Tách dòng gen cry4a cry4b mã hóa protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng baccillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thành phố nha trang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DỊNG GEN cry4A, cry4B MÃ HỐ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DỊNG GEN cry4A, cry4B MÃ HỐ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGÔ ĐÌNH BÍNH THÁI NGUN - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012 Tác giả Nguyễn Văn Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ, hỗ trợ thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn tất tình cảm q báu Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngơ Đình Bính, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn CN Đặng Văn Tiến tồn thể cán phịng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời thời gian dài thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giảng viên thầy cô giáo trường Đại học Khoa học nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập trường hoàn thành tốt luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình, người ln ủng hộ suốt thời gian qua! Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012 Học viên Nguyễn Văn Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đại cương Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis 1.1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái sinh thái học Bacillus thuringiensis 1.1.3 Phân biệt Bt với loài khác nhóm Bacillus cereus 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.5 Protein tinh thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.6 Đặc điểm phân loại Bacillus thuringiensis 1.1.7 Đặc điểm phân loại loài phụ Bti 1.1.8 Hệ gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bti 15 1.2.1 Tinh thể độc Bacillus thuringiensis var israelensis 16 1.2.2 Cấu trúc phân tử nhân độc tố Bti 17 1.2.3 Hoạt tính diệt trùng Bti 18 1.2.4 Tác động Bti đến sinh vật khác 19 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nước giới 19 1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng giới 19 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 20 1.4 Tổng quan côn trùng thử nghiệm 21 1.4.1 Phân loại khoa học muỗi 21 1.4.2 Vòng đời muỗi 23 1.4.3 Khả gây bệnh muỗi 24 1.4.4 Sơ lược côn trùng thử nghiệm: 24 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Sinh phẩm 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 2.1.2 Hố chất mơi trường 29 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32 2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ bào tử 33 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 34 2.2.4 Kỹ thuật định typ huyết 35 2.2.5 Khuyếch đại gen mã hóa độc tố phản ứng PCR 35 2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 37 2.2.7 Phương pháp điện di gel agarose 38 2.2.8 Phương pháp gel 39 2.2.9 Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 40 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ mẫu 43 3.2 Sự đa dạng tinh thể chủng phân lập 44 3.3 Phân loại loài chủng Bacillus thuringiensis 45 3.4 Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus chủng Bacillus thuringiensis 46 3.4.1 Xác định nồng độ bào tử 46 3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính 46 3.5 Phát gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi chủng Bacillus thuringiensis phân lập 49 3.6 Tách dịng, đọc trình tự gen cry4A cry4B 52 3.6.1 Tách dòng gen cry4A gen cry4B 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chƣ̃ viết tắt STT Chƣ̃ viết đầy đủ Bp Base pair – Cặp Base Bt Bacillus thuringiensis dH2O Deion water – Nước khử ion DNA Deoxyribonucleotide acid – Axit Nucleic ĐC Đối chứng E coli Escherichia coli h Giờ kDa Kilo Dalton OD Optical density – mật độ quang học 10 PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution – Dung dịch tách triết DNA plasmid 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5-Bromo-4 Cloro-3 indolyl β-D galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt lồi nhóm chi Bacillus Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa protein độc tố Cry diệt trùng 11 Bảng 1.2 Đặc điểm số protein độc tố Cry 13 Bảng 3.1 Thống kê số lượng chủng Bt phân lập hình dạng tinh thể chủng phân lập 44 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus chủng phân lập sau khoảng thời gian khác nhau, nồng độ khác 46 Bảng 3.3 Kết khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 chủng phân lập 50 Bảng 3.5 So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với trình tự công bố ngân hàng gen quốc tế phần mềm Blast 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc chung protein độc tố Cry Hình 1.4 Cơ chế tác động protein tinh thể độc lên côn trùng 12 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển muỗi 23 Hình 1.6 Muỗi Anopheles trưởng thành(A) vòng đời muỗi Anopheles(B) 25 Hình 1.7 Ấu trùng(A) muỗi Aedes trưởng thành (B) 26 Hình 1.8 Muỗi Culex trưởng thành 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Bacillus thuringiensis phát triển môi trường MPA sau 72 ni cấy 43 Hình 3.2 Hình thái bào tử tinh thể chủng ĐNT8.1 chụp kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần 44 Hình 3.3 Phản ứng ngưng kết Bacillus thuringiensis var israelensis với kháng huyết 45 Hình 3.4 Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus chủng phân lập 49 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Cry4A gel agarose1% 51 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry4B gel agarose1% 51 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc xanh – trắng môi trường LBA 53 Hình 3.8 Hình ảnh kết điện di sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc biến nạp gen cry4A gel agarose 0,8 % 54 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid gel agarose 0,8 % 55 Hình 3.10 Hình ảnh kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen cry4A và cry4B từ dòng plasmid tái tổ hợp: 56 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự gen cry4A 59 Hình 3.12 Kết so sánh trình tự gen cry4B 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU M̃i là l ồi côn trùng truyền nhiều bệnh nguy hiểm Các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết , viêm não Nhật Bản , sùi chân voi , giun chỉ muỗi truyền thực sự đã và đe dọa sinh mạng hàng triệu người Hằng năm có khoảng 270 triệu người mắc bệnh sốt rét , làm chết hàng triệu người Hàng triệu mắc bệnh sốt xuất huyết và các bệnh khác Ở Việt Nam, theo số liệu Tổng cục Thống kê, tháng đầu năm 2012 nước có 51,3 nghìn trường hợp mắc bện h sốt xuất huyết , đó 42 ca tử vong , 16 nghìn trường hợ p mắc bệnh sớt rét , 554 trường hợp mắc bệnh viêm não Nhật Bản , đó 15 trường hợp tử vong (64) Có nhiều biện pháp hoá học sinh học áp dụng để khắc phục tình trạng Tuy nhiên biện pháp hố học lại thường gây tính kháng thuốc côn trùng, sau khoảng gian ngắn thuốc hố học lại khơng cịn tác dụng đồng thời thuốc hố học cịn gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng góp phần làm cân sinh thái Vì vậy, biện pháp sinh học khuyến khích sử dụng Một vi sinh vật quan tâm sử dụng nhiều vi khuẩn Bacillus thuringiensis Sở dĩ đặc tính sinh protein tinh thể độc có khả diệt côn trùng gây hại như: Côn trùng cánh vảy, hai cánh, cánh cứng Vi khuẩn Bacillus thuringiensis ứng dụng để diệt côn trùng gây hại theo phương pháp: thuốc diệt trừ sinh học Bt Việc nghiên cứu hoạt tính diệt trùng chủng Bt phân lập Việt Nam đặc biệt hoạt tính diệt muỗi, ruồi cần thiết nhằm tìm chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho việc diệt ruồi, muỗi Protein tinh thể độc Cry4A, Cry4B hai nhiều protein có hoạt tính chống lại trùng hai cánh Xuất phát từ mục đích chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dịng gen cry4A, cry4B mã hoá 59 ĐNT22.8-4A AAGAAATTGA TGCCATCATG AATGTTCCAG CTGATTTAAA CTATCTGTAT CCTTCTACCT EF424472 AAGAAATTGA TGCCATCATG CATGTTCCAG CTGATTTAAA CTATCTGTAT CCTTCTACCT 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A GTGATTGTGA AGCGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA ĐNT22.8-4A TTGATTGTGA AGGGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA EF424472 GTGATTGTGA AGCGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG ĐNT22.8-4A CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG EF424472 CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG ĐNT22.8-4A ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG EF424472 ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG ĐNT22.8-4A GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG EF424472 GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA ĐNT22.8-4A AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA EF424472 AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | ĐNT20.2-4A AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG ĐNT22.8-4A AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG EF424472 AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG 1030 | | ĐNT20.2-4A CGAAACAAGC CAT ĐNT22.8-4A CGAAACAAGC CAT EF424472 CGAAACAAGC CAT Hình 3.11 Kết so sánh trình tự gen cry4A Kết cho thấy đoạn đặc hiệu cho gen cry4A mã hóa cho protein Cry4A vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israenlensis Đoạn gen có độ tương đồng 99% so với trình tự có số đăng ký EF424472 60 plasmid ĐNT20.2 – 4A có vị trí thay đổi: 130: thêm nucleotide (T), 330 (C → A), 366: (T → C), Và plasmid ĐNT22.8 có vị trí thay đổi 621: (A → C), 661: (T → G), 673: (G → C) * Trình tự gen cry4B Tương tự gen cry4B, đoạn gen đọc trình tự có kích thước 321 nucleotide Trình tự kiểm tra, phân tích so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế phần mềm Bioedit, Blast Kết sau: Bảng 3.5 So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với trình tự công bố ngân hàng gen quốc tế phần mềm Blast Accession Description Max Total Query score score coverage E value Max ident Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt1 EF468625.1 pesticidal crystal protein gene, complete 577 577 100% 1e-161 99% 577 577 100% 1e-161 99% 577 577 100% 1e-161 99% 577 577 100% 1e-161 99% 577 674 100% 1e-161 99% 577 577 100% 1e-161 99% AY729887.1 delta-endotoxin (cry4BLB) gene, complete 571 571 100% 6e-160 98% 566 100% 3e-158 98% cds Bacillus thuringiensis strain PBT602 130 AY847707.1 kDa crystal protein (cry) gene, complete cds Bacillus thuringiensis israelensis bt8 gene X07423.1 for 130 kDa crystal protein (mosquitospecific toxin) X07082.1 AL731825.1 Bacillus thuringiensis gene for 130 kDa delta-endotoxin Bacillus thuringiensis subsp israelensis plasmid pBtoxis Bacillus thuringiensis israelensis plasmid D00247.1 gene for 130 kDa insecticidal protein (ISRH3), complete cds Bacillus thuringiensis serovar israelensis cds EF468628.1 Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt4 566 61 Accession Description Max Total Query score score coverage E value Max ident pesticidal crystal protein gene, complete cds Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt3 EF468627.1 pesticidal crystal protein gene, complete 566 566 100% 3e-158 98% 566 566 100% 3e-158 98% 560 560 99% 1e-156 98% 555 555 100% 6e-155 97% 555 555 100% 6e-155 97% EF182769.1 israelensis/tochigiensis cry4B gene, partial 507 507 88% 2e-140 98% 505 505 89% 6e-140 98% 420 420 81% 2e-114 95% cds Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt2 EF468626.1 truncated pesticidal crystal protein gene, complete cds M20242.1 B.thuringiensis mosquitocidal protein (CryD2) gene, complete cds Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt6 EF468630.1 pesticidal crystal protein gene, complete cds Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt5 EF468629.1 pesticidal crystal protein gene, complete cds Bacillus thuringiensis serovar cds DQ910833.1 Mutant Bacillus thuringiensis Cry4B (cry4B) gene, partial cds Bacillus thuringiensis strain LDC-9 DQ078743.1 pesticidal crystal protein cry4B-like (cry4B) gene, complete cds 