Giáo trình công nghệ tế bào thực vật phần 2

Chƣơng NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN 5.1 Giới thiệu chung nuôi cấy tế bào trần Việc giới thiệu quy trình sử dụng enzyme để lập tế bào trần thực vật (Cooking 1960) đƣa mặt đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật nuôi cấy mô mở lĩnh vực sinh học tế bào thực vật Điều làm cho tế bào trần có tác động mạnh nhƣ hệ thống thí nghiệm hệ enzyme phân hủy vách tế bào làm lộ bề mặt màng tế bào nhƣ rào cản môi trƣờng bên thành phần bên tế bào Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa thí nghiệm đƣợc thiết lập để nghiên cứu thao tác thuộc tính màng tế bào điều mà thực đƣợc bị bao phủ vách tế bào Tế bào trần đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu tính chất vật lý màng sinh chất (Ruesink 1973) đến nghiên cứu nhập bào hấp thu phần tử (Willison et al 1971), bào quan (Potrykus 1975) vi sinh vật (Davey Power 1975) Hơn nữa, tính sẵn sàng sử dụng tế bào trần cho phƣơng pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận bào quan đại phân tử mà không gặp phải biến dạng hƣ hỏng nhƣ phƣơng pháp ly trích thơng thƣờng (Howland et al 1975) Rất dễ nhanh chóng nhận thấy tính chất màng sinh chất dƣới số điều kiện thuận lợi chịu dung hợp có khả hình thành tế bào lai, cuối dẫn đến tạo tế bào lai sinh dƣỡng liên quan đến cải thiện suất thu hoạch mùa vụ (Nickell Torey 1969) Do tế bào cách ly với tế bào khác quần thể tế bào trần hệ thống đơn bào nên thao tác tƣơng tự nhƣ quần thể vi sinh vật Tính chất đƣợc khai thác thành cơng thí nghiệm cho nhiễm đồng loạt virus (Takebe 1975), ni cấy nhân giống vơ tính tế bào phân lập tế bào đột biến Giai đoạn phục hồi trở lại tế bào trần môi trƣờng nuôi cấy tế bào nguyên vẹn trình tổng hợp phát sinh trở lại vách tế bào Tế bào trần phân lập từ mô cà chua đƣợc khảo sát chi tiết trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào (Pojnar et al 1967) Mặc dầu báo cáo enzyme phân lập tế bào trần đƣợc công bố vào năm 1960 (Cocking 1960) nhƣng đến 10 năm sau phân chia tế bào từ tế bào trần đƣợc báo cáo (Nagata Takebe 1970) thí nghiệm khảo sát tế bào thịt thuốc tái tạo nhanh chóng vách tế bào khoảng 60-80% số tế bào có vách phân cắt tế bào môi trƣờng nuôi cấy Mơ sẹo đƣợc hình thành thúc đẩy tạo thành cành non sau thuốc nguyên vẹn (Takebe et al 1971) Cùng thời gan Kao et al (1970) quan sát tái tạo phân chia tế bào trần đậu nành môi trƣờng nuôi cấy Cuối năm 1970 chứng minh rõ ni cấy tế bào trần để tạo tập đồn tế bào cuối hoàn chỉnh trở nên quy trình nhiều phòng thí nghiệm, có nhiều lồi đƣợc nhân bội ổn định Tuy nhiên, có số vấn đề cần khắc phục đƣợc nêu Evans Cocking (1978) môi trƣờng nuôi cấy, yếu tố vật lý môi trƣờng, yếu tố di truyền Một lý protoplast không rời bề mặt tế bào có tích điện chúng có khuynh hƣớng kết dính với Nghiên cứu điện di xác định bề mặt tế bào có tích điện (Grout and Coutts 1974) số điều kiện thơng thƣờng điện tích âm Một điều kiện tất yếu yếu tố làm tan rã tế bào làm giảm thiểu điện tích xuống làm cho tế bào tập hợp lại màng tế bào sát lại gần Một hợp chất đƣợc ghi nhận gây tan rã nitrate sodium (Power et al 1970) Tế bào bóc trần để vào dung dịch muối nhanh chóng đƣa đến kết tập lại, thông qua việc khảo sát chuyển động tế bào trần buồng điện di cho thấy rõ nitrate sodium giảm thiểu điện âm tế bào trần (Grout Coutts 1974) Polyethylene glycol (PEG) đƣợc chấp nhận rộng rãi nhƣ tác nhân gây tan rã (Kao Michayluk 1974, Wallin et al 1974); xử lý tế bào trần với PEG gây kết tập nhanh chóng với tế bào trần thực tan rã xãy thời gian hydrat hoá trở lại kết hợp với gỡ bỏ PEG Sự sử dụng nitrate sodium để thúc đẩy hoà nhập dẫn đến tạo thành tế bào lai thực vật mặt di truyền, ví dụ khối u lai Nicotiana glauca Nicotiana langsdorfii Carlson cộng (Carlson et al 1972) Những tiến nỗi bật yêu cầu phát triển quy trình chọn lọc tế bào lai sinh dƣỡng độc lập thuộc tính biết lai hữu tính Do nỗ lực hƣớng trực tiếp đến việc sử dụng đột biến, sử dụng chọn lọc khác biệt xảy tăng trƣởng thực vật tự nhiên đáp ứng với môi trƣờng dinh dƣỡng thuốc Ở Nottingham Petunia đƣợc chọn cho đánh giá đáp ứng chúng mô nuôi cấy di truyền màu sắc cánh hoa đƣợc ổn định Thực vật lai sinh dƣỡng Petunia hybrida P parodii đƣợc tạo thành công vào năm 1976 (Power et al 1976) Nhƣ đƣợc thảo luận Cocking (1989), thành công sử dụng đối tƣợng họ cà Solanaceae không tiến hành song song với thành công nuôi cấy tế bào trần ngũ cốc Điều đáng nói hai mƣơi năm sau khơng đạt đƣợc sinh sản ổn định tế bào trần ngủ cốc Thành công đạt đƣợc mƣời năm gần việc tái tạo nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập từ nhƣng từ dịch treo nuôi cấy tế bào (Abdullah et al 1986) Thành công ban đầu lấy tế bào trần thuốc Petunia để tái tạo vách tế bào trải qua phân chia để tạo thành mơ sẹo, sau phân hóa thành quan để tạo thành rể chồi non, làm lộ đƣờng nghiên cứu sai loại ngủ cốc Năm 1980 nhìn thấy đƣợc phƣơng pháp tinh vi mở rộng tái tạo lại nguyên vẹn từ gia tăng vững số loài sản xuất tế bào lai sinh dƣỡng cybrids, bao gồm ví dụ nhƣ cá thể khác lồi khơng có khả giao phối, Petunia parodii Petunia parviflora (Powder et al 1980) Quy trình đƣợc phát triển để tái tạo lại nguyên vẹn từ tế bào trần cô lập, không cho lúa, nhƣng cà chua, đậu nành, hạt lanh, cải bắp, rau diếp lai sinh dƣỡng lồi khác nhau, có máy di tuyền khác Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Glycine, Citrus, Brassica, Medicago Trifolium spp (Bajaj 1989a) Thêm vào quy trình đƣợc phát triển xa cho kỹ thuật vi tiêm, dung hợp điện, flow cytometry, hấp thu tích hợp DNA, lập nhân nhiễm sắc thể từ tế bào trần (Bajaj 1989b) Việc khám phá tế bào trần bị nhiễm virus khảm thuốc (Cocking and Pojnar 1969) kích thích quan tâm vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm biểu plasmid Ti vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, đƣợc đƣa tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp chứng vai trò độc lập plasmid Ti khía cạnh (Davey et al 1980) Điều mở đƣờng cho việc sử dụng plasmid chuyển nạp trực tiếp cho tế bào trần dẫn đến việc tạo đƣợc loại rau ngũ cốc chuyển gen vụ thu hoạch trồng chuyển nạp trực tiếp DNA cho tế bào trần, bao gồm loại lúa chuyển gen có khả sinh sản theo phƣơng cách chuyển nạp điện xung vào tế bào trần lúa plasmids chimaeric (Zang et al 1988) Những nghiên cứu lúa chuyển gen minh họa vai trò tế bào trần việc biến đổi tế bào ngũ cốc làm cho vấn đề phân tử tế bào tiếp cận Khảo sát vài chi tiết minh họa nghiên cứu phát triển nhƣ thập niên 1980 Sự tƣơng tác virus với tế bào trần lập minh chứng poly-Lornithine kích thích lây nhiễm, nghiên cứu xác nhận PEG gia tăng thu hút virus acid nhân virus vào tế bào trần (Davey Kumar 1983) Rồi sau năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 1980 thời gian phối hợp kỹ thuật xác định plasmid Ti chuyển nạp hay khơng vào tế bào trần thực vật Nhƣ đề cập trƣớc nghiên cứu bao gồm tƣơng tác cấu trúc siêu xoắn plasmid Ti từ dòng octopine A tumefaciens với dịch treo tế bào trần Petunia hybrida với có mặt PLO, kết tạo tập đồn tế bào trần có biểu tính chất có vị đắng đỉnh tăng trƣởng mơi trƣờng có hormone tự tổng hợp octopine, hai mã hoá gen Ti T-DNA (Davey et al 1980) Deshayes et al (1985) đóng gói pGV23 NEO, plasmid mang gen aminoglycoside phosphotranspherase type II (APH II; neomycin phosphotranspherase, NTP II) từ Tn5 có khả kháng kanamycin tế bào thực vật, vào thể tích chất béo (liposome) dung hợp với plasmid có chứa túi tế bào trần thuốc sử dụng PEG Tập đoàn tế bào kháng kanamycin đƣợc cô lập 4.0´105 Mẫu cắt hạn chế DNA đƣợc chèn vào trình chuyển gen vào tế bào thực vật đƣợc định theo cách tích hợp kế trình tự plasmid, bao hàm tái tổ hợp đồng dạng trình tự chuyển nạp Tiến chuyển nạp trực tiếp DNA vào tế bào trần đạt đƣợc đƣợc chứng minh trình tự T-DNA khơng cần thiết cho chuyển nạp ổn định biểu DNA lạ tế bào thực vật Một gen lai chọn lọc bao gồm vùng giải mã gen Tn5 NPII dƣới kiểm soát gen promoter CaMV VI đƣợc đƣa tế bào trần thuốc nhƣ phần E coli (pABCD1) cách xử lí hỗn hợp tế bào trần - plasmid PEG 6000 Tập đoàn chuyển nạp đƣợc chọn lọc mơi trƣờng có chứa mg/ml kanamycin Gen lạ đƣợc truyền qua cho hệ phép lai Mendel Trong tế bào trần thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hệ thống tiêu biểu cho nghiên cứu DNA, hệ thống tế bào trần khác, bao gồm lúa, đƣợc quan tâm rộng rãi Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus đƣợc chuyển gen pABD1 vào tế bào trần thịt phƣơng pháp xung điện (Guerche et al 1987) Tính kháng kanamycin đƣợc truyền qua hệ qua đƣờng hữu tính lai tính Mendel Chuyển gen trực tiếp chứng minh khả tạo hạt rau Vigna aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử lý PEG pLGV NEO 2103 (Kƣhler et al 1987) Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cung cấp hệ thống để quan sát biểu gen khoảng thời gian vài xử lý chuyển nạp Các nghiên cứu biểu gen tạm thời (ngắn ngủi) nhƣ có ích việc đánh giá cấu trúc gen khởi động gen reporter sẵn sàng thử nghiệm ví dụ nhƣ CAT b-glucurionidase Rất hữu ích so sánh vài tính chất chuyển nạp tế bào trần thực vật tế bào động vật Thật thúc đẩy để lƣợng định tính khả chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt tế bào thực vật đƣợc loại bỏ vách tế bào enzym nhƣ trƣờng hợp tế bào trần thực vật, từ báo cáo nuôi cấy mô tế bào động vật cho thấy có khả chọn biểu nhóm gen hệ gen DNA Bây hội xuất hệ đột biến đƣa đột biến gen vào tế bào trần thực vật tƣơng tác với DNA; chứng chứng tỏ mẫu DNA lớn đƣa vào biểu tế bào động vật (Allshire et al 1987) Tế bào trần lập enzyme từ số nhóm tế bào ví dụ nhƣ từ tế bào biểu bì thuốc tái tạo lại thành nguyên vẹn (Davey et al 1974) Lông hút rễ sản phẩm tự nhiên tế bào biểu bì rễ, đƣợc chứng minh xử lý enzyme làm tiêu hủy đỉnh sinh trƣởng lơng hút phóng thích tế bào trần (Cooking 1985) Tế bào trần cô lập từ rễ con, thân mầm, mầm Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia môi trƣờng nuôi cấy để tạo mơ sẹo từ sinh tế bào trần (Ahuja et al 1983) điều đáng quan tâm xác định tế bào trần từ lông hút rễ giữ tính chất ngun thủy hay khơng Xử lý rễ Lotus corniculatus với cellulase pectinase phóng thích tế bào trần đầu rễ lơng hút ủ mơi trƣờng có enzym khoảng phút 10% tế bào trần phân chia để tạo tập đồn tế bào mà sau tạo đƣợc chồi non Cây tái tạo có kiểu hình tế bào bình thƣờng Các nghiên cứu tƣơng lai làm cho hệ thống nhƣ đƣợc sử dụng để xác định nguồn gốc tế bào trần có ảnh hƣởng hay khơng đến đƣờng phát triển sau Trong tế bào trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo nguyên vẹn cho thấy xãy qua phát sinh phơi dinh dƣỡng (Abdullah et al 1986) Có thể thay đổi đƣờng phát triển kỹ thuật điện cao trình phân bào dẫn suất tế bào trần thực vật nhƣ quan sát Rech et al (1987) Gần đây, Chand et al (1988) quan sát thấy bóc trần tế bào dƣợc liệu thân gỗ Solanum dulcamara điện áp 250 đến 1250 vol/cm2 ba xung điện xung kéo dài 10 - 50 ms kích thích tăng trƣởng mơ dẫn suất từ tế bào trần cho thấy có gia tăng khả biệt hóa (Chand et al 1988) Sẽ quan trọng để mở rộng nghiên cứu hệ thống tế bào trần Sẽ có ích tế bào trần Physcomitrella tái tạo sản sinh khối u đáp ứng với ánh sáng đơn cực, tế bào phân cực phân chia sau 24 từ tế bào trần lập, từ hai tế bào có hai mặt phát triển khác (Jenkin Cove 1983) Biến đổi đƣờng phát triển cung cấp đầu mối giải mã phát triển tế bào thực vật, tế bào điều khiển phân tử Có lẽ vấn đề quan tâm tƣơng tác lạ đại phân tử, viruses vi sinh vật màng tế bào