So sánh trình tự gen defensin ở một số giống ngô việt nam

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM QUANG HUY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGƠ VIỆT NAM Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VŨ THANH THANH Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Khoa Khoa học sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Quang Huy Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ngƣời hƣớng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài hồn chỉnh luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Khoa học sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có góp ý sâu sắc cho thời gian học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn cán bộ, kỹ thuật viên phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tốt để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè ln động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Quang Huy Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn i Mục lục iv Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng luận văn vii Danh mục hình luận văn viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu .2 Nội dung nghiên cứu .2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học .3 1.1.3 Giá trị dinh dƣỡng ngô .6 1.1.4 Giá trị kinh tế ngô 1.1.5 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 1.2 MỌT NGƠ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA NĨ ĐẾN Q TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN 13 1.2.1 Côn trùng hại ngơ q trình bảo quản nơng sản 13 1.2.2 Mọt ngô 14 1.3 DEFENSIN VÀ TÍNH KHÁNG MỌT 17 1.3.1 Defensin thực vật 17 1.3.2 Ứng dụng chuyển gen 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU 23 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .24 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Thiết bị 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí .25 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 26 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 33 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý trình tự gen .34 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 34 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT 34 3.1.1 Đặc điểm hình thái, khối lƣợng giống ngơ nghiên cứu 34 3.1.2 Kết đánh giá khả kháng mọt 35 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DEFENSIN 37 3.2.1 Kết tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA 37 3.2.2 Kết nhân gen defensin1 39 3.2.3 Kết tinh sản phẩm PCR 39 3.2.4 Kết tách dòng gen .40 3.2.5 Kết chọn dòng gen 41 3.2.6 Kết tách plasmid tái tổ hợp .42 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp base pair (cặp bazơ) cDNA complementary DNA cs cộng DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb kDa mRNA kilo base kilo Dalton messenger ribonucleic acid OD Optical density PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-acetate-EDTA X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Tỉ lệ phận hạt ngơ thành phần hóa học chúng .6 Bảng 1.2 Sản xuất ngô giới giai đoạn 1961 - 2012 Bảng 1.3 Tình hình sản xuất ngơ số nƣớc giới năm 2012 10 Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam từ 1975 - 2012 11 Bảng 1.5 Một số hoạt tính sinh học defensin thực vật 19 Bảng 1.6 Một số thực vật chuyển gen defensin .21 Bảng 2.1 Danh sách 10 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng 25 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 27 Bảng 2.4 Cặp mồi nhân gen defensin1 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nhân gen .29 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector .31 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng colony PCR 33 Bảng 3.1 Hình thái khối lƣợng hạt 10 mẫu ngô 34 Bảng 3.2 Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian 10 giống ngô nghiên cứu 36 Bảng 3.3 Phổ hấp thụ RNA bƣớc sóng 260nm 280nm mẫu ngô nghiên cứu .38 Bảng 3.4 Sự sai khác trình tự nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI .44 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng nucleotide gen defensin1 giống ngô TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI 45 Bảng 3.6 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngô TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI.46 Bảng 3.7 Hệ số tƣơng đồng amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 NCBI 46 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Mọt ngô Sitophilus zeamais trƣởng thành tác hại chúng 16 Hình 1.2 Hai lớp defensin thực vật 18 Hình 2.1 Hình thái hạt 10 mẫu ngơ thí nghiệm 24 Hình 2.2 Cấu trúc vector pBT 31 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian mẫu ngô nghiên cứu 37 Hình 3.2 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen defensin1 39 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm làm gen defensin1 40 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony PCR 41 Hình 3.5 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp .43 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide gen defensin1 TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 44 Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid suy diễn giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 NCBI .46 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Ngô ngũ cốc quan trọng giới với sản lƣợng hàng năm cao lúa mì lúa gạo Ở Việt Nam, ngô đƣợc đánh giá trồng có vai trị quan trọng cấu trồng nƣớc ta Ngô màu đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác Cây ngô không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật ni mà cịn trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Sản xuất ngô nƣớc không ngừng tăng diện tích, suất, sản lƣợng qua năm Trong năm tới, ngơ ngũ cốc có vai trị quan trọng nƣớc ta Có nhiều ngun nhân khiến cho suất ngô tỉnh miền núi phía Bắc thấp nhiều so với bình quân chung nƣớc điều kiện đất đai, khí hậu vùng thuận lợi cho việc trồng ngô nhiều vùng sinh thái khác Một số sâu bệnh hại ngơ, với mức thiệt hại ƣớc tính hàng năm từ 10 - 30% Theo Lê Doãn Diên [4] Việt Nam, tổn thất côn trùng gây cho ngũ cốc bảo quản khoảng 10% Tổn thất sau thu hoạch ngơ lớn, trung bình từ 13 - 15%; đặc biệt tỉnh vùng Trung du miền núi phía Bắc, việc sản xuất ngơ vụ Xuân thƣờng gặp nhiều khó khăn cho việc thu hái, bảo quản, sơ chế ngô điều kiện mƣa kéo dài giai đoạn cuối vụ thu hoạch Ngô không đƣợc bảo quản bảo quản không quy trình giảm chất lƣợng nghiêm trọng Thơng thƣờng giá ngô giảm 10 - 20% sau khoảng - tháng tồn trữ bị nhiễm mọt nấm mốc Đây tổn thất lớn đồng bào dân tộc vùng núi phía Bắc ngơ nguồn thu nhập quan trọng gia đình Để giảm thiểu thiệt hại mọt gây ra, có số biện pháp phịng trừ nhƣ chọn lọc bệnh làm giống; vệ sinh đồng ruộng, luân canh trồng; vệ sinh nhà kho, phơi sấy hàng hóa; sử dụng lồi thiên địch có ích tự nhiên; sử dụng biện pháp hóa học mật độ dịch hại cao Tuy nhiên, biện Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ pháp nêu không mang lại hiệu thật cao mà cịn tốn cơng sức, tiền Vì vậy, việc tạo giống ngơ chuyển gen có khả kháng sâu bệnh, đặc biệt có khả kháng mọt có ý nghĩa Có nhiều chất có vai trị quan trọng bảo vệ trồng chống lại tác nhân gây bệnh côn trùng Theo nghiên cứu đƣợc công bố, defensin thực vật có liên quan đến đặc tính kháng mọt hạt Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “So sánh trình tự gen defensin số giống ngô Việt Nam” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh trình tự nucleotide gen defensin số giống ngơ địa phƣơng có khả kháng mọt khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả kháng mọt số giống ngô - Khuếch đại, chọn dịng xác định trình tự gen defensin1 giống ngơ (trong có giống kháng mọt tốt, giống kháng mọt kém) - So sánh trình tự gen defensin1 giống ngô nghiên cứu với trình tự cơng bố ngân hàng gen NCBI - So sánh trình tự amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngơ nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 chủng vi khuẩn E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt Sau đó, nuôi vi khuẩn E coli DH5α biến nạp mơi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin, chất X-gal, chất cảm ứng IPTG nhƣ mô tả mục 2.3.2.6 Sau 16 nuôi ổn định 37oC, khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng mọc đƣợc môi trƣờng chứng tỏ chúng mang vector pBT Khuẩn lạc xanh khuẩn lạc mang pBT tự đóng vịng nên cịn khả sinh tổng hợp protein βgalactosidase để phân giải chất X-gal từ khơng màu thành màu xanh Cịn khuẩn lạc màu trắng mang vector pBT gián đoạn gen lacZ nên phân giải chất thành màu xanh, dịng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp 3.2.5 Kết chọn dòng gen Chọn khuẩn lạc màu trắng đĩa thạch chuyển sang nuôi LB lỏng (có bổ sung carbenicillin) Để kiểm tra dịng khuẩn lạc trắng có mang gen defensin1 hay khơng, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi M13F M13R Kết đƣợc thể hình 3.4 M 400bp → 250bp → Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony PCR (M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); Giếng 1-2: dịng khuẩn lạc TQ1, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 Giếng 3-4-5: dòng khuẩn lạc chủng CB2) Khi sử dụng mồi M13 để kiểm tra, kích thƣớc gen quan tâm tăng 124bp so với PCR với mồi đặc hiệu Kết hình 3.4 cho thấy giếng 1, 2, 3, xuất vạch vị trí khoảng 370bp, phù hợp với tính tốn lý thuyết kích thƣớc gen quan tâm PCR với mồi M13 Có thể kết luận ban đầu dòng khuẩn lạc tƣơng tứng với giếng 1, 2, 3, mang gen quan tâm Giếng khơng xuất băng tƣơng ứng dịng khuẩn lạc mang plasmid bị đột biến đoạn gen lacZ trình tự bám mồi M13 nhƣng mang trình tự kháng kháng sinh nên sống môi trƣờng chọn lọc, không phân hủy chất tạo màu, không tạo sản phẩm tiến hành colony PCR Những dịng khuẩn lạc có mang gen defensin1 đƣợc nuôi LB lỏng tiến hành tách chiết plasmid để phục vụ việc giải trình tự 3.2.6 Kết tách plasmid tái tổ hợp Chọn lọc khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR để tách plasmid tái tổ hợp theo kit AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer) Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di gel agarose 1% TAE 1X Kết điện di thể hình 3.5 M 3000bp → Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 Hình 3.5 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp (M: DNA Marker 1kb (Fermentas); 1: Plasmid mang gen defensin1 giống TQ1 2: Plasmid mang gen defensin1 giống CB2) Kết điện di hình 3.5 cho thấy, sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen defensin1 đạt kết tốt, băng vạch gọn rõ nét Theo tính tốn lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2705 bp, sản phẩm PCR gen đích 243 bp plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 2950 bp Chứng tỏ plasmid tái tổ hợp không bị đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide gen defensin1 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN Để xác định trình tự nucleotide gen defensin1 tách dịng, chúng tơi gửi đọc trình tự thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) viện Công nghệ Sinh học Kết đƣợc phân tích phần mềm BioEdit Kết so sánh trình tự nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 với gen defensin1 ngơ có mã số JF797205 HG792392 ngân hàng gen NCBI đƣợc trình bày hình 3.6 bảng 3.4, 3.5 Kết cho thấy kích thƣớc gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 có kích thƣớc 243bp Nhƣ vậy, khuếch đại, tách dịng giải trình tự nucleotide thành cơng đoạn gen defensin1 giống địa phƣơng TQ1, CB2 So sánh trình tự nucleotide cho thấy trình tự khác vị trí 43, 69, 195, 212 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide gen defensin1 TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 Bảng 3.4 Sự sai khác trình tự nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI Vị trí Mẫu 43 69 195 212 JF797205 A G T C CB2 C A C C TQ1 C G C T HG792392 A G C C Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 Trình tự gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI có hệ số tƣơng đồng cao (98,7 – 99,5%) Kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI Vị trí Mẫu JF797205 JF797205 CB2 TQ1 HG792392 100 98,7 98,7 99,5 100 99,1 99,1 100 99,1 CB2 TQ1 100 HG792392 Việc nghiên cứu gen đó, ngồi trình tự nucleotide ngƣời ta cịn quan tâm đến trình tự amino acid phân tử protein sản phẩm gen Trên sở này, sử dụng phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen defensin1 giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 ngân hàng gen, kết đƣợc trình bày hình 3.7 bảng 3.6, 3.7 Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid suy diễn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 NCBI Kết cho thấy, trình tự amino acid suy diễn protein defensin1 giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 có độ dài 80 amino acid Tuy nhiên trình tự có khác vài vị trí, cụ thể: - CB2 khác biệt so với JF797205 HG792392 vị trí 15 (L → M), khác TQ1 vị trí 71 (T → M) - TQ1 khác JF797205 HG792392 vị trí 15 (L → M) 71 (M → T) Bảng 3.6 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngô TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI Vị trí 15 Mẫu 71 M (Methionine) T (Threonine) CB2 L (Leucine) T (Threonine) TQ1 L (Leucine) M (Methionine) M (Methionine) T (Threonine) JF797205 HG792392 Hệ số tƣơng đồng giống trình tự amino acid suy diễn 97,5 – 100% Từ kết thu nhận đƣợc nhận thấy giống có khả kháng mọt khác có sai khác trình tự amino acid suy diễn Trong vị trí số 71 CB2 (kháng mọt kém) threonine, amino acid phân cực ƣa nƣớc TQ1 (kháng mọt tốt) lại methionine thuộc nhóm amino acid không phân cực kị nƣớc Bảng 3.7 Hệ số tƣơng đồng amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 NCBI Vị trí Mẫu JF797205 JF797205 CB2 TQ1 HG792392 100 98,7 97,5 100 100 98,7 98,7 CB2 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 100 TQ1 97,5 100 HG792392 Sự sai khác trình tự nucleotide amino acid suy diễn sở để chúng tơi có nghiên cứu với nhiều giống ngô địa phƣơng so sánh hai nhóm kháng mọt tốt nhằm tìm kiếm tính quy luật thay đổi vị trí nucleotide amino acid liên quan đến tính kháng mọt giống ngơ Đây tiền đề sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống ngơ có khả kháng mọt tốt, suất cao, phục vụ sản xuất đời sống KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Khả kháng mọt giống ngơ có khác nhau, giống TQ1 giống kháng mọt tốt nhất, giống CB2 giống kháng mọt Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 Khuếch đại, chọn dịng thành cơng xác định trình tự nucleotide gen defensin1 hai giống ngơ TQ1 CB2 dài 243bp Trình tự nucleotide gen defensin1 giống TQ1, CB2 có hệ số tƣơng đồng cao 98,7 – 99,5% so với trình tự có mã số JF797205, HG792392 ngân hàng gen NCBI Sự khác biệt trình tự amino acid suy diễn protein defensin1 giống ngô TQ1, CB2 so với JF797205, HG792392 nằm vị trí 15, 71 với hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn 97,5 – 100% Đề nghị Cần tiếp tục xác định trình tự gen defensin1 số giống ngơ địa phƣơng có khả kháng mọt tốt khác để xác định xác thị phân tử liên quan để khả kháng mọt gen defensin1 Thiết kế vector mang gen defensin1 nhằm tạo ngơ chuyển gen có khả kháng mọt tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát trạng chất lượng ngơ huyện vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang số biện pháp thích hợp giảm tổn thất sau Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 thu hoạch, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học Công nghệ Hà Giang Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng suất, NXB Lao động - Xã hội Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngơ, lương thực trồng cạn biện pháp phịng trừ, NXB Lao động - Xã hội Lê Doãn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nơng nghiệp Trƣơng Văn Đích (2005), Kĩ thuật trồng ngô suất cao, NXB Khoa học Kỹ thuật Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Kim Hoa, Nguyễn Văn Liêm, Trần Thị Hƣờng, Nguyễn Thị Hiền (2008), "Đặc điểm sinh học chủ yếu mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch (Col.: Curculionidae) mọt bột sừng Gnathocerus cornutus Fabr (Col.: Tenebrionidae)", Hội nghị Côn trùng học lần thứ 6, tr:560–569 Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật dịch hại nông sản sau thu hoạch, NXB Nơng nghiệp Lê Đình Lƣơng, Lê Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp 10 Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình ngơ, NXB Nơng nghiệp 11 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội 12 Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần côn trùng hại kho Việt Nam năm 1996 - 2000, số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp 13 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 14 Ngơ Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An 15 Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho Việt Nam, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật 16 Nguyễn Kim Vũ (2000), Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài KH 08-12, Bộ Khoa học Công nghệ TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Allen A., Snyder A.K., Preuss M., Nielsen E.E., Shah D.M., Smith T.J (2008), "Plant defensins and virally encoded fungal toxin KP4 inhibit plant root growth", Planta, 227(2), pp:331–339 18 Almeida M.S., Cabral K.M., Kurtenback E., Almeida F.C., Valente A.P (2002), "Solution structure of Pisum sativum defensin by high resolution NMR: plant defensin, identical backbone with different mechanism of action", Mol Bio, 315, pp:749–757 19 Bloch Jr C., Richardson M (1991), "A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect α-amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat γ-purothionins", FEBS Lett, 279(1), pp:101–104 20 Carvalho A de O., Gomes V.M (2011), "Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications", Curr Pharm Des, 17(38), pp:4270–4293 21 Chang M.T (2005), "Corn Breeding Achievement in United States", Report in 9th Asian Regional Maize Workshop 22 Chen K.C., Lin C.Y., Kuan C.C., Sung H.Y., Chen C.S (2002), "A novel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid", J Agric Food Chem, 50(25), pp:7258–7263 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 23 Colilla F.J., Rocher A., Mendez E (1990), "γ-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm", FEBS Lett, 270(1–2), pp:191–194 24 Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M., Shah D.M., Liang J., Rommens C.M (2000), "Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide", Nat Biotechnol, 18(12), pp:1307–1310 25 Elfstrand M., Fossdal C.G., Swedjemark G., Clapham D., Olsson O., Sitbon F., Sharma P., Lönneborg A., Arnold S von (2001), "Identification of candidate genes for use in molecular breeding - A case study with the Norway spruce defensin-like gene, spi1", Silvae Genet, (50), pp:75–81 26 Gu Q., Kawata E.E., Morse M.J., Wu H.M., Cheung A.Y (1992), "A flowerspecific cDNA encoding a novel thionin in tobacco", Mol Gen Genet MGG, 234(1), pp:89–96 27 Harrison S.J., Marcus J.P., Goulter K.C., Green J.L., Maclean D.J., Manners J.M (1997), "An antimicrobial peptide from the Australian native Hardenbergia violacea provides the first functionally characterised member of a subfamily of plant defensins", Funct Plant Biol, 24(5), pp:571–578 28 Jha S., Tank H.G., Prasad B.D., Chattoo B.B (2009), "Expression of Dm-AMP1 in rice confers resistance to Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani", Transgenic Res, 18(1), pp:59–69 29 Kanzaki H., Nirasawa S., Saitoh H., Ito M., Nishihara M., Terauchi R., Nakumura I (2002), "Overexpression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast fungus (Magnaporthe grisea) in transgenic rice", TAG Theor Appl Genet Theor Angew Genet, 105(6-7), pp:809–814 30 Koike M., Okamoto T., Tsuda S., Imai R (2002), "A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation", Biochem Biophys Res Commun, 298(1), pp:46–53 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 31 Lai F.M., DeLong C., Mei K., Wignes T., Fobert P.R (2002), "Analysis of the DRR230 family of pea defensins: gene expression pattern and evidence of broad host-range antifungal activity", Plant Sci, 163(4), pp:855–864 32 Lay F., Anderson M (2005), "Defensins - Components of the Innate Immune System in Plants", Curr Protein Pept Sci, 6(1), pp:85–101 33 Liu Y.J., Cheng C.S., Lai S.M., Hsu M.P., Chen C.S., Lyu P.C (2006), "Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids", Proteins, 63(4), pp:777–786 34 Melo F.R., Rigden D.J., Franco O.L., Mello L.V., Ary M.B., Grossi de Sá M.F., Bloch C Jr (2002), "Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking", Proteins, 48(2), pp:311–319 35 Mendez E., Moreno A., Colilla F., Pelaez F., Limas G.G., Mendez R., Soriano F., Salinas M (1990), "Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm", Eur J Biochem, 194(2), pp:533–539 36 Mendez E., Rocher A., Calero M., Girbés T., Citores L., Soriano F (1996), "Primary structure of omega-hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems", Eur J Biochem FEBS, 239(1), pp:67–73 37 Moreno M., Segura A., García-Olmedo F (1994), "Pseudothionin-St1, a potato peptide active against potato pathogens", Eur J Biochem FEBS, 223(1), pp:135– 139 38 Osborn R.W., De Samblanx G.W., Thevissen K., Goderis I., Torrekens S., Van Leuven F., Attenborough S., Rees S.B., Broekaert W.F (1995), "Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae", FEBS Lett, 368(2), pp:257–262 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 39 Park H.C., Kang Y.H., Chun H.J., Koo J.C., Cheong Y.H., Kim C.Y., Kim M.C., Chung W.S., Kim J.C., Yoo J.H (2002), "Characterization of a stamenspecific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage", Plant Mol Biol, 50(1), pp:59–69 40 Pelegrini P.B., Lay F.T., Murad A.M., Anderson M.A., Franco O.L (2008), "Novel insights on the mechanism of action of alpha-amylase inhibitors from the plant defensin family", Proteins, 73(3), pp:719–729 41 Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular cloning, A laboratory manual, Vol 2, Third edition, CSHL Press, pp:8.1-8.24 42 Snelson J.T (1987), Grain protectants, ACIAR Monographs Series 3, Australian Centre for International Agricultural Research 43 Stiekema W.J., Heidekamp F., Dirkse W.G., Beckum J van, Haan P de, Bosch C ten, Louwerse J.D (1988), "Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs", Plant Mol Biol, 11(3), pp:255–269 44 Stotz H.U., Thomson J.G., Wang Y (2009), "Plant defensins: defense, development and application", Plant Signal Behav, 4(11), pp:1010–1012 45 Stotz H.U., Spence B., Wang Y (2009), "A defensin from tomato with dual function in defense and development", Plant Mol Biol, 71(1-2), pp:131–143 46 Tavares L.S., Santos M de O., Viccini L.F., Moreira J.S., Miller R.N.G., Franco O.L (2008), "Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers", Peptides, 29(10), pp:1842–1851 47 Terras F.R., Eggermont K., Kovaleva V., Raikhel N.V., Osborn R.W., Kester A., Rees S.B., Torrekens S, Leuven F.V., Vanderleyden J (1995), "Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense.", Plant Cell Online, 7(5), pp:573–588 48 Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F., Van Leuven F., Rees S.B., Vanderleyden J., Cammue B.P., Broekaert W.F (1992), "Analysis of two novel Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds", J Biol Chem, 267(22), pp:1530115309 49 Thevissen K., Franỗois I.E.J , Takemoto J.Y., Ferket K.K , Meert E.M , Cammue B.P (2003), "DmAMP1, an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii), interacts with sphingolipids from Saccharomyces cerevisiae", FEMS Microbiol Lett, 226(1), pp:169–173 50 Thomma B., Cammue B., Thevissen K (2002), "Plant defensins", Planta, 216(2), pp:193–202 51 Wang B., Yu J., Zhu D., Zhao Q (2013), "Maize defensin ZmDEF1 is involved in plant response to fungal phytopathogens", Afr J Biotechnol, 10(72), pp:16128–16137 52 Wang Y., Nowak G., Culley D., Hadwiger L.A., Fristensky B (1999), "Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola (Brassica napus)", Mol Plant Microbe Interact, 12(5), pp:410–418 53 Wijaya R., Neumann G.M., Condron R., Hughes A.B., Polya G.M (2000), "Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin", Plant Sci Int J Exp Plant Biol, 159(2), pp:243–255 54 Yount N.Y., Wang M.S., Yuan J., Banaiee N., Ouellette A.J., Selsted M.E (1995), "Rat neutrophil defensins Precursor structures and expression during neutrophilic myelopoiesis", J Immunol Baltim Md 1950, 155(9), pp:4476–4484 55 Zainal Z., Marouf E., Ismail I., Fei C.K (2009), "Expression of the Capsicuum annum (chili) defensin gene in transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogens", Am J Plant Physiol, 4(2), pp:70–79 56 Zhang Y., Lewis K (1997), "Fabatins: new antimicrobial plant peptides", FEMS Microbiol Lett, 149(1), pp:59–64 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 57 Zhu Y.J., Agbayani R., Moore P.H (2007), "Ectopic expression of Dahlia merckii defensin DmAMP1 improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen vigor", Planta, 226(1), pp:87–97 TÀI LIỆU INTERNET 58 http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maize&oldid=604761244 59 http://faostat.fao.org/ 60 http://igc.int/downloads/gmrsummary/gmrsumme.pdf 61 http://invasive.org/browse/detail.cfm?imgnum=52050 62 https://ncbi.nlm.nih.gov/ 63 http://nmri.org.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... gen defensin1 giống ngơ (trong có giống kháng mọt tốt, giống kháng mọt kém) - So sánh trình tự gen defensin1 giống ngơ nghiên cứu với trình tự cơng bố ngân hàng gen NCBI - So sánh trình tự amino... CỨU So sánh trình tự nucleotide gen defensin số giống ngơ địa phƣơng có khả kháng mọt khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả kháng mọt số giống ngô - Khuếch đại, chọn dịng xác định trình tự gen. .. trình tự nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205 HG792392 NCBI .44 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng nucleotide gen defensin1 giống ngơ TQ1, CB2 trình tự có mã số JF797205