Nghiên cứu chuyển cấu trúc promoter gen gmnac 35s gmnac004 thông qua vector pzy101asc và chủng vi khu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VĂN ĐỒNG Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018 Tác giả luận văn Lê Thị Mai Hương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo phịng Sau Đại học, thầy giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Chương trình Khoa học Công nghệ độc lập cấp nhà nước đề tài mã số 03/2012/HĐ-ĐTĐL Cuối xin gửi tới bố mẹ, anh chị bạn bè lời cảm ơn thân thương người quan tâm, ủng hộ chỗ dựa cho suốt thời gian tơi làm khóa luận này, sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Lê Thị Mai Hương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….…… LỜI CẢM ƠN……………………………………………… ………… … MỤC LỤC………………………………………………………….………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………… …… DANH MỤC BẢNG.………………………………………………….……… DANH MỤC HÌNH………………………………………………… ……… CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU……………………………………………… ……… 1.1 Đặt vấn đề…….……………………………………………………… 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài ….…………………… 1.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn tính đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… … 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương ngồi nước.………………… 2.1.1 Giới thiệu chung đậu tương…… 2.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới…………………… … 2.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam.……………………… 2.1.4 Tình hình phát triển ứng dụng đậu tương chuyển gen giới Việt Nam… ……………………………………… …… 2.2 Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương………………… …………… 2.2.1 Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn A tumefaciens… 2.2.2 Đặc tính chịu hạn số gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương……………………………………………………… CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… i ii iii v vi vii 1 3 4 10 15 15 19 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu………… ………………………… 3.2 Nội dung nghiên cứu.…….……………………………………….…… 3.3 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… … 3.4 Phương pháp nghiên cứu……… …………………………………… 3.4.1 Phương pháp biến nạp ………………………………………….… 27 27 27 27 30 30 3.4.2 Kiểm tra có mặt gen chuyển hệ T0…… 3.4.3 Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử phun Basta……… 3.4.4 Phương pháp thu thập phân tích số liệu thống kê …………… 32 35 36 iii CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………….…………… 4.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương 37 ĐT22……………………………………………………………………… 4.2 Kết chọn lọc chuyển gen phun Basta ………… 4.3 Kết phân tích PCR chuyển gen hệ T0.….…………… … 4.3.1 Phân tích PCR kiểm tra có mặt gen bar …… ……… 4.3.2 Phân tích PCR kiểm tra có mặt cấu trúc 35S::GmNAC004 4.4 Kết chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử……………………… 37 40 42 42 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………… 5.1 Kết luận………………………………………………… 5.2 Đề nghị……………………………………………… 51 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………… 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………… 53 PHỤ LỤC………………………………………………… 60 iv 43 45 51 51 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D ADN ARN Dichlorophenoxyacetic acid Acid deoxyribonucleic AS BĐG Acid ribonucleic Acetosyringone Biến đổi gen CCM cDNA CNSH CTAB CS DMSO DW Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy Complementary DNA Công nghệ Sinh học Hexadecyltrimethylammonium bromide Cộng Dimethyl sulfoxide Dry weight - Trọng lượng khô EDTA GM IBA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt Indol butyric acid LB NBT OD600 Luria-Bertani Nitrotetrazolium Blue chloride Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600 nm quang phổ kế PCR RT PCR RM RWC SDS SEM SIM SSC TL TT TW v/ p W YEP Polymerase Chain Reaction Real-time PCR Rooting medium - Môi trường rễ Relative water content - Hàm lượng nước tương đối Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi Saline-sodium citrate Trọng lượng Thứ tự Turgid weight - Trọng lượng trương vòng/ phút Weight - Trọng lượng Yeast extract peptone - Môi trường nuôi khuẩn v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển đậu tương………… Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới ………………………… Bảng 2.3 Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu giới… Bảng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam …………………… … Bảng 2.5 Một số nghiên cứu vai trò gen GmNAC Bảng 3.1 Thông tin vector pZY101::35S::GmNAC004………………… … Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu………………… Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR………………………………………… Bảng 4.1 Kết tạo đa chồi thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 23 28 35 35 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……………………………………… Bảng 4.2 Kết chọn lọc mẫu biến nạp thí nghiệm chuyển cấu trúc 38 gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………………………………… Bảng 4.3 Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí 39 nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……… Bảng 4.4 Kết phun basta đậu tương chuyển cấu trúc gen 40 35S::GmNAC004……………………………………………………………… 41 Bảng 4.5 Kết phân tích PCR đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 hệ T0………………………………………………… 44 Bảng 4.6 Kết sàng lọc đánh giá dòng đậu tương sau chuyển gen phun Basta đến hệ T3…………………………………………………… 45 Bảng 4.7 Kết phân tích phân ly hệ T1……………………… 46 Bảng 4.8 Kết phân tích phân ly hệ T2……………………… 46 Bảng 4.9 Kết phân tích phân ly hệ T3……………………… 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hạt đậu tương giống ĐT22………………………….……………… Hình 3.2 Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004……………………… Hình 4.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt mầm giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101 …………………………………………………… … 28 30 Hình 4.2 Kết mẫu tạo đa chồi mơi trường SIM………… ………… Hình 4.3 Kết mẫu biến nạp kéo dài chồi mơi trường SEM………… Hình 4.4 Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp sử dụng 38 39 cấu trúc gen 35S::GmNAC004 chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101…… 40 Hình 4.5 Kết chọn lọc thuốc diệt cỏ Basta đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………… …… Hình 4.6 Kết kiểm tra chất lượng ADN tổng số đậu tương 41 chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 ……………………………………… Hình 4.7 Phân tích PCR gen bar đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………………………… … Hình 4.8 Kết phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen T0……………………………………… …………… Hình 4.9 Kết chọn lọc chuyển gen đồng hợp đến hệ T3………… Hình 4.10 Các dịng đậu tương chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta chăm sóc đến hoa, kết quả……… Hình 4.11 Phân tích PCR gen bar đậu tương chuyển gen T1 Hình 4.12 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T1 ……………………………………………… Hình 4.13 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T2…………………………………………………… Hình 4.14 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T3…………………………………………………… vii 37 42 43 44 48 49 49 50 50 50 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đậu tương (Glicine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabacea), Fabales, trồng lấy hạt cho dầu quan trọng bậc giới, khả thích ứng rộng nên đậu tương trồng khắp châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ với sản lượng đậu tương thu chiếm 85,4% tổng sản lượng đậu tương toàn giới, tiếp đến Châu Á đạt 12,1% (FAOSTAT, 2016) Tại Việt Nam, đậu tương thực phẩm có vai trị quan trọng suất trồng thấp, chưa thể đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước Nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến suất sản lượng đậu tương Việt Nam bệnh dịch hại, sâu bệnh chủ yếu hạn hán Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khơ hạn, nhiễm mặn ngày tăng Việc nghiên cứu đáp ứng lương thực, bao gồm đậu tương, trồng điều kiện môi trường thiếu