, hấp thu tích hợp DNA, lập nhân nhiễm sắc thể từ tế bào trần (Bajaj 1989b)
Việc khám phá tế bào trần bị nhiễm virus khảm thuốc (Cocking and Pojnar 1969) kích thích quan tâm vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm biểu plasmid Ti vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, đƣợc đƣa tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp chứng vai trò độc lập plasmid Ti khía cạnh (Davey et al 1980) Điều mở đƣờng cho việc sử dụng plasmid chuyển nạp trực tiếp cho tế bào trần dẫn đến việc tạo đƣợc loại rau ngũ cốc chuyển gen vụ thu hoạch trồng chuyển nạp trực tiếp DNA cho tế bào trần, bao gồm loại lúa chuyển gen có khả sinh sản theo phƣơng cách chuyển nạp điện xung vào tế bào trần lúa plasmids chimaeric (Zang et al 1988)
(4)1980 thời gian phối hợp kỹ thuật xác định plasmid Ti chuyển nạp hay khơng vào tế bào trần thực vật Nhƣ đề cập trƣớc nghiên cứu bao gồm tƣơng tác cấu trúc siêu xoắn plasmid Ti từ dòng octopine A tumefaciens với dịch treo tế bào trần Petunia hybrida với có mặt PLO, kết tạo tập đồn tế bào trần có biểu tính chất có vị đắng đỉnh tăng trƣởng mơi trƣờng có hormone tự tổng hợp octopine, hai mã hoá gen Ti T-DNA (Davey et al 1980) Deshayes et al (1985) đóng gói pGV23 NEO, plasmid mang gen aminoglycoside phosphotranspherase type II (APH II; neomycin phosphotranspherase, NTP II) từ Tn5 có khả kháng kanamycin tế bào thực vật, vào thể tích chất béo (liposome) dung hợp với plasmid có chứa túi tế bào trần thuốc sử dụng PEG Tập đồn tế bào kháng kanamycin đƣợc lập 4.0´105 Mẫu cắt hạn chế DNA đƣợc chèn vào trình chuyển gen vào tế bào thực vật đƣợc định theo cách tích hợp kế trình tự plasmid, bao hàm tái tổ hợp đồng dạng trình tự chuyển nạp Tiến chuyển nạp trực tiếp DNA vào tế bào trần đạt đƣợc đƣợc chứng minh trình tự T-DNA khơng cần thiết cho chuyển nạp ổn định biểu DNA lạ tế bào thực vật Một gen lai chọn lọc bao gồm vùng giải mã gen Tn5 NPII dƣới kiểm soát gen promoter CaMV VI đƣợc đƣa tế bào trần thuốc nhƣ phần E coli (pABCD1) cách xử lí hỗn hợp tế bào trần - plasmid PEG 6000 Tập đoàn chuyển nạp đƣợc chọn lọc mơi trƣờng có chứa mg/ml kanamycin Gen lạ đƣợc truyền qua cho hệ phép lai Mendel
(5)Rất hữu ích so sánh vài tính chất chuyển nạp tế bào trần thực vật tế bào động vật Thật thúc đẩy để lƣợng định tính khả chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt tế bào thực vật đƣợc loại bỏ vách tế bào enzym nhƣ trƣờng hợp tế bào trần thực vật, từ báo cáo nuôi cấy mơ tế bào động vật cho thấy có khả chọn biểu nhóm gen hệ gen DNA Bây hội xuất hệ đột biến đƣa đột biến gen vào tế bào trần thực vật tƣơng tác với DNA; chứng chứng tỏ mẫu DNA lớn đƣa vào biểu tế bào động vật (Allshire et al 1987)
(6)bào điều khiển phân tử
Có lẽ vấn đề quan tâm tƣơng tác lạ đại phân tử, viruses vi sinh vật màng tế bào tế bào trần Điện xung để hình thành lổ màng tế bào đƣợc dùng để khảo sát theo hƣớng Hơn nữa, điều chủ yếu tất vách tế bào phải đƣợc bỏ đi; lợi ích nghiên cứu nhiều mảng Nhƣ khám phá hoa sen Lotus dễ bỏ vách tế bào cách nhanh chóng đầu lông hút rễ xử lý rễ với hỗn hợp cellulase pectinase Gần quan sát cấu trúc nốt sần tạo rễ lúa, rễ cải cho dầu xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase pectinase cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium (Al-Mallah et al 1989 1990) Các nghiên cứu bao gồm phân hủy phần vách tế bào làm lộ phần màng sinh chất tế bào biểu mơ có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu cộng sinh Rhizobium trồng họ đậu (Cooking Davey 1991)