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | ĐNT5.4-4B CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA ĐNT20.2-4B CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA AY729887.1 CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ĐNT5.4-4B AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG ĐNT20.2-4B AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG AY729887.1 AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG 130 140 150 160 170 180 62 | | | | | | | | | | | | ĐNT5.4-4B CTATTCAACC ATTAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA ĐNT20.2-4B CTATTCAACC ATCAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA AY729887.1 CTATTCAACC ATCAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | ĐNT5.4-4B TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG ĐNT20.2-4B TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG AY729887.1 TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | ĐNT5.4-4B AAGTTGTGAA TGCACAGTTA ACAAAAGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG ĐNT20.2-4B AAGTTGTGAA TGCACTGTTT ACAAATGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG AY729887.1 AAGTTGTGAA TGCACTGTTT ACAAATGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG 310 320 | | | | ĐNT5.4-4B ATTATGACAT AGATCAAGCC G ĐNT20.2-4B ATTATGACAT AGATCAAGCC G AY729887.1 ATTATGACAT AGATCAAGCC G Hình 3.12 Kết so sánh trình tự gen cry4B Trình tự đoạn đặc hiệu gen cry4B cho thấy đoạn đặc hiệu gen cry4B mã hóa cho protein Cry4B vi khuẩn Bacillus thuringiensis Đoạn gen chủng ĐNT 5.4 có độ tương đồng 98% so với trình tự có số đăng ký AY729887.1, đoạn gen có vị trí thay đổi: 133 (T → C), 256 (A → T), 266 (A → T) Trong đó, đoạn gen cry4B chủng ĐNT20.2 có độ tương đồng 100% với trình tự so sánh 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 31 mẫu đất thu thập từ vùng khác Nha Trang phân lập 383 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Trong đó, xác định 185 chủng Bacillus thuringiensis có khả hình thành tinh thể với số Bt 0,483 tần suất xuất Bt 0,871 Đã xác định 120 chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 64,56%, 40 chủng sinh tinh thể hình tháp chiếm 21,62%, chủng sinh tinh thể hình lập phương chiếm 2,16%, chủng sinh hai loại tinh thể hình tháp hình cầu chiếm 2,7% 16 chủng sinh tinh thể hình khơng xác định chiếm 8,65% Đã tiến hành thử nghiệm khả diệt ấu trùng muỗi 43 chủng phân lập với ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus Sau 24 thử hoạt tính nồng độ 106 bào tử/ml, tất chủng thử nghiệm có hoạt lực diệt ấu trùng muỗi với tỷ lệ > 75 % Trong đó, có 50% chủng có tỷ lệ diệt 100% 185 chủng Bt được phân loại tới loài phương pháp huyết thanh, 43 chủng (23,2%) ngưng kết với typ huyết H-14, Bacillus thuringiensis subsp israelensis Từ 30 chủng phân lập có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi cao, sàng lọc 16 chủng mang gen cry4A cry4B, có 14 chủng (46,6 %), chứa gen cry4A cry4B, 01 chủng (3,4 %) chứa gen cry4A, 01 chủng (3,4 %) chứa gen cry4B, 14 chủng không mang hai gen cry4A cry4B, chiếm 46,6 % Đã tiến hành đọc trình tự gen cry4A chủng ĐNT20.2 ĐNT22.8 có tương đồng 99% với chủng EF424472 công bố ngân hàng gen quốc tế 64 Đã tiến hành đọc trình tự gen cry4B chủng ĐNT20.2 ĐNT5.4, chủng ĐNT5.4 có độ tương đồng 99% chủng ĐNT20.2 có độ tương đồng 100% với chủng AY729887.1 công bố ngân hàng gen quốc tế KIẾN NGHỊ Từ 30 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi có chủng có hoạt tính cao, cần tiếp tục nghiên cứu thêm để phục vụ cho trình sản xuất chế phẩm sinh học diệt muỗi thay loại thuốc hóa học nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng môi trường sinh thái Cần nghiên cứu biểu toàn gen để tạo Pr tinh thể diệt ấu trựng mui 65 TàI LIệU THAM KHảO Tài liệu tiÕng ViƯt Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hồi Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dịng biểu gen mã hóa protein cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2, tr 830-833 