nước, mặn, lạnh… ngày trở nên quan trọng (Petit cộng sự, 1999; Manavalan cộng sự, 2009; Tran Mochida, 2010) Một kỹ thuật ln mang lại nhiều kỳ vọng nghiên cứu, phát triển giống đậu tương biến đổi gen dựa việc phân lập gen có lợi thiết kế véc tơ hiệu cao để chuyển gen mục tiêu vào giống đậu tương xác định Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF CUC) báo cáo tăng cường khả chống chịu trồng điều kiện bất thuận hạn, mặn lạnh (Tran et al., 2010) Theo nghiên cứu Reem M Hussain cộng (2017), xác định 139 gen GmNAC, nghiên Chi tiết trình đánh giá phân ly dòng chuyển gen quan tâm từ hệ T1 trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết phân tích phân ly hệ T1 Dòng chuyển gen Hạt T0 Tổng số Số T1 gieo T1 thu kháng Basta Tỷ lệ T1 kháng Basta (%) Tỷ lệ sống/ chết (+/ -) 90 88 69 78,41 ~3:1 55 52 21 40,38 ~1:1 67 66 48 72,73 ~3:1 34 34 20 58,82 ~1:1 Kết từ bảng cho thấy, hệ T1 dòng phân ly dòng số số phân ly theo tỷ lệ 3:1 nên dự đốn dòng số số mang đoạn chèn gen quan tâm Để kiểm tra hai dòng số số có tiếp tục phân ly theo định luật Mendelian hay khơng, hai dịng với dịng số số phân tích tiếp hệ T2 Do số lượng cá thể T1 dòng nhiều nên hạt thu hệ T1 đầu dòng trộn lẫn sau gieo sàng lọc hệ T2 (Bảng 4.8) Bảng 4.8 Kết phân tích phân ly hệ T2 Dòng chuyển gen Hạt T1 Tổng số Số T2 gieo T2 thu kháng Basta 70 70 70 70 67 60 50 64 52 31 37 22 Tỷ lệ T2 kháng Basta (%) Tỷ lệ sống/ chết (+/ -) 77,61 51,67 74,00 34,38 ~3:1 ~1:1 ~3:1 ~1:2 Kết đánh giá hệ T2 Bảng 4.8 cho thấy, dòng số số tiếp tục phân ly theo tỷ lệ 3:1 Dòng số số phân ly không theo tỷ 46 lệ 3:1 Kết khẳng định hai dòng số số phân ly theo tỷ lệ Mendelian Do vậy, để chọn lọc dòng đồng hợp, với dòng số 1, số dòng cịn lại tơi lựa chọn ngẫu nhiên dịng hệ T2 để phân tích hệ T3 (Bảng 4.9) Bảng 4.9 Kết phân tích phân ly hệ T3 Dòng chuyển gen Hạt T2 Tổng số gieo T3 thu Số T3 kháng Basta Tỷ lệ T3 kháng Basta (%) Tỷ lệ sống/ chết (+/ -) 52 52 100,00 70 70 30 10 33,33 1:2 70 37 28 75,68 ~3:1 70 22 15 68,18 ~1:1 Như từ Bảng 4.9 cho thấy, đến hệ T3 dòng số khơng có phân ly, tỷ lệ kháng Basta đạt 100 % nên dịng có khả đồng hợp tử Dịng số có tỷ lệ kháng đạt 76 %, tỷ lệ phân ly đạt ~ 3:1 Dịng số số có tỷ lệ kháng Basta đạt 33 %, 68%, phân ly khơng theo tỷ lệ 3:1 nên dịng không sử dụng cho nghiên cứu Dòng số số giữ lại thu hạt để tiếp tục đánh giá biểu gen chuyển khả chịu hạn điều kiện nhân tạo Quá trình sàng lọc phun Basta đến hệ T3 thể qua Hình 4.9, 4.10 sau: 47 Cây đối chứng ĐT22 trước phun basta Cây đối chứng ĐT22 sau phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T1 phân ly sau phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 hệ T2 chết phân ly sau phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T3 phân ly Dịng chuyển gen hệ T3 có khả đồng hợp Hình 4.9 Kết chọn lọc chuyển gen đồng hợp đến hệ T3 48 Hình 4.10 Các dòng đậu tương chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta chăm sóc đến hoa, kết Trong trình sàng lọc phun Basta, biểu gen chuyển hệ dịng kiểm tra lại phân tích PCR ngẫu nhiên số đại diện Kết cho thấy, dịng có mặt gen chuyển hệ sau (Hình 4.11, 4.12, 4.13, 4.14) Hình 4.11 Phân tích PCR gen bar đậu tương chuyển gen hệ T1 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler; (-): H2O; (P4): Plasmid 35S/ GmNAC004; (1-9): Cây chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004;(đc): Cây không chuyển gen ĐT22 49 Hình 4.12 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T1 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P4): Đối chứng dương; (-): H2O; (1-6): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 hệ T1 M P (-) đc 1500bp 1000bp Hình 4.13 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T2 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): Đối chứng dương; (-): H2O; đc: Cây không chuyển gen ĐT22; (1-7): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 hệ T2 Hình 4.14 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T3 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): Đối