5.2 Phương pháp tách protoplast
Có phƣơng thức phân lập protoplast, là: - Cơ học (không dùng enzyme)
- Sử dụng enzyme (qua hai bƣớc) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời)
Phƣơng pháp học tiến hành dựa sở phá mối liên kết mô dao sắt nhọn (sharp-edged knife) giải phóng protoplast riêng rẽ Phƣơng pháp cho hiệu suất thấp Nói chung, protoplast thƣờng đƣợc phân lập từ tế bào không bào hóa cao mơ dự trữ nhƣ chồi hành vảy hành (bulbs and scales) loài thân hành, rễ củ cải (radish root), vỏ dƣa chuột (mesocarp of cucumber), rễ củ cải đƣờng (beet root)
Phƣơng pháp dùng enzyme có hiệu cao nhiều so với phƣơng pháp học, phƣơng pháp enzyme cho phép tách đƣợc hàng gram protoplast Các enzyme đƣợc sử dụng cellulase hoàn toàn không độc hại tế bào Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose phải sử dụng hỗn hợp enzyme: - Pectinase phân hủy pectin
- Cellulase phân hủy cellulose
- Hemicellulase phân hủy hemicellulose
(7)gồm có:
- Các enzyme (pectinase, cellulase, hemicellulase) từ 0,1-2% - Sorbitol (0,15 M) 27,3 g - Mannitol (0,15 M) 27,3 g
- Glucose (0,1 M) 18 g
- CaCl2.2H2O (6 mM) 441 mg - KH2PO4 (0,7 mM) 95 mg - Đệm MES1 (3 mM) 650 mg
- Điều chỉnh pH 5,6 khử trùng dung dịch enzyme màng lọc Millipore
Tùy theo đối tƣợng loại mơ thay đổi nồng độ enzyme cho thích hợp Vì protoplast thực chất tế bào trần khơng có thành tách đƣợc từ nhiều nguồn khác nhƣ: phận (lá, rễ, hạt phấn), callus, tế bào đơn …
Khác với tế bào vi sinh tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào cứng đƣợc tạo nhiều loại polime khác Thành tế bào có chức học, tạo khung xƣơng tế bào hệ màng liên kết tế bào với Thành phần hoá học tế bào phức tạp Celllose thành phần chủ yếu màng tế bào thực vật Cơng thức hố học tổng qt cellulose (C6H15O5)n Phân tử cellulose có hình sợi dài, chí dài với liên kết hàng nghìn phân tử đƣờng đơn với Ngồi cellulose cịn có hemicellulose, pectin, lignin, số chất béo chất khống, pectin cịn đóng vai trị quan trọng liên kết tế bào với
Tế bào trần (protoplast) tế bào đƣợc tách khỏi màng tế bào (một lớp polyme bao bọc tế bào) màng liên kết tế bào Các enzym đóng vai trị chủ yếu phân huỷ màng tế bào tạo tế bào trần cellulase pectinase Tế bào sau bị lớp màng cứng có dạng hình cầu dƣới áp suất thẩm thấu phù hợp môi trƣờng
Tế bào trần đƣợc tách từ mơ quan khác nhƣ lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro
Ƣu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào khơng có màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đƣợc đơn vị thể tích mơi trƣờng cao (đạt 106
(8)Hình 5.1 Các bƣớc ni cấy tế bào trần hông
Lá
Lá nguồn nguyên liệu thông dụng truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, cho phép phân lập đƣợc số lớn tế bào tƣơng đối đồng (relatively uniform cells) Protoplast phân lập từ qua năm bƣớc:
- Khử trùng
- Loại bỏ lớp tế bào biểu bì (epidermal cell layer) - Tiền xử lý enzyme
- Ủ enzyme
(9)Hình 5.2 Các bƣớc phân lập Protoplast từ Phƣơng pháp để tách tế bào trần từ
1 Khử trùng mẫu
2 Ngâm mẫu dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất Tách lớp mặt dƣới
4 Ngâm mẫu hỗn hợp enzym Tinh tế bào trần
(10)Hình 5.3 Phân lập protoplasts Echinacea purpurea (bar = 50 mm)