tế bào trần Điện xung để hình thành lổ màng tế bào đƣợc dùng để khảo sát theo hƣớng Hơn nữa, điều chủ yếu tất vách tế bào phải đƣợc bỏ đi; lợi ích nghiên cứu nhiều mảng Nhƣ khám phá hoa sen Lotus dễ bỏ vách tế bào cách nhanh chóng đầu lông hút rễ xử lý rễ với hỗn hợp cellulase pectinase Gần quan sát cấu trúc nốt sần tạo rễ lúa, rễ cải cho dầu xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase pectinase cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium (Al-Mallah et al 1989 1990) Các nghiên cứu bao gồm phân hủy phần vách tế bào làm lộ phần màng sinh chất tế bào biểu mơ có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu cộng sinh Rhizobium trồng họ đậu (Cooking Davey 1991) 5.2 Phương pháp tách protoplast Có phƣơng thức phân lập protoplast, là: - Cơ học (khơng dùng enzyme) - Sử dụng enzyme (qua hai bƣớc) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời) Phƣơng pháp học tiến hành dựa sở phá mối liên kết mô dao sắt nhọn (sharp-edged knife) giải phóng protoplast riêng rẽ Phƣơng pháp cho hiệu suất thấp Nói chung, protoplast thƣờng đƣợc phân lập từ tế bào không bào hóa cao mơ dự trữ nhƣ chồi hành vảy hành (bulbs and scales) loài thân hành, rễ củ cải (radish root), vỏ dƣa chuột (mesocarp of cucumber), rễ củ cải đƣờng (beet root) Phƣơng pháp dùng enzyme có hiệu cao nhiều so với phƣơng pháp học, phƣơng pháp enzyme cho phép tách đƣợc hàng gram protoplast Các enzyme đƣợc sử dụng cellulase hồn tồn khơng độc hại tế bào Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose phải sử dụng hỗn hợp enzyme: - Pectinase phân hủy pectin - Cellulase phân hủy cellulose - Hemicellulase phân hủy hemicellulose Ngoài ra, để protoplast không bị vỡ sau thành cellulose bị phân hủy ngƣời ta phải bổ sung chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để trì cân thẩm thấu nội bào mơi trƣờng bên ngồi Thành phần dịch enzyme (trên lít) gồm có: - Các enzyme (pectinase, cellulase, hemicellulase) từ 0,1-2% - Sorbitol (0,15 M) 27,3 g - Mannitol (0,15 M) 27,3 g - Glucose (0,1 M) 18 g - CaCl2.2H2O (6 mM) 441 mg - KH2PO4 (0,7 mM) 95 mg - Đệm MES1 (3 mM) 650 mg - Điều chỉnh pH 5,6 khử trùng dung dịch enzyme màng lọc Millipore Tùy theo đối tƣợng loại mơ thay đổi nồng độ enzyme cho thích hợp Vì protoplast thực chất tế bào trần khơng có thành tách đƣợc từ nhiều nguồn khác nhƣ: phận (lá, rễ, hạt phấn), callus, tế bào đơn … Khác với tế bào vi sinh tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào cứng đƣợc tạo nhiều loại polime khác Thành tế bào có chức học, tạo khung xƣơng tế bào hệ màng liên kết tế bào với Thành phần hoá học tế bào phức tạp Celllose thành phần chủ yếu màng tế bào thực vật Cơng thức hố học tổng quát cellulose (C6H15O5)n Phân tử cellulose có hình sợi dài, chí dài với liên kết hàng nghìn phân tử đƣờng đơn với Ngồi cellulose có hemicellulose, pectin, lignin, số chất béo chất khống, pectin đóng vai trò quan trọng liên kết tế bào với Tế bào trần (protoplast) tế bào đƣợc tách khỏi màng tế bào (một lớp polyme bao bọc tế bào) màng liên kết tế bào Các enzym đóng vai trò chủ yếu phân huỷ màng tế bào tạo tế bào trần cellulase pectinase Tế bào sau bị lớp màng cứng có dạng hình cầu dƣới áp suất thẩm thấu phù hợp mơi trƣờng Tế bào trần đƣợc tách từ mô quan khác nhƣ lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro Ƣu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đƣợc đơn vị thể tích mơi trƣờng cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trƣờng) Tế bào trần số trồng có khả tái sinh mạnh, ví dụ tế bào mô thịt thuốc lá, cải dầu, Bằng thao tác di truyền tế bào trần dễ dàng tạo tế bào biến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi đƣợc bảo tồn tái sinh tế bào thành hoàn chỉnh Hình 5.1 Các bƣớc ni cấy tế bào trần hông Lá Lá nguồn nguyên liệu thông dụng truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, cho phép phân lập đƣợc số lớn tế bào tƣơng đối đồng (relatively uniform cells) Protoplast phân lập từ qua năm bƣớc: - Khử trùng - Loại bỏ lớp tế bào biểu bì (epidermal cell layer) - Tiền xử lý enzyme - Ủ enzyme - Phân lập protoplast phƣơng pháp lọc ly tâm Hình 5.2 Các bƣớc phân lập Protoplast từ Phƣơng pháp để tách tế bào trần từ Khử trùng mẫu Ngâm mẫu dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất Tách lớp mặt dƣới Ngâm mẫu hỗn hợp enzym Tinh tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần mơi trƣờng thích hợp Hình 5.3 Phân lập protoplasts Echinacea purpurea (bar = 50 mm) Hình 5.4 Sự phân chia protoplasts Echinacea purpurea (A) Phân chia protoplast- sau giây (bar = 25 mm) (B,C) Sự phân chia thứ hai thứ protoplast (bar = 25 mm) (D) Cụm Protoplast-nhận đƣợc sau ngày nuôi cấy (bar = 100 mm) Bảng 5.1.Các enzyme thƣơng phẩm thích hợp cho phân lập protoplast STT Enzyme Nguồn thu nhận Các enzyme cellulase Cellulase Onozuka R-10 Cellulase Onozuka RS Cellulase YC Cellulase CEL Cellulysin Meicelase P-1 Trichodema viride T viride T viride T viride T viride T viride Driselase Irpex lacteus Các enzyme Hemicellulase Helicase Hemicellulase Hemicellulase H-2125 Helix pomatia Aspergillus Rhizopus sp niger tái tổ hợp giảm phân chu trình hữu tính thể lai F1, tạo phân ly vƣợt giới hạn để khám phá tổ hợp gen Các dòng tế bào khác chọn lọc điều kiện in vitro chứng minh lực ứng dụng cho nông nghiệp công nghiệp Các tái sinh biểu tính trạng kháng chất diệt cỏ, pathotoxin, muối phèn Hơn nữa, khả biến dị nuôi cấy tế bào thể vai trò hữu ích việc tổng hợp chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thƣơng mại Hinh 6.1 Biểu đồ khai thác hiệu tác động nhân tế bào chất Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma dòng giao tử dễ dàng cơng nghệ DNA tái tổ hợp Đặc biệt, cải thiện trồng mang tính trạng đa gen (polygenic traits) phƣơng