chứng dương; (1-5): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 hệ T2; ĐT22: Cây không chuyển gen 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN 5.1 Kết luận Kết chuyển gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 mang vector pZY101::35S::GmNAC004 thu 22 đậu tương sống sót sau q trình chọn lọc, có sống sót sau đất Sau sàng lọc phun Basta, kết thu dương tính với phun Basta Kết phân tích chuyển gen xác định đậu tương có phản ứng dương tính với gen đích thơng qua phương pháp PCR Kết sàng lọc gen phương pháp phun Basta đến hệ T3 xác định dịng có khả đồng hợp tử dòng mang đoạn chèn gen quan tâm 5.2 Đề nghị Tiến hành thí nghiệm khẳng định lại có mặt gen đích ước đốn số copy phương pháp Southern blot dòng chuyển gen thu Đánh giá khả chịu hạn dòng đậu tương chuyển gen có khả đồng hợp điều kiện nhà lưới 51 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hương, Nguyễn Trung Anh (2018), “Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thơng qua chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 11(96), 32-37 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Đăng Tôn, Trần Thị Phương Liên, Nơng Văn Hải, Lê Thị Muội, Trần Đình Long (2003), “Gen mã hoá Dehydrin từ số giống đậu tương Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1(2), 237-244 Đinh Thị Ngọc, Chu Hoàng Mậu, Bùi Thị Tuyết, Phạm Thị Thanh Nhàn (2008), “Nghiên cứu khả chịu hạn tách dòng gen chaperonin số giống đậu tương (Glycine max Merill) địa phương vùng Tây Ngun”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6(1), 79-88 Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (2004), “Thiết kế véc tơ hệ mang gen kháng côn trùng cryIAc để chuyển vào trồng”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(1), 85-92 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(1), 1-18 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tương (Glycine max(L.) Merill) phục vụ cho chuyển gen”, Tạp chí khoa học & cơng nghệ, 52(4), 82-88 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương Nguyễn Hữu Kiên (2012), “Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 9(39), 119-124 53 Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội (2010), Niên Giám Thống Kê 2009 Trần Thị Cúc Hoà (2007), “Khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 18, 9-14 Trần Thị Cúc Hồ (2008), “Hiệu tạo dịng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ176, HL 202, Maverick William 82 phương pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nơng Nghiệp Phát triển nơng thơn 10.Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (2003), “Protein số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1(1), 95-100 Tài liệu tiếng Anh 11.Dorothea B., Ramanjulu S (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”, Critical Reviews in Plant Sciences, 24, 23-58 12.Friedman M., Brandon D (2001), “Nutritional and health benefits of soy proteins”, J Agric Food Chem, 49(3), 1069-1086 13.Hadiarto T., Tran L.S (2011), “Progress studies of drought-responsive in rice”, Plant Cell Rep, 30, 297-310 14.Hoisington, D.A (1992), Laboratory Protocols, CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory, Mexico DF, 1-86 15.Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L (2006), “Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice”, Proc Natl Acad Sci U S A, 103(35), 12987-12992 54 16.Hussain, R M., Ali, M., Feng, X., & Li, X (2017), “The essence of NAC gene family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max L Merr.) cultivars”, BMC Plant Biol, 17(1), 55 17.Kovtun Y., Chiu W.L., Tena G., Sheen J (2000), “Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants”, Proc Nalt Acad Sci USA, 97, 2940-2945 18.Le D.T., Choi J D., Tran L.S (2010), “Amino acids conferring herbicide resistance in tobacco acetohydroxyacid synthase”, GM Crops, 1(2), 6267 19.Le D.T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L.S (2011), “Genome-wide expression profiling of soybean two-component system genes in soybean root and shoot tissues under dehydration stress”, DNA Res., 18(1), 17-29 20.Lee K., Yi B.Y., Kim K.H., Kim J.B., Suh S.C., Woo H.J., Shin S.S., Kweon S.J (2011), “Development of efficient transformation protocol for soybean (Glycine max L.) and characterization of transgene expression after Agrobacterium –mediated gene transfer”, J Korean Soc App Biol Chem, 54(1), 37-45 21.Li Z., Xing A., Moon B.P., Richard P M., Mills K., Falco S.C (2009), “Site-Specific Integration of Transgenes in Soybean via RecombinaseMediated DNA Cassette Exchange”, Plant Physiol, 151(3), 1087-1095 22.Liener I.E (1994), “Implications of antinutritional components in soybean foods”, Crit Rev Food Sci Nutr., 34(1), 31-67 23.Manavalan L.P., Guttikonda S.K., Tran L.S., Nguyen H.T (2009), “Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in soybean”, Plant and Cell Physiology, 50(7), 1260-1276 55 24.Manuela M.C., João P.M., João S.P (2003), “Understanding plant response to drought from genes to the whole plant”, Functional Plant Biology, 30, 239-264 25.Nakashima K., Tran L.S., Dong N.V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, the Plant journal, 51(4), 617-630 26.Nelson D E., Repetti P P., Adams T R et al (2007), “Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres”, PNAS, 104, 16450-16455 27.Nishihama R., Soyano T., Ishikawa M., Araki S., Tanaka H., Asada T., Irie K., Ito M., Terada M., Banno H., Yamazaki Y., Machida Y (2002), “Expansion of the cell plate in plant cytokinesis requires a kinesin-like protein/MAPKKK complex”, Cell, 109, 87-99 28.Ohnishi T., Sugahara S., Yamada T., Kikuchi K., Yoshiba Y., Hirano H.Y., Tsutsumi N (2005), “OsNAC6, a member of the NAC gene family, is induced by various stresses in rice”, Genes Genet Syst., 80(2), 135-139 29.Ososki A.L., Kennelly E.J (2003), “Phytoestrogens: a review of the present state of research”, Phytotherapy Research, 17, 845-69 30.Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta, 216, 723-735 31.Olhoft P M., Flagel L E., Somers D A (2004), “T-DNA locus structure in a large population of soybean plants transformed using the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method”, Plant Biotechnol J., 2(4), 289-300 56 32.Paz M., Martinez J C., Kalvig A., Fonger T., Wang K (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25, 206-213 33.Paz M., Wang K (2009), “Soybean transformation and regeneration using half-seed explants”, US Patent, 7473-7822 34.Petit J.R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N.I., Barnola J.M., Basile I., Bender M., Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M., Kotlyakov V.M., Legrand M., Lipenkov V.Y., Lorius C., Pespin L., Ritz C., Saltzman E., Stivernard M (1999), “Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica”, Nature, 399, 429-436 35.Sakai T., Kogiso M (2008), “Soy isoflavones and immunity”, J Med Invest., 55(3-4), 167-173 36.Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, Vol 1, 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 37.Schmutz J., Steven B C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W., David L H., Qijian S., Jay J T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May G.D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M.K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Montona F.G., Abernathy B., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang X.C., Shinozaki K., Nguyen H.T., Wing R.A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R.C., Jackson S.A (2010), “Genome sequence of the palaeopolyploid soybean”, Nature, 463, 178-183 57 38.Shou H., Bordallo P., Wang K (2004), “Expression of the Nicotiana protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize”, Journal of Experimental Botany, 55(399), 1013-1019 39.Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stressinducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive ciselement in the early responsive to dehydration stress promoter”, Plant Cell, 16(9), 2481-2498 40.Tran L.S., Mochida K (2010), “A platform for functional prediction and comparative analyses of transcription factors of legumes and beyond”, Plant Signaling & Behavior, 5(5), 1-3 41.Tran L.S., Mochida K (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Funct Integr Genomics, 10, 447-462 42.Tran L.S., Mochida K (2010), “Identification and prediction of abiotic stress responsive transcription factors involved in abiotic stress signaling in soybean”, Plant Signaling & Behavior, 5(3), 255-257 43.Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (2010), “Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach”, GM Crops, 1(1), 32-39 44.Tran L.S., Quach T.N., Guttikonda S.K., Aldrich D.L., Kumar R., Neelakandan A., Valliyodan B., Nguyen H.T (2009), “Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean, Division of Plant Sciences”, Mol Genet Genomics, 281(6), 647-664 58 45.Tran L.S., Urao T., Qin F., Maruyama K., Kakimoto T., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of AHK1/ATHK1 and cytokinin receptor histidine kinases in response to abscisic acid, drought, and salt stress in Arabidopsis”, PNAS, 104(51), 20623-20628 46.Truyen N Quach, Lam-Son Phan Tran, Babu Valliyodan, Hanh TM Nguyen, Rajesh Kumar, Anjanasree K Neelakandan, Satish Kumar Guttikonda, Robert E Sharp, Henry T Nguyen (2014), “Functional Analysis of Water Stress-Responsive Soybean GmNAC003 and GmNAC004 Transcription Factors in Lateral Root Development in Arabidopsis”, PLOS ONE, 9(1), e84886 47.Wang C R., Yang A.F., Yue G.D., Gao Q., Yin H.Y., Zhang J.R (2008), “Enhanced expression of phospholipase C1 (ZmPLC1) improves drought tolerance in transgenic maize”, Planta, 227(5), 1127-1140 48.http://www.isaaa.org 49.http://www.fao.org 50.http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/342 genetically_modified_soybean_global_area_under_cultivation.html 59 PHỤ LỤC Hóa chất môi trường sử dụng chuyển gen đậu tương TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Thành phần/1lít YEP Bacto-peptone 10 g Yeast-extract 5g NaCl 5g B5 major salts (10X) B5 minor salts (100X) Ferrous-NaEDTA (100X) MS major salts (10X) MS minor salts (100X) MES Sucrose pH Agar 12 g Khử trùng 20 phút, sau bổ sung: Kanamycin 25 mg Rifampicin 25 mg Spectomycin 50 mg Streptomycin 50 mg Acetosyringone (AS), 40 mg/ml Asp/Glu, 25 mg/ml B5 vitamin (500X) BAP, 16,7 mg/ml Cefotaxime, 200 mg/ml Dithiothrietol (DTT), 154 mg/ml IAA, mg/ml GA3, mg/ml Glufosinate, 10 mg/ml L-cystein, 25 mg/ml Na-thiosulfate, 158 mg/ml Vancomycin mg/ml GM CCM SIM 100 ml 10 ml 10 ml 10 ml ml ml 100 ml 10 ml 10 ml 20 g 5,8 11 g 3,9 g 30 g 5,4 11g 0,6 g 30 g 5,7 12g SEM RM 10 ml 100 ml 10 ml 0,6 g 30 g 5,7 13 g 10 ml 100 ml 10 ml 0,6 g 20 g 5,6 13g ml ml ml ml ml 0,5 ml ml ml ml 0,1 ml ml 0,1 ml ml ml ml 0,1 ml 0,5 ml 0,5 ml 10 ml ml 0,25 ml 16 ml ml Ghi chú:YEP (Yeast extract peptone): Môi trường nuôi khu n GM (Germination medium): Môi trường nảy mầm hạt CCM (Cocultivation medium): Môi trường đồng nuôi cấy SIM (Shoot induction medium): Môi trường tạo đa chồi SEM (Shoot elongation medium): Môi trường kéo dài chồi RM (Rooting medium): Môi trường rễ 60 10 ml ... thống gen GmNAC, tiến hành thực đề tài đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển cấu trúc Promoter: :Gen- GmNAC (35S: :GmNAC0 04) thông qua vector pZY101Asc chủng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA101 vào giống... nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S: :GmNAC0 04 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khu? ??n A.tumefaciens EHA101……… Bảng 4.4 Kết phun basta đậu tương chuyển cấu trúc gen 40 35S: :GmNAC0 04………………………………………………………………... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S: :GmNAC0 04 vào giống đậu tương ĐT22 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc 35S: :GmNAC0 04 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khu? ??n