Hình 5.4 Sự phân chia protoplasts Echinacea purpurea (A) Phân chia protoplast- sau giây
(bar = 25 mm) (B,C) Sự phân chia thứ hai thứ
protoplast (bar = 25 mm) (D) Cụm Protoplast-nhận đƣợc sau ngày nuôi cấy (bar = 100 mm)
Bảng 5.1.Các enzyme thƣơng phẩm thích hợp cho phân lập protoplast
STT Enzyme Nguồn thu nhận
1 Các enzyme cellulase
Cellulase Onozuka R-10 Cellulase Onozuka RS Cellulase YC
Cellulase CEL Cellulysin Meicelase P-1 Driselase
Trichodema viride T viride
T viride T viride T viride T viride Irpex lacteus
2 Các enzyme Hemicellulase
Helicase Hemicellulase
Hemicellulase H-2125
Helix pomatia
Aspergillus niger
(11)Rhozyme HP 150 Aspergillus niger
3 Các enzyme Pectinase
Macerase
Macerozyme R-10 PATE
Pectinol
Pectolyase Y-23 Zymolyase
Rhizopus arrhizus R arrhizus
Bacillus polymyxa Aspergillus sp
Aspergillus japonicus Arthrobacter luteus
b Nuôi cấy callus
Các callus non nuôi cấy in vitro nguyên liệu lý tƣởng để thu đƣợc lƣợng lớn protoplast Nuôi cấy callus già thƣờng cho tế bào có kích thƣớc lớn vách tế bào dày, điều gây khó khăn cho thủy phân enzyme Vì thế, ngƣời ta thƣờng sử dụng callus non sau hai tuần cấy chuyển để phân lập protoplast
(12)cm) (D) hoàn chỉnh (bar = cm)
Các tái sinh từ quần thể tế bào đơn (single cells) trì đầy đủ đặc tính bảo tồn cao giống dịng nhƣng thay đổi số tính trạng nhƣ mong muốn Ví dụ: Các mía đƣờng có nguồn gốc từ tế bào callus mang đầy đủ đặc điểm bố mẹ, nhƣng vài tính trạng đƣợc cải thiện nhƣ kháng bệnh, tăng sản lƣợng hàm lƣợng đƣờng cao Gần đây, ngƣời ta thƣờng phân lập protoplast từ callus để tạo tế bào đơn, dẫn đến kết thu đƣợc protoclones khác (protoplast propagated clones) loài trồng quan trọng nông nghiệp
c Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) cung cấp nguồn nguyên liệu tốt cho phân lập protoplast Dịch huyền phù tế bào có mật độ cao đƣợc ly tâm, sau loại bỏ thể (supernatants) Các tế bào đƣợc ủ hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) lắc từ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ enzyme Sử dụng nồng độ thấp enzyme mục đích ngăn cản kết dính dịch huyền phù tế bào để thu đƣợc hiệu suất phân lập protoplast cao
Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm tái sinh hẳn lồi mà trƣớc khơng thành cơng thử tái sinh từ protoplast có nguồn gốc tế bào thịt Những thành công gần tái sinh in vitro hoàn chỉnh từ protoplast loài ngũ cốc (kê, lúa miến, lúa mạch giống Golden Promise) chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nguồn nguyên liệu lý tƣởng cung cấp protoplast toàn vẹn
d.Tái sinh từ tế bào trần Các bƣớc:
Từ tế bào trần ni cấy mơi trƣờng tái sinh màng tế bào hình thành, sau tế bào phát triển thành cụm tế bào (mơ sẹo) Từ mơ sẹo hình thành phơi tái sinh thành hồn chỉnh
5.3 Nuôi cấy protoplast
5.3.1 Môi trường nuôi cấy
a Thành phần dinh dƣỡng
(13)Ca2+ môi trƣờng nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thƣờng có lợi cho việc trì tính tồn vẹn màng tế bào Nồng độ sucrose thích hợp thƣờng từ 3-5%, nhƣng số lồi (ví dụ: thuốc lá) sucrose đƣợc sử dụng nồng độ thấp (1,5%) Môi trƣờng nuôi cấy protoplast sử dụng nitơ hữu dạng CH nitơ vô NH4NO3 (20 mmol/L)