pháp tạo giống trồng truyền thống không truyền thống đƣợc chứng minh khó khăn Biến dị dòng soma kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền trồng CÂU HỎI ƠN TẬP Khái qt vấn đề ni cấy tế bào thực vật đơn Trình bày đặc tính tế bào thực vật đƣợc nuôi cấy Nêu yêu cầu nguyên liệu điều kiện nuôi cấy Vì ln xuất biến dị dòng tế bào? Trình bày ngun tắc chọn dòng tế bào Trình bày cách chọn dòng tế bào trƣờng hợp khơng có tác nhân chọn lọc có tác nhân chọn lọc Trình bày phƣơng pháp nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất tự nhiên Nêu ứng dụng biến dị dòng soma dòng giao tử cơng tác giống trồng Chƣơng NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ VẤN ĐỀ LÀM SẠCH VIRUS Ở THỰC VẬT 7.1 Tầm quan trọng Tạo giống chống chịu bệnh virus hƣớng nghiên cứu khả quan Nhƣng thực tế, chọn tạo giống gặp nhiều khó khăn thiếu nguồn gen có khả chống chịu với loại bệnh virus khác Bên cạnh đó, việc tạo giống lƣu niên gặp trở ngại nhiều thời gian công sức Gần đây, kỹ thuật gen mở triển vọng tạo giống miễn dịch di truyền với số loại virus cách chuyển gen protein vỏ virus gen iARN vào trồng, làm có khả bất hoạt gen mARN virus Tuy nhiên, nhiều vấn đề kỹ thuật lý luận nan giải Hình 7.1.Các dạng cấu tạo ngồi virus Do vậy, phƣơng pháp có hiệu tạo vật liệu nhân giống bệnh virus qua nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trƣởng kết hợp với xử lý hoá chất, nhiệt độ Những phƣơng pháp giúp loại trừ bệnh virus khác khỏi vật liệu nhân giống tạo giống bệnh loạt trồng, chủ yếu khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, ăn có múi, chuối, nho, mơ, mận, hoa nhƣ cúc, cẩm chƣớng Phƣơng pháp cho phép loại bỏ hầu hết bệnh virus, viroid tác nhân gây bệnh tƣơng tự virus (Vasil Thorpe, 1994) Chóp đỉnh sinh trƣởng đƣợc coi bệnh virus Mẫu mô nuôi cấy nhỏ gần đỉnh sinh trƣởng khả bệnh lớn Dƣờng nhƣ có tƣơng quan tỷ lệ thuận kích thƣớc mẫu với khả tái sinh bệnh (Stone, 1982; Green Lo, 1989) Nhƣng vài trƣờng hợp, việc loại trừ virus khó khăn khơng phụ thuộc vào kích thƣớc mẫu số virus có khả sinh sản chuyển dịch nhanh chóng đến vùng sinh trƣởng (Theiley cs, 1984) Ngƣời ta quan sát thấy mật độ virus cao vùng chóp đỉnh sinh trƣởng số lồi dƣới kính hiển vi điện tử (Toussaint cs, 1984) Do vậy, việc kết hợp kỹ thuật nuôi cấy với yếu tố kìm hãm virus nhƣ hố chất, nhiệt độ tăng cƣờng khả loại trừ bệnh virus tạo giống bệnh trồng Hình 7.2 Cà chua bị bệnh virus đốm vàng Hầu hết trồng nông-lâm nghiệp bị nhiễm hệ thống gây bệnh nhƣ nấm, virus, vi khuẩn, mycoplasma nematodes Các tác nhân gây bệnh ln gây chết cây, nhƣng thƣờng xun làm giảm suất chất lƣợng trồng Trong tác nhân gây bệnh khác gần nhƣ xâm nhiễm vào thể thực vật qua nhân giống sinh dƣỡng, bệnh virus lại xuất trồng nhân giống hạt nhƣ nhân giống sinh dƣỡng Mặc dù trồng bị nhiễm bệnh vi khuẩn nấm phản ứng với việc xử lý hợp chất diệt khuẩn (bactericidal) diệt nấm (fungicidal), nhƣng ngƣời ta chƣa thể sản xuất hợp chất thƣơng mại diệt virus để chữa bệnh cho trồng nhiễm virus Để sản xuất bệnh virus, thông thƣờng ngƣời ta chọn nhiều khỏe mạnh sau nhân giống chúng phƣơng thức sinh dƣỡng, tạo quần thể khoẻ mạnh Nhƣng nơi mà quần thể dòng hồn tồn bị nhiễm bệnh virus có cách thu đƣợc bệnh thông qua nuôi cấy mô Các mô phân sinh đỉnh bị nhiễm bệnh thƣờng bệnh chứa nồng độ virus thấp Tuy nhiên, nồng độ virus tăng lên tƣơng ứng với việc tăng khoảng cách tính từ đỉnh phân sinh Các lý khác mô phân sinh khơng bị virus xâm nhiễm là: (a) virus di chuyển dễ dàng thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn cấu trúc mà đỉnh phân sinh khơng có, (b) hoạt tính trao đổi chất cao trình phân chia tế bào phân sinh ngăn cản chép virus, (c) nồng độ auxin nội sinh cao đỉnh chồi ức chế sinh sản virus Morel Martin (1952) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để loại bỏ xâm nhiễm virus thực vật Họ nuôi cấy đỉnh phân sinh tách từ Dahlia bị nhiễm virus thu đƣợc bệnh Sau đó, tiến loại bỏ virus kỹ thuật nuôi cấy mô đƣợc ứng dụng rộng rãi nông nghiệp Nuôi cấy đỉnh phân sinh cho phép thu đƣợc bệnh khác nhƣ bệnh viroid (dạng virus-tác nhân gây bệnh chứa đoạn ngắn RNA), mycoplasma, vi khuẩn, nấm 7.2 Nguyên lý làm virus Danh từ làm virus nội dung cơng việc Đó việc phải giải phóng thực vật bị nhiễm virus khỏi virus Ở đề cập tới trồng nhân giống vơ tính phƣơng thức nhân giống ngun nhân truyền bệnh từ hệ sang hệ khác Vì vậy, biện pháp làm bệnh virus ln phải kết hợp với biện pháp trì tính bệnh Cả hai biện pháp nằm phạm vi phục tráng giống, ngƣời ta gọi biện pháp giữ bệnh Bên cạnh hai nhiệm vụ trì đặc tính giống tính đồng giống nhiệm vụ chủ yếu công tác phục tráng giống cung cấp đƣợc tập đoàn bố mẹ hạt giống virus Kinh nghiệm thực tế cho hay biện pháp phục tráng giống có hiệu biện pháp đƣợc thực cách triệt để có trách nhiệm Làm virus đƣợc coi mục tiêu công tác phục tráng giống Bên cạnh xử lý nhiệt xác định tính bệnh, phƣơng pháp để thu đƣợc virus bao gồm chủ yếu nuôi cấy đỉnh phân sinh Đƣơng nhiên kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc thực theo mục đích khác nên phức tạp tốn nhân giống vơ tính Vì thế, ngƣời ta phân biệt rõ nuôi cấy đỉnh phân sinh cơng tác phục tráng giống nói chung làm virus nói riêng Mục đích cơng tác bảo vệ thực vật (trong nuôi cấy đỉnh phân sinh nuôi cấy mô) phân biệt rõ với công tác trì giống Trong cơng tác bảo vệ thực vật yêu cầu lớn làm virus, nhƣng thực tế điều hầu nhƣ khơng thể đạt đƣợc Vì phải kết hợp nhiều biện pháp để đảm bảo kết Xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh xác định (thử) virus phải đƣợc thực theo chu trình kín Các nhà trì giống đòi hỏi phải có thể thực virus, để thông qua phƣơng pháp nhân in vitro nhân thành số lƣợng mà không bị tái nhiễm Các nhà nuôi cấy mô thực vật quan tâm đến phƣơng pháp nhân giống in vitro, mà lý việc làm virus trồng Vì hiệu kinh tế, ngƣời ta giới hạn việc nhân giống in vitro trồng mà chúng phƣơng pháp cổ điển để nhân nhanh giống làm virus không thực đƣợc Phƣơng pháp nhân giống in vitro loại trừ đƣợc nguy tái nhiễm tỏ ƣu việt phƣơng pháp cổ điển Tuy theo kinh nghiệm thực tiễn, trồng đƣợc nhân giống in vitro mang nhiều tác nhân gây bệnh Đa số trồng thƣơng mại (commercial crop plants), đặc biệt nhân giống vơ tính chứa virus nội hấp (systemic virus), virus ảnh hƣởng xấu đến suất Vì vậy, việc sản xuất nguyên liệu thực vật virus gần virus cần thiết trƣớc chúng đƣợc nhân giống để đƣa thị trƣờng Ở nhiều loài, phƣơng thức cho hiệu cao xử lý nhiệt quan khác lúc sinh trƣởng mạnh Tuy nhiên, số virus phƣơng thức hồn tồn khơng thích hợp phải sử dụng số phƣơng thức khác Phƣơng thức cho hiệu cao nuôi cấy đỉnh phân sinh, thƣờng kết hợp với xử lý hóa học xử lý nhiệt Các phƣơng pháp cho phép thu đƣợc cá thể virus mà nấm nhân tố gây bệnh khác Từ năm 1952, 1953 Morel Martin thành công việc loại trừ số virus khoai tây thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis) cách nuôi cấy đỉnh phân sinh, điều đáng tiếc chồi không tạo rễ ngƣời ta phải ghép lên mầm khoẻ mạnh Tuy nhiên, sau sở kết Morel Martin ngƣời ta đƣa nhiều phƣơng pháp sản xuất trồng virus có khả tạo rễ nhiều lồi thực vật khác dòng đƣợc sử dụng rộng rãi thị trƣờng Nuôi cấy đỉnh phân sinh nuôi cấy mẫu nhỏ chồi đỉnh lên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để chúng sinh trƣởng tạo hồn chỉnh Phần mơ thƣờng đƣợc dùng vòm phân sinh (meristem dome) cộng thêm cặp Tùy thuộc vào loài khác mà đỉnh phân sinh có chiều dài từ 0,1-0,5 mm, số tác giả u cầu ni cấy vòm phân sinh, nhiên số tác giả lại thu đƣợc virus từ đỉnh sinh trƣởng có chiều dài 0,5 mm Chồi đỉnh đỉnh sinh trƣởng sau cắt thƣờng phải khử trùng bề mặt, nhƣng giai đoạn khơng cần thiết Các kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trƣởng khác tùy thuộc lồi Mơi trƣờng agar thƣờng khơng thích hợp cho sinh trƣởng ni cấy, có "cầu giấy lọc" (filter paper bridge) với phần chân đƣợc nhúng môi trƣờng lỏng chứa ống nghiệm nuôi cấy thích hợp Chỉ cầu giấy lọc nhƣ rễ phát triển tốt, sẵn sàng để đƣa đất Rất nhiều loại môi trƣờng đƣợc dùng nuôi cấy đỉnh phân sinh nhƣng khơng có mơi trƣờng chung thích hợp cho lồi Mơi trƣờng chứa ngun tố đa lƣợng vi lƣợng Knop Berthlot (khơng có beryllium titanium), glucose 40 g/L, thiamine 105g/L myo- inositol 10-3 g/L pH 5,5 đƣợc dùng cho nhiều loài NAA nồng độ 10-3 mg/L cần thiết cho hình thành rễ ban đầu, nhƣng sau phải cấy chuyển sang mơi trƣờng khơng có NAA Các số liệu điều kiện chiếu sáng nhiệt độ lý tƣởng đƣợc cơng bố ít, trƣớc Hollings (1968) đƣa nhiệt độ nuôi 20oC dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 22 giờ/ngày Thời gian để đỉnh phân sinh tạo chồi rễ từ vài tuần đến vài tháng tùy loài Hiện nay, ba biện pháp làm virus tỏ có hiệu lƣơng thực thực phẩm, xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh chọn lọc phƣơng pháp thử virus Mỗi biện pháp thu đƣợc kết định, nhƣng sử dụng cách tổng hợp ba biện pháp ngƣời ta thu đƣợc kết virus thực Mức độ hữu hiệu trình làm virus thực tiễn phụ thuộc vào yếu tố sau: - Khả xử lý nhiệt - Khả nuôi cấy đỉnh phân sinh - Phƣơng pháp thử virus có độ xác cao - Hệ số nhân giống vơ tính cao - Trồng vật liệu bệnh ban đầu dƣới điều kiện cách ly tốt, tránh đƣợc tái nhiễm - Mức độ (diện tích) trồng trọt cho phép cung cấp đủ giống năm Những điều kiện đƣợc thực mức độ khác loài trồng khác Việc làm virus khơng thể thay việc phân tích virus lồi trồng, phân tích virus cần đƣợc thực trƣớc để từ mà tìm biện pháp thích hợp để bảo đảm trồng bệnh 7.3 Phương pháp làm virus 7.3.1 Các phương pháp chuẩn đốn bệnh virus Khơng phải tất lồi sau q trình xử lý phối hợp nhiệt ni cấy đỉnh sinh trƣởng virus, cần phải tiến phải xét nghiệm khoảng thời gian từ lúc tái sinh cho tái xét nghiệm phải từ đến tháng để thể virus tồn thực vật đạt đƣợc nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ xác Xét nghiệm virus khn khổ qui trình làm virus hồn tồn khác q trình phân tích virus trồng Đối với việc làm virus độ xác phƣơng pháp thử virus loài xét nghiệm mang ý nghĩa định cần đƣợc xét nghiệm theo nhiều phƣơng pháp khác cần ý tới phƣơng pháp xét nghiệm loài virus phổ biến có ý nghĩa kinh tế Đối với việc phân tích virus lồi trồng ngƣời ta ý tới số lƣợng nhƣ phân loại chúng Độ nhạy cảm phƣơng pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu, sau số phƣơng pháp xét nghiệm virus đƣợc ứng dụng trồng trọt loài hoa: 7.3.1.1 Xét nghiệm thị Dùng dịch ép thực vật cần đƣợc xét nghiệm gây bệnh thị thích hợp dùng phƣơng pháp ghép chứng minh đƣợc bệnh virus Chỉ sau thực phƣơng pháp thử kết luận bệnh virus thực đảm bảo tính xác Phƣơng pháp thử thị đƣợc coi phƣơng pháp xác định phƣơng pháp nhạy cảm nhất, nhiên kết xét nghiệm phụ thuộc yếu tố khác Trong trƣờng hợp xét nghiệm hàng loạt công việc gây bệnh nhân tạo số lƣợng thị 10.000 đến 100.000 thời gian nhiều tháng độ xác phƣơng pháp giảm khơng thể tiến phải thí nghiệm lặp lại Tuổi trồng nhƣ trạng thái sinh lý chúng mùa khác năm ảnh hƣởng nhiều đến tính xác phƣơng pháp xét nghiệm Vì lý đó, trƣờng hợp phải xét nghiệm hàng loạt phƣơng pháp dùng thị không đảm bảo phƣơng pháp miễn dịch Nếu xét nghiệm số lƣợng vừa phải ví dụ 1.000 cá thể phƣơng pháp dùng thị khơng cần thay phƣơng pháp khác cơng việc tiến hành thời vụ thích hợp Triệu chứng bệnh lý quan sát đƣợc sau 3-5 ngày song thơng thƣờng sau hai tháng cần diện tích nhà kính rộng thời gian tƣơng đối dài chi phí cho xét nghiệm phƣơng pháp thị thƣờng đắt gấp ba lần so với phƣơng pháp huyết 7.3.1.2 Phương pháp huyết Tính đặc hiệu cao