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Phạm Minh Hƣơng, Vi Thị Đoan Chính (1995), Nghiên cứu bảo quản lâu dài chủng giống vi sinh vật, Kỷ yếu, NXB Khoa học kĩ thuật, tr 378-383 Ng« Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Anh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kû u 20012002 ViƯn C«ng nghƯ Sinh häc, tr 396-302 Ngơ Đình Bính, Ngũn Đì nh T́n, Trịnh Thị Thu Hà (2009), Hiệu quả diệt ấu trùng muỗi của chế phẩm Bacillus thuringiensis subsp iraelensis sản xuất tại Việt Nam Tạp chí Khoa học và Cơng nghê , ̣ số 47 tr 45-53 Ngô Đì nh Bí nh, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Nguyễn Đì nh Tuấn, Phạm kiều Thúy, Đặng Văn Tiến Phân lập vi sinh vật diệt muỗi xây dựng thư viện vi sinh vật di ệt côn trùng gây hại báo cáo kế t quả thực hiện đề tài hợp tác với Hiệp hội thức đẩy khoa học Nhật Bản 2007 2010 Hà Nội, 2011 Vũ Thị Phan (1996), Dịch tễ học bệnh sốt rét phòng chống sốt rét Việt Nam, Hà Nội, NXB Y học, tr 295 66 Tµi liƯu tiÕng Anh Ash, C., J A E Farrow, M Darsh, E Stackebrandt, and M D Collins (1991), Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA Int J Syst Bacteriol 41:343-346 Asutake Koichi, Saitoh Hiroyuki, Mizuki Eiichi, Binh Ngo Dinh Binh, Ohba Michio (2007), Characterization of three mosquitocidal Bacillus thuringiensis strains isolated from urban soils of Hanoi, Vietnam Med Entomol And Zool Vol.58 (1), 53-58 De Barjac H.D., E Frachon (1990), Entomophaga, Vol.35 233-240 10 Becker, N., and J Margalit (1993), Use of Bacillus thuringiensis var israelensis against mosquitoes and blackflies, p 145-170 In P F Entwistle, P F Cory, M J Bailey, and S Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice J Wiley & Sons, New York, N.Y 11 Balaraman, K., Balasubramanian, M & Manonmani L.M (1983), “Bacillus thuringiensis H-14 (VCRC B-17) formulation as mosquito larvicide”, Indian Journal of Medical Research, 77, 33-37 12 Barjac, H de (1978), “A new subspecies of Bacillus thuringiensis very toxic for mosquitoes: Bacillus thuringiensis var israenlensis serotype 14”, C R Acad Sci., 286, 797-800 13 Ben-Dov E, M Einav, N Peleg, S Boussiba and A Zaritsky (1996), “Restriction map of 125 kilobase plasmid of Bacillus thuringiensis var israenlensis carrying the genes that encode delta-endotoxin active against mosquito larvae”, Appl Environ Microbiol 62, 3140-4145 67 14 Bernhard, K., P Jarrett, M Meadows, J Butt, D J Ellis, G M Roberts, S Pauli, P Rodgers, and H D Burges (1997), Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests J Invertebr Pathol 70:59-68 15 Bietlot, H P., J P Schernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R S Bhella, and H Kaplan (1993), Evidence that the CryIA crystal protein from Bacillus thuringiensis is associated with DNA J Biol Chem 268:8240-8245 16 Binh Ngo Dinh (2005), Research, production and application of Bacillus thuringiensis in Vietnam In Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its Environmental Impact Proceedings of the 5th Pacific Rim Conference Edited by Ngo Dinh Binh, Ray J Akhurst, Donald H Dean Science and Technics Publishing House, V 5, 21-30 17 Binh Ngo Dinh (2007), Biopesticide highly Compatible in Integrated Pest Management System In Vietnam Proceedings of The first International Meeting for Development of IPM in Asia and Africa Chiang Mai University, Chiang Mai, Thailand, 49 - 59 18 Ngo Dinh Binh, Nguyen Dinh Tuan, Nguyen Van Dao (2007), Development Application biopesticides of insecticide Bacterium Bacillus thuringiensis International conference on Scientific research in Open Universitiers 19 Bravo, A (1997), Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis δendotoxin family proteins and their functional domains J Bacteriol 179:2793-2801 20 Burges H D (2001), Bacillus thuringiensis in Pest Control Pesticide Outlook p 90-98 68 21 Carlson, C R., and A.-B Kolstø (1993), A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 22 Carlson, C R., D A Caugant, and A.