Các vitamin dùng nuôi cấy protoplast giống môi trƣờng nuôi cấy mô tiêu chuẩn Auxin cytokinin sử dụng tổ hợp nồng độ khác để cảm ứng tạo vách tế bào kích thích phân chia protoplast phân lập Protoplast ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ tốt phải phối hợp với cytokinin Tuy nhiên 2,4-D nhƣ auxin khác (NAA, IAA) đƣợc sử dụng riêng rẽ thƣờng làm tiềm phát sinh hình thái callus có nguồn gốc protoplast Các cytokinin thƣờng đƣợc sử dụng BAP, kinetin, 2-iP, zeatin Mặc dù, tổ hợp hai loại phytohormone nói thay đổi tùy lồi, nhƣng nói chung ni cấy protoplast tỷ lệ auxin/kinentin cao thích hợp cho phân chia tế bào, protoplast có nguồn gốc từ tế bào phân hóa cao lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh
b Áp lực thẩm thấu mơi trƣờng
Trong q trình phân lập ni cấy, protoplast cần đƣợc trì cân áp lực thẩm thấu môi trƣờng nội bào tái sinh đƣợc vách tế bào vững Trong hai trƣờng hợp chênh lệch áp lực thẩm thấu môi trƣờng nội bào theo hƣớng môi trƣờng nhƣợc trƣơng ƣu trƣơng dẫn đến tình trạng protoplast bị vỡ teo lại Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu (thông thƣờng để tăng áp lực thẩm thấu) môi trƣờng nuôi cấy protoplast hỗn hợp enzyme sorbitol, mannitol, glucose, sucrose Các protoplast sinh trƣởng ổn định trong dịch đƣợc tăng nhẹ áp lực thẩm thấu Đối với protoplast thịt ngũ cốc đậu mannitol sorbitol nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp cả, sucrose lại thích hợp glucose mannitol nuôi cấy protoplast khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tƣớc mạch (brome grass) sắn Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose fructose đƣợc sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu
(14)protoplast Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ dung dịch loại nguyên liệu đƣợc sử dụng
c Mật độ dàn trải protoplast
Mật độ protoplast tối ƣu từ – 104 đến – 105/mL Tuy nhiên, thí nghiệm lai soma (somatic hybridization) phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, phải dàn trải protoplast mật độ thấp (100-500 protoplast/mL) Nuôi cấy mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập xác định khuẩn lạc lai có mặt hệ thống chọn lọc Kao Michayluk (1975) xây dựng môi trƣờng nuôi cấy protoplast (KM 8p) (Bảng 6.2) protoplast đƣợc ni cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả phân chia tạo thành callus Môi trƣờng cịn kích thích phân chia nhanh protoplast thịt cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây, sản phẩm dung hợp potato + tomato đƣợc nuôi cấy dàn trải mật độ thấp Các protoplast nuôi cấy môi trƣờng đƣợc đặt tối mơi trƣờng KM 8p trở nên độc tế bào dƣới điều kiện ánh sáng mạnh Bảng 5.2 Môi trƣờng KM8p dung cho nuôi cấy protoplast mật độ thấp (khử trùng phƣơng pháp lọc)
Thành phần Nồng độ (mg/L)
Thành phần Nồng độ
(mg/L) Muối khoáng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 KCl Sequestrence330Fe KI H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 600 1900 600 300 170 300 28 0,75 10 0,25 0,025 0,025
(15)Đường Glucose Sucrose Fructose Ribose Xylose Mannose Rhamnose Cellobiose Sorbitol Mannitol 68400 125 125 125 125 12 125 125 125 125 Folic acid p-Aminobenzoic acid Biotin Choline chloride Riboflavin Ascorbic acid Vitamin A Vitamin D3 Vitamin B12 0,2 0,01 0,005 0,5 0,1 0,005 0,005 0,01 Các phytohormone 2,4-D Zeatin NAA Vitamin-free casamino acid
Nƣớc dừa (lấy từ già xử lý 60oC/30 phút lọc)
Đậu tƣơng x Lúa mạch
0,1 - 125 10ml/l
Đậu tƣơng x Đậu Hà Lan 0,2 0,5 - -
- Kỹ thuật tầng nuôi dƣỡng
Một hƣớng khác nuôi cấy protoplast mật độ thấp kỹ thuật tầng nuôi dƣỡng (feeder layer technique) Raveh cs (1973) chuẫn bị tầng tế bào nuôi dƣỡng cách chiếu xạ tia X (2103 R) lên protoplast dịch huyền phù tế bào thuốc lá, phân chia tế bào bị ức chế nhƣng cho phép chúng trì hoạt động trao đổi chất Các protoplast bị chiếu xạ đƣợc rửa ba lần sau dàn trải chúng mơi trƣờng có agar mềm mật độ 2,4104/ml Ni cấy trải protoplast không qua chiếu xạ mật độ thấp (10-100 protoplast/ml) tầng nuôi dƣỡng
- Đồng nuôi cấy protoplast
(16)những thí nghiệm mà callus hình thành từ loại protoplast phân biệt hình thái đƣợc Ví dụ: Các tế bào lai phân lập cách học (mechanically isolated hybrid cells) đƣợc đồng nuôi cấy với protoplast phân lập từ chủng bạch tạng (albino strain) phát triển thành khuẩn lạc màu xanh loại khuẩn lạc dễ phân biệt với khuẩn lạc khơng có màu xanh chủng bạch tạng
- Nuôi cấy vi giọt
Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) thành công trƣờng hợp nuôi cấy tế bào lai Nicotiana glauca (+) Glycine max Arabidopsis thaliana (+) Brassica campestris Kỹ thuật cần đĩa nuôi cấy Cuprak đƣợc thiết kế đặc biệt gồm có ngăn bên ngồi nhỏ ngăn bên lớn Các protoplast riêng rẽ thể dị nhân giọt môi trƣờng dinh dƣỡng (khoảng 0,25-25 µl) đƣợc chuyển pipette Drummond vào ngăn bên đĩa Cuprak Ngăn bên chứa đầy nƣớc vơ trùng để trì độ ẩm bên đĩa Sau đậy nắp, đĩa đƣợc quấn giấy parafilm, giữ điều kiện ánh sáng nhiệt độ tối thích Tỷ lệ tế bào/dung tích mơi trƣờng ni cấy thích hợp tƣơng đƣơng mật độ 2-4103/ml Nếu tăng kích thƣớc giọt (~ 25 µl), tức giảm mật độ dàn trải cho hiệu nuôi cấy
5.3.2 Tái sinh từ protoplast
5.3.2.1 Tạo vách tế bào
Quá trình hình thành vách tế bào hồn chỉnh vòng hai đến vài ngày protoplast nuôi cấy thƣờng bắt đầu tái sinh vách tế bào sau phân lập vài Vách tế bào đƣợc tạo thành bao gồm vi sợi (microfibrils) xếp lỏng lẽo, q trình địi hỏi cung cấp nguồn carbon (sucrose) môi trƣờng dinh dƣỡng Các chất phân ly ion để ổn định thẩm thấu môi trƣờng ngăn cản phát triển vách tế bào Các protoplast phát triển vách thƣờng phân chia tế bào
5.3.3.2 Phát triển callus tạo hoàn chỉnh
Ngay sau tạo vách tế bào chung quanh protoplast, tế bào đƣợc tái cấu trúc tăng kích thƣớc sau tuần xuất phân chia tế bào Sau 2-3 tuần, khuẩn lạc tế bào có kích thƣớc lớn đƣợc tạo thành cấy chuyển chúng lên mơi trƣờng khơng có điều chỉnh áp lực thẩm thấu để phát triển callus Các callus đƣợc cảm ứng để phân hóa quan, tái sinh hoàn chỉnh
5.4 Protoplast vấn đề chọn dòng tế bào
(17)nhiều kết khả quan
Bằng biện pháp bỏ thành cellulose đƣa thể thực vật trạng thái tế bào riêng rẽ với kích thƣớc khơng lớn nhiều so với thể vi sinh vật cho phép tiến hành kỹ thuật chọn dòng vi sinh vật thực vật bậc cao Một đĩa petri đƣờng kính 5- cm cho phép nuôi tới 106 protoplast thuốc muốn trồng 5.106 thuốc cần có 106 m2 tức 100 đất canh tác
Ngoài ra, thể thực vật bậc cao thể đa bào đƣợc phân hóa thành tổ chức khác Nếu tiến hành xử lý đột biến tổng thể khó đạt đƣợc tần số cần thiết Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tƣơng tác với tế bào bên
cạnh thay đổi di truyền có điều kiện biểu rõ ràng
5.5 Dung hợp protoplast
5.5.1 Xử lý NaNO3
Năm 1970, Power cs dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast Carlson cs (1972) dùng phƣơng pháp để sản xuất lai soma (Nicotiana glauca N langsdorffii) Tuy nhiên, phƣơng pháp cho hiệu suất thấp NaNO3 khơng thích hợp với tế bào bị khơng bào hóa mạnh nhƣ protoplast từ nhu mơ
Hình 5.6 Dung hợp tế bào trần xử lí PEG
5.5.2 Xử lý PEG
(18)Nồng độ trọng lƣợng phân tử PEG định thành cơng thí nghiệm dung hợp PEG có trọng lƣợng phân tử thấp (~ 100) tạo dính chặt chắn, PEG trọng lƣợng phân tử 6000 cho hiệu dung hợp cao Xử lý PEG với pH/Ca2+ có hiệu tăng tần số dung hợp khả sống protoplast
Sau xử lý tác nhân dung hợp, protoplast đƣợc nuôi cấy theo phƣơng thức chuẩn PEG có tác dụng: cung cấp cầu nối để Ca2+ liên kết bề mặt màng với dẫn đến rối loạn tích điện bề mặt màng suốt trình rửa giải
5.5.3 Dung hợp điện
Phƣơng pháp đơn giản hơn, nhanh hiệu dung hợp hóa chất Điều quan trọng dung hợp điện (electrofusion) không gây độc tế bào nhƣ thƣờng thấy protoplast thể dị nhân đƣợc xử lý PEG Ngƣời ta dùng xung điện (electric pulses) để đƣa trực tiếp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật, kỹ thuật làm tăng quan tâm việc ứng dụng dung hợp điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma
Senda cs (1979) ngƣời nghiên cứu theo hƣớng dung hợp điện Rauwolfia, q trình dung hợp thực thành cơng dùng xung điện 5-12 amp DC Sau đó, Zimmermann Scheurich (1981), chứng minh protoplast dung hợp điện trƣờng đƣa protocol sử dụng rộng rãi Protocol bao gồm bƣớc: Đầu tiên, protoplast đƣợc đƣa vào ngăn dung hợp nhỏ có dây kim loại song song với đóng vai trị điện cực Tiếp đó, sử dụng điện áp thấp trƣờng điện từ ACdao động nhanh, kích thích protoplast thành chuổi tế bào điện cực Sau tế bào xếp hàng hồn chỉnh, q trình dung hợp đƣợc thực theo đợt ngắn xung DC điện áp cao Xung DC điện áp cao tạo phá vỡ thuận nghịch màng nguyên sinh chất vị trí tiếp xúc tế bào, tạo dung hợp tái tổ chức lại màng cách hợp lý Một q trình hồn chỉnh lúc đƣa protoplast vào bên ngăn chuyển chúng lên môi trƣờng nuôi cấy, đƣợc hồn chỉnh phút
(19)Hình 5.7 Sơ đồ dung hợp điện
Buồng dung hợp có điện cực song song đƣợc nối với máy dao động tần số cao (máy phát điện sóng hình sine trƣờng AC) máy phát điện xung DC
Hình 5.8 Các protoplast thịt thuốc xếp thành chuỗi ngọc trai dƣới ảnh hƣởng trƣờng AC (100 V/cm, 0,6 MHz)
5.5.4 Chọn lọc thể lai soma
- Phƣơng pháp mẫn cảm dƣợc phẩm
Có thể ứng dụng mẫn cảm khác protoplast phân lập từ loài khác Ví dụ: Petunia hybrida P Parodii actinomycin D Trên môi trƣờng MS, protoplast tế bào thịt của P hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn P parodii protoplast tạo thành khuẩn lạc tế bào nhỏ Bổ sung actinomycin D vào môi trƣờng nuôi cấy có hiệu khả tái sinh protoplast P parodii, nhƣng P hybrida protoplast lại khả phân chia Mặc dù môi trƣờng nuôi có bổ sung dƣợc phẩm, thể dị nhân sinh trƣởng sau phân hóa thành lai soma
- Các đột biến khuyết dƣõng
(20)Mặc dù phƣơng pháp ứng dụng cho thực vật bậc cao có gặp số khó khăn, nhƣng ngƣời ta thành công việc chọn lọc số lƣợng lớn thể lai soma cách dùng protoplast khuyết tật enzyme nitrate-reductase (khơng sử dụng nitrate) dịng đột biến thuốc kháng chlorate Các protoplast hai đột biến khác đƣợc dung hợp ni cấy mơi trƣờng chứa nitrate (nguồn nitrogen chính) Trong thí nghiệm đối chứng protoplast bố mẹ khơng sinh trƣởng có mặt nitrate sản phẩm dung hợp tái sinh
Sơ đồ 5.1 Sơ đồ chọn lọc thể lai soma cách ứng dụng mẫn cảm khác protoplast thịt actinomycin D
- Chọn lọc bổ sung di truyền