phƣơng pháp huyết đặc điểm quan trọng Ngoài ra, phƣơng pháp cho phép xác minh nhanh tồn virus phân loại chúng Kết thu đƣợc chậm sau 48 Chi phí cho xét nghiệm thấp, để chứng minh virus khơng cần có nhà kính trồng Phƣơng pháp huyết lại có độ xác cao, nhiên ngƣời ta chƣa sản xuất đƣợc kháng thể tất loài virus kể có huyết chƣa nói kết xét nghiệm hồn tồn bảo đảm Vì với phƣơng pháp ngƣời ta khơng thể xác minh đƣợc đặc tính gây bệnh lồi virus thực vật chủ, có nhiều phƣơng pháp huyết khác đƣợc ứng dụng xét nghiệm hàng loạt hoa, có phƣơng pháp kết tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex, xét nghiệm miễn dịch hƣớng tâm Mỗi phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm đặc trƣng thơng số độ xác thƣờng thu đƣợc với dãy nồng độ dịch ép từ thực vật virus phân lập Nhiều nghiên cứu cho thấy coi độ nhạy cảm thƣờng thu đƣợc pha loãng dịch ép nhiều lần hoàn toàn cho phép tin tƣởng vào kết xét nghiệm hàng loạt Vì cần chọn phƣơng pháp thích hợp cho xét nghiệm hàng loạt 7.3.1.3 Xét nghiệm kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử với hoàn chỉnh kỹ thuật sau ứng dụng phƣơng pháp nhúng đƣa vào xét nghiệm hàng loạt với số lƣợng mẫu vừa phải Khi chứng minh virus hình đũa hình sợi hoa phong lan hoa huệ kính hiển vi điện tử mang lại kết đáng tin cậy xét nghiệm hàng loạt Khó khăn chủ yếu chi phí cho thiết bị số lƣợng mẫu đƣợc xét nghiệm bị hạn chế, đồng thời loại virus đƣợc chứng minh loại hình đũa hình sợi Nếu virus tồn dạng cầu khó phát giống quan tử tế bào thực vật bình thƣờng 7.3.1.4 Xét nghiệm phương pháp PCR Hiện nay, phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến cơng nghệ sinh học có nhiều tiềm ứng dụng khuếch đại gen phản ứng trùng hợp polymerase (polymerase chain reaction) máy PCR Bằng cách thiết kế cặp mồi (primers) đặc hiệu gen gây bệnh virus, ngƣời ta khuếch đại gen (nếu có) từ DNA hệ gen thực vật đƣợc xử lý làm virus Nếu không xuất sản phẩm PCR đặc trƣng gen virus sau phân tích điện di agarose gel ta kết luận đƣợc làm bệnh ngƣợc lại, đƣợc xử lý mang virus Phƣơng pháp có độ nhạy cao, xác tốn phƣơng pháp nói Hiện nay, ngƣời ta sản xuất thiết bị phân tích PCR có độ nhạy cao gọi Realtime- PCR (PCR thời gian thực hay gọi PCR định lƣợng) cho phép phân tích với nồng độ virus vơ thấp sinh vật bị nhiễm bệnh Kỹ thuật khắc phục đƣợc thời gian chờ đợi virus sinh sản tới nồng độ đủ cao để đảm bảo độ xác phƣơng pháp xét nghiệm Phƣơng pháp phân tích PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh ngƣời nhƣ sốt xuất huyết Dengue, viêm gan B, viêm gan C, Chlamydia Và rõ ràng hữu ích việc ứng dụng để xét nghiệm thực vật bị nhiễm bệnh virus, vi khuẩn vi nấm 7.3.2 Xử lý nhiệt Quá trình xử lý nhiệt đƣợc coi nhƣ biện pháp làm bệnh có sở thực tiễn Những mía mắc bệnh cho suất cao sau ngâm nƣớc nóng, nghiên cứu vấn đề cho thấy dùng khơng khí nóng thuận lợi hầu hết trồng chúng chịu đựng tốt virus bị loại trừ Những hiểu biết q trình làm bệnh thơng qua xử lý nhiệt chƣa đầy đủ Ngƣời ta nêu giả thiết chung virus bị ức chế sinh sản nhiệt độ từ 34-40oC Quá trình sinh trƣởng thực vật xử lý nhiệt bị ức chế nhƣng phận vừa đƣợc sinh trƣởng thƣờng nghèo virus Kết xử lý nhiệt cho thấy thể thực vật đƣợc bảo tồn trạng thái tối thích thời gian dài nhiệt độ cao Tốt nên xử lý với chu kỳ quang 16 giờ/ngày Nhiệt độ phải đƣợc kiểm tra liên tục máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lƣợng nhiệt cần thiết, độ ẩm tƣơng đối phải đạt trung bình 50% Để đảm bảo phân bố nhiệt độ đồng phòng cần phải có quạt gió Mỗi loài hoa thƣờng mẫn cảm khác nhiệt độ cao xử lý, ví dụ: hoa cúc có khả chịu đựng nhiệt lớn: 38oC thời gian nửa năm hoa anh túc Hoa thủy tiên chịu đƣợc nhiệt độ 34oC thời gian từ 4-6 tuần Trong số trƣờng hợp, ngƣời ta phải phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng vi ghép để loại trừ bệnh virus (Walkey, 1980; Kartha, 1986; Brown cs, 1988) Ƣu kỹ thuật sau qua xử lý nhiệt, mẫu ni cấy (hoặc vi ghép) thƣờng có kích thƣớc lớn Green Lo (1989) tạo giống khoai lang bệnh virus (bệnh vàng lụi) nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc nhỏ (0,3 mm) ni cấy đỉnh chồi kích thƣớc lớn (1,0 - 2,5 cm) sau xử lý mẹ 370 C đến hai tháng (hình 9) Kết tƣơng tự nhận đƣợc sắn (Kartha Gambong, 1975) Cây mẹ phần mẹ đƣợc xử lý nhiệt độ cao cách tăng nhiệt cách từ từ đạt nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ ức chế loại trừ virus khỏi vùng sinh trƣởng mạnh nhƣng không ảnh hƣởng đến sinh trƣởng Cây đƣợc lƣu giữ nhiệt độ tới hạn khoảng thời gian xác định, sau tách ni cấy chồi đỉnh sử dụng vi ghép Tỷ lệ bệnh mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn phụ thuộc vào khả chịu nhiệt giống (Converse Tanne, 1984; Lozoya-Saldana Merlin -Lara, 1984) Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trƣờng hợp, song mô tế bào nhiễm virus nhƣng không bị loại trừ nhiệt độ cao chủng virus có khả sinh sản nhiệt độ (Dawson, 1976) Kết hợp xử lý nhiệt độ thấp với nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đƣợc sử dụng thành công để loại trừ virus khỏi khoai tây hoa cúc (Paduch-Cichal Kryczynski, 1987) Bên cạnh đó, ngƣời ta sử dụng kết hợp số hố chất ức chế virus nhƣ ribavirin, vidarabine có gốc adenine để tạo giống bệnh (Cassells Long, 1980; Stone, 1982) Các hoá chất chống virus thƣờng độc cho mô nên ứng dụng kỹ thuật hạn chế 7.3.3 Ni cấy đỉnh phân sinh Ngƣời ta chứng minh đƣợc nồng độ virus thực vật giảm dần phận gần đỉnh sinh trƣởng riêng đỉnh phân sinh hồn tồn virus Thực tế đƣợc ứng dụng để làm virus cách tách đỉnh sinh trƣởng điều kiện vơ trùng ni cấy chúng thành thực vật hồn chỉnh Việc phân lập đỉnh phân sinh có kích thƣớc 0,01-0,1 mm khó khăn việc tái sinh thành hoàn chỉnh đạt đƣợc với tần số thấp (0,2-5%) ngƣời ta thƣờng phân lập chồi gọi đoạn đỉnh (shoot tips) có kích thƣớc từ 0,1- mm qua tính bệnh mẫu vật ni cấy bị giảm xuống nhƣng tốc độ tái sinh đƣợc tăng lên phƣơng pháp đƣợc ứng dụng thực tiễn Khái niệm virus thực vật nghĩa cần phải có đỉnh phân sinh hồn tồn sạch, phần tử virus mà đƣợc hồn thiện q trình phân hóa tế bào chƣa phân hóa Vì vậy, thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus khối lƣợng mơ phân hóa mức định cần có thực vật virus Việc phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh phƣơng pháp thuận lợi thơng qua xử lý nhiệt q trình sinh sản virus chồi bị ức chế mạnh thơng qua q trình phân hóa đỉnh phân sinh tính virus đƣợc đảm bảo với độ xác suất cao, không đề cập đến vấn đề chọn mơi trƣờng thích hợp Thơng thƣờng ngƣời ta xử dụng môi trƣờng Murashige-Skoog White Theo quan điểm lý thuyết kinh nghiệm thực tiễn ngƣời ta thu đƣợc kết khác phòng thí nghiệm, việc nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc thực quan điểm sản xuất lớn cần phải ý mặt sau đây: (a) đảm bảo độ đồng giống tất khâu nuôi cấy, (b) đảm bảo tốc độ sinh trƣởng nhanh số lƣợng đỉnh phân sinh lớn đồng thời (c) kết đƣa đất cần phải đƣợc bảo đảm Các đỉnh sinh trƣởng sau phân lập cần đƣợc nuôi buồng nuôi hồn tồn khống chế mặt khí hậu: nhiệt độ 22oC 16 chiếu sáng 1.000-3.000 lux Khi đƣa tái sinh từ đỉnh phân sinh ngồi đất cần phải phủ nilon để chúng thích nghi dần với độ ẩm khơng khí thấp Tốt nên trồng buồng nuôi cách ly có thơng khí hồn tồn rệp Từ tháng 10 đến tháng cần phải chiếu sáng thêm, nhƣng mùa hè lại phải che bớt ánh sáng 7.4 Kết thực tiễn sản xuất 7.4.1 Tạo giống bệnh 7.4.1.1 Cây khoai tây Khoai tây trồng châu Âu đƣợc nhân giống vơ tính bị virus phá hoại nhiều Trong thời gian qua việc làm virus khoai tây đƣợc ứng dụng cách chậm chạp trình trì giống Ngƣời ta ý nhiều tới việc tạo giống bệnh qui trình thử virus trồng khu vực bệnh để tránh tái nhiễm thơng qua lồi rệp Qui trình đƣợc sử dụng chủ yếu giết thảo truyền bệnh vào củ khoai tây Qui trình nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Quá trình xử lý nhiệt 32 38oC thời gian ngày đến tuần sau ni cấy đỉnh phân sinh loại trừ đƣợc virus A, xoăn lá, X Y virus M S đƣợc giảm cách đáng kể Các ảnh hiển vi điện tử đỉnh sinh trƣởng khoai tây có độ lớn từ 80-100 µm cho thấy chúng chứa tiêu tới 12 thể virus X Tuy vậy, sau trình phân loại từ đỉnh phân sinh thu đƣợc tỷ lệ phần trăm định virus 7.4.1.2 Cây thức ăn gia súc Để sản xuất hạt giống trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ ba cần phải có bố mẹ bệnh virus để tránh lây bệnh thông qua hạt giống đảm bảo thu đƣợc suất hạt cao Ngƣời ta nghiên cứu nhiều phƣơng pháp làm virus khác Xử lý lạnh nuôi chồi mang lại tốc độ sinh trƣởng cao, nhƣng virus phần, xử lý nhiệt kết hợp với ni cấy đỉnh phân sinh thu đƣợc phần lớn virus 7.4.1.3 Cây hoa bia Các loại bệnh virus hoa bia thƣờng làm giảm suất đáng kể Tiến hành chọn lọc mắt thƣờng, xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, cải tiến dần tình trạng bệnh ngƣời ta giải phóng 66% khỏi virus hop-mosaic (HMV) latent ni cấy đỉnh phân sinh, sau làm virus prumis necrotic ringspot (PNRV) xử lý nhiệt thời gian 10 ngày 7.4.1.4 Cây rau Hầu hết loài rau trừ vài trƣờng hợp ngoại lệ đƣợc nhân giống hạt Truyền bệnh virus qua hạt vừa đƣợc chứng minh loài virus gây bệnh khảm xà lách đậu (đậu ăn trắng xanh), trồng cần phải chọn lọc làm giống thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo hạt giống virus Đối với loài virus gây bệnh rau khác trình lây lan thƣờng xảy học rệp lá, cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng phòng trừ tác nhân truyền bệnh Ở số rau nhân giống vơ tính (nấm rơm, ) cần xử dụng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh xử lý nhiệt để giải phóng virus Đối với nấm rơm làm bệnh phƣơng pháp xử lý nhiệt thời gian gần ngƣời ta tạo đƣợc phƣơng pháp miễn dịch agar gel Ngoài ra, trồng dùng để sản xuất hạt chúng nhân giống vơ tính qua nhiều năm, ví dụ nhƣ súp-lơ ngƣời ta cần phải có vật liệu bệnh virus ban đầu Thơng qua nuôi cấy mô ngƣời ta tạo đƣợc vài trăm biện pháp thử virus thu đƣợc 3.220 bệnh 7.4.1.5 Cây ăn Cây ăn thƣờng bị virus phá hoại cách mạnh Các thể virus gây bệnh lan truyền nhân giống vơ tính mà nhân giống hạt Ngoài ăn thƣờng lâu năm, luôn chịu tác động tác nhân truyền bệnh chúng dễ bị nhiễm bệnh Việc chứng minh virus nhiễm ăn gặp nhiều khó khăn, thời gian ủ bệnh dài khả chống chịu cao gây nhiều khó khăn cho việc làm virus ăn quả, cần tiến hành công tác chống virus gây bệnh ăn cách liên tục Vì việc xử lý nhiệt thân gỗ việc ni cấy đỉnh phân sinh chúng khó khăn nhiều so với loài thân thảo từ lâu ngƣời ta xử dụng phƣơng pháp thử để tìm vật liệu bệnh ban đầu Quá trình xử lý nhiệt ăn đến thƣờng đƣợc tiến hành chủ yếu đoạn cành mà mắt chúng đƣợc xử dụng để ghép sau Theo tài liệu tổng hợp Nyland Coheen (1969) vấn đề xử lý nhiệt thân gỗ loại trừ đƣợc bốn loài virus anh đào, loài virus mận, bảy loài virus táo, hai virus nho đất (nho tây), sáu virus đào hai virus phúc bồn tử Thành công xử lý nhiệt ăn không đạt đƣợc 100% Ở đối tƣợng lại chí số lồi tới bốn virus khơng bị hoạt tính xử lý nhiệt Nuôi cấy đỉnh phân sinh ăn tới đƣợc sử dụng đối tƣợng sau: dâu chua, dâu chua đỏ, dâu chua đen táo Thực tiễn cho thấy ăn (cây thân gỗ) việc ni cấy đỉnh phân sinh gặp khó khăn khả tái sinh chúng yếu so với thân thảo Các thí nghiệm năm tới chắn nêu kết 7.4.1.6 Cây hoa Ở đối tƣợng hoa gặp nhân giống vơ tính thƣờng bị bệnh virus bƣớc đầu ngƣời ta tập trung làm bệnh hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên ) Hiện nay, ngƣời ta bắt đầu ni cấy lồi hoa khác Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc sử dụng để làm virus hoa anh túc hoa cúc Việc ứng dụng thực tiễn xí nghiệp chuyên sản xuất hoa trở thành quen thuộc năm gần Ở Hà lan, có sở tổ chức trồng hoa chuyên nhận loài vật liệu để làm virus Ở Anh, tổ chức quan tƣơng tự nhƣ Ở Đơng Đức (cũ) có xí nghiệp ƣơm thành phố Dresden nhân loài hoa nhƣ cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên để xử lý nhiệt làm virus Các điều kiện để làm virus hoa thƣờng đƣợc thực dễ dàng, lồi trồng việc làm virus thƣờng có kết Vì dƣới số biện pháp quan trọng nhƣ xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh xét nghiệm virus đƣợc trình bày đối tƣợng hoa 7.4.2 Kiểm định tính bệnh virus Nếu qui trình làm virus áp dụng đƣợc kỹ thuật xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh phân sinh việc xét nghiệm virus biện pháp kiểm tra cuối trình làm virus, nhƣ có mâu thuẩn với mục đích làm virus ngƣời ta sử dụng 50% tập đoàn trồng bị bệnh làm vật liệu ban đầu coi chúng có phẩm chất tốt, mặt thông qua cải tiến phƣơng pháp xét nghiệm đƣa độ xác phƣơng pháp lên cao ngƣời ta phải ln tính để số lƣợng virus bảo tồn nồng độ tối thiểu mà phƣơng pháp xét nghiệm khơng chứng minh đƣợc Vì vậy, theo kinh nghiệm thực tế cần tiến phải xét nghiệm theo phƣơng thức sau: Đƣa vật liệu ban đầu vào xử lý nhiệt thời gian dài để làm virus mẫn cảm nhiệt độ sau dùng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh sau từ 4-6 tháng kể từ ngày nuôi cấy bắt đầu xét nghiệm thời gian đủ virus bảo tồn đủ nồng độ cho phép chứng minh đƣợc Những thể đƣợc xác định bệnh nguồn vật liệu ban đầu để cung cấp mẹ cho sản xuất Khoảng 5-10% số thể đƣợc tách riêng thành tập đoàn nhân mạnh khoẻ (health nucleus clone) để nhà tạo giống cải tiến tính chất theo ý muốn độ chủng (đồng nhất) giống Ngƣời ta kiểm tra thể tất phƣơng pháp xét nghiệm virus có Với hoa nelken ngƣời ta kiểm tra phƣơng pháp huyết loài virus caruation woltle, caruation latent, caruation ringspot xét nghiệm thị Cheuopodium quinoa Vaccara pyramydata nhằm loại trừ virus sinh sản khơng có biểu nhận biết đƣợc Những xác minh đƣợc khoẻ đƣợc tiến hành ƣơm cành sau đƣa vào xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng cuối kiểm tra xét nghiệm virus Đó tồn qui trình làm virus khép kín Ngồi phƣơng pháp trình xét nghiệm kết làm virus phụ thuộc nhiều vào trạng thái cần đƣợc xét nghiệm, nghĩa nồng độ virus có phận khác nhau, tuổi khác nhau, mùa khác Muốn bảo đảm xét nghiệm hàng loạt xác cần phải có nhà ni Nhiệt độ ổn định, tƣơng quan ánh sáng ổn định xét nghiệm phải độ tuổi định với nồng độ virus thích hợp cho xét nghiệm, cho phép thu đƣợc kết xét nghiệm xác 7.4.3 Duy trì tính bệnh virus Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể vấn đề định cuối thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian trì đƣợc trồng virus Đối với thực tiễn sản xuất đƣợc coi bị bệnh xuất giảm xuống Hiện nay, sản xuất nông nghiệp trồng ăn vấn đề chƣa đƣợc giải thỏa đáng Việc sản xuất dòng Elite qui trình sản xuất khoai tây giống kéo dài nhiều năm, nguy tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh ln tồn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu Trong ngành trồng hoa tình hình thuận lợi nhiều Hiện CHLB Đức với tập đoàn nhân (nucleus clone) hoa cúc nelken ngƣời ta trì đƣợc tính bệnh năm rƣỡi, cần năm thay đƣợc hồn tồn tập đồn giống Vì vậy, vấn đề nêu đƣợc trả lời tóm tắt nhƣ sau: khối lƣợng chất lƣợng vật liệu có sẵn ban đầu xác định khả sản xuất vụ không bị giảm suất bệnh virus Giảm suất xuất nguồn giống virus bị nhiễm sớm Đối với khoai tây nhiễm chủ yếu yếu tố truyền bệnh sống điều kiện tự nhiên hoa tái nhiễm xảy đƣa giống bệnh vào xí nghiệp sản xuất bị nhiễm sẵn Có thể nói ngành trồng hoa qui trình làm virus đƣợc coi nhƣ mơ hình phƣơng pháp Cũng qua nhận thấy phƣơng pháp làm virus biện pháp chữa bệnh lần mà trình phức tạp trồng bị bệnh từ trƣớc Ngƣời ta so sánh bệnh virus thực vật nhân giống vơ tính nhƣ bệnh xã hội ngƣời chữa thuốc men mà phải thay đổi thói quen sinh hoạt Ở xí nghiệp cơng nghiệp sản xuất trồng gọi tiến khoa học kỹ thuật loại stress mà từ cúc mẹ năm cho 100 ƣơm, trƣớc thu đƣợc 15 ƣơm cần 11 ngày để rễ trƣớc cần 21 ngày Để tạo điều kiện cho xí nghiệp sản xuất công nghiệp giống thu đƣợc thành tích to lớn việc đầu tƣ hàng năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết Trong trƣờng hợp nhân giống vơ tính in vitro việc làm virus phải đƣợc coi điều kiện trƣớc tiên CÂU HỎI ÔN TẬP Nêu tầm quan trọng phƣơng pháp làm virus thong qua ni cấy mơ Trình bày ngun lý làm virus cho thực vật So sánh phƣơng pháp chuẩn đoán bệnh virus thực vật Trình bày kỹ thuật ni cấy đỉnh phân sinh Khái quát kết thực tiễn sản xuất phƣơng pháp tạo giống virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, (2003) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp Nhà xuất Nơng nghiệp 2) Lê Văn Hồng Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật, Nxb Đà nẵng 3) Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật công tác cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp 4) Nguyễn Văn Uyển, (1996) Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật NXB Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh ... tế bào trần thực vật tế bào động vật Thật thúc đẩy để lƣợng định tính khả chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt tế bào thực vật đƣợc loại bỏ vách tế bào enzym nhƣ trƣờng hợp tế bào. .. NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 KCl Sequestrence330Fe KI H3BO3 600 1900 600 300 170 300 28 0,75 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 10 0 ,25 0, 025 0, 025 (chỉnh pH tới... kết tế bào với Tế bào trần (protoplast) tế bào đƣợc tách khỏi màng tế bào (một lớp polyme bao bọc tế bào) màng liên kết tế bào Các enzym đóng vai trò chủ yếu phân huỷ màng tế bào tạo tế bào trần