-B Kolstø (1994), Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains Appl Environ Microbiol 60:1719-1725 23 Carroll, J., and D J Ellar (1997), Analysis of the large aqueous pores produced by a Bacillus thuringiensis protein insecticide in Manduca sexta midgut-brush-border-membrane vesicles Eur J Biochem 245:797-804 24 Chicott, C N., Wigley, P J (1993), Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting P 43-52 25 Clarke, G R (1994), “Bacillus thuringiensis var israenlensis in mosquito control”, Proceeding of the 1st Brisbane Symposium Biopesticides: Opportunities for Australian Industry, 87-90 26 Colbo, M.H & Undeen, A H (1980), “Effect of Bacillus thuringiensis var israenlensis on non-target insects in streammtrials for control of Simuliidae”, Mosquito News, 40, 368-371 27 Crickmore, N., D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, and D H Dean (1998), Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev 62:807-813 28 Crickmore, N., Bone, E.,J., Williams, J.A., Ellar, D.J (1995), “Contribution of individual components of delta-endotoxin crystal to the mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis subsp Israenlensis”, FEMS Microbiol Lett., 131, 249-254 29 Deacon, J The microbial world: Bacillus thuringiensis www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 69 30 Drobniewski, F A (1994), “The safety of Bacillus species as insect vector control agents”, Journal of Applied Bacteriology, 76, 101-109 31 Estruch, J J., G W Warren, M A Mullins, G J Nye, J A Craig, and M G Koziel (1996), Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects Proc Natl Acad Sci USA 93:5389-5394 32 Feitelson, J S (1993), The Bacillus thuringiensis family tree, p 63-71 In L Kim (ed.), Advanced engineered pesticides Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y 33 Federici, B A (1995), “The future of microbial insecticides as vector control agents”, Vector control without chemical: has it future? A sixteenth annual meeting of American Mosquito Control Association, 11, 260-268 34 Gillett, J D (1972), The Mosquito: Its Life, Activities and Impact on Human Affairs, Doubleday, Garden City, NY, 358p 35 Goldberg, I H & Margalit, J (1977), “A bacterial spore demontrating rapid larvicidal activity agaínt Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiclata, Culex univattatus, Aedes aegypti and Culex pipien”, Mosquito News 37, 355-358 36 Grochulski, P., L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler (1995), Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation J Mol Biol 254:447-464 37 Hershey, A E., Shannon, L., Axter, R., Ernst, C and Mickelson, P (1995), “Effects of methoprene and Bti on non-target insects”, Hydrobiologia, 308, 219-227 38 Kalman, S., K L Kiehne, N Cooper, M S Reynoso, and T Yamamoto (1995), Enhanced production of insecticidal proteins in 70 Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes Appl Environ Microbiol 61:3063-3068 39 Kronstad, J W., and H R Whiteley (1986), Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes Gene 43:29-40 40 Lacey, S., and Lawsence (1997), “Laboratory Bioascay of bacteria against aquatic insects with emphasis on lavare of mosquitoes and black flies”, Manual of techniques insect pathology, 6, 79-90 41 Lawrence A Lacey (1997), Manual of Techniques in Insect parthology A Cademic press 79-88 42 Lecadet M-M, Frachon E., Cosmao Dumanoir V., Ripouteau H., Hamon S., Lauren P., Thiery I (1999), Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis Journal of Applied Microbiology 86: 660-672 43 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S (2003), The Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Ab δ-Endotoxin Appl Environ Microbiol 69: 4648-4657 44 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S Shotkoski, F (2003), Vip3A: A novel Insceticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity 45 Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet (1983), Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM Mol Gen Genet 191:307-313 46 Li, J., J Carroll, and D J Ellar (1991), Crystal structure of insecticidal -endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution Nature 353:815-821 71 47 Mulla, M S (1990), “Activity, field efficacy, and use of Bacillus thuringiensis var israenlensis aganinst mosquitoes”, Bacterial Control of Mosquitoes and Black Flies, 134-160 48 Mulla, M S., Federici, B A & Darwazeh, H A (1980), “Effectiveness of bacterial pathogen Bacillus thuringiensis serotype H-14 against mosquito larvae”, Forty Eighth Annual Conference of the California Mosquito and vector control Association, Inc, 1980, 25-27 49 Poncet, S., Delecluse, A., Klier, A., Rapoport, G., (1995), “Evaluation of synergistic enteractions among the CryIVA, CryIVB and CryIVD toxic components of Bacillus thuringiensis subsp Israenlensis crystals”, J Invertebr Pathol., 66, 131-135 50 Ohba, M., and Aizawa, K (1986), Distribution of Bacillus thuringiensis in soil of Japan J invertebr Pathol Vol.47, 12-20 51 Ruud A de Maagd, Alejandra Bravo, Neil Crickmore (2001), How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world TRENDS in Genetics, p 193-199, Vol 17, No 52 Sambrook j and Russell wd (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd, ed Cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor NY (mới-phần tế bào khả biến) 53 Schnepf , E., N Crickmore, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, J Feitelson, D R Zeigler, D H Dean (1998), Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Protein Microbiology and Molecular Biology Reviews, p 775-806, Vol 62, No 54 Shimizu, T., and K Morikawa (1996), The -prism: a new folding motif Trends Biochem Sci 21:3-6 55 Spielman, A , and M D'Antonio (2001), Mosquito: A Natural History of Our Most Persistent and Deadly Foe Hyperion Press, New York, 256p 72 56 Takashi Yamamoto and Gary K Powell (1993), Bacillus thuringiensis Crystal Proteins: Recent Advances in Understanding Its Insecticidal Activity Advanced Engineered Pesticides Edited by Leo Kim Marcel Dekker, Inc., NY 3-42 57 Thiery and E Frachon (1997), Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bacteria Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology A academic press 55-57 58 Walker, E D., McDonald, E M & Kobayashi, J F (1985), “Smallscale field evaluations of Teknar, Abate and Dursban as Coquillettidia perturbans larvicides”, Proceedings New Jersey Mosquito Control Association., Inc., Atlantic City, New Jersey, 17-21 March 1985, 169-172 59.Wijnands L.M, Dufrenne J.B, van Leusden F.M (2002), Characterization of Bacillus cereus RIVM report 250912002/2002 60 World Health Organization (1999), Microbial Contro Agent Bacillus thuringiensis, Environment Health Criteria 217, Geneve, Swizerland 61 Yasutake Koichi, Saitoh Hiroyuki, Mizuki Eiichi, Binh Ngo Dinh, Ohba Michio (2007), “Characterization of three mosquitocidal Bacillus thuringiensis strains isolated from urban soils of Hanoi, Vietnam”, Medical entomology and zoology, 58, 53-58 62 www biols.susx.ac.uk/home/Neil-crickmore/bt/toxin 63 www.extoxnet.orst.edu/pips/bacillus.htm 64.www.ipmofalaska.com/files/Btprofile 64 http://www.gso.gov.vn./default.aspx?tabid=413&thangtk=09/2012 73 ... NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DỊNG GEN cry4A, cry4B MÃ HỐ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG Chuyên ngành: Công nghệ... - Phân lập chủng Bccillus thuringiensis từ mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang - Sàng lọc chủng Bt có khả diệt côn trùng hai cánh - Phát gen cry4A, cry4B phương pháp PCR - Tách dòng gen cry4A, cry4B. .. tài: ? ?Tách dịng gen cry4A, cry4B mã hố protein diệt trùng hai cánh từ chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ số mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang? ?? Mục tiêu đề tài - Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis