Nghiên cứu chuyển cấu trúc promoter gen GmNAC (35s GmNAC004) thông qua vector pZY101Asc và chủng vi khu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN C U CHUY N C U TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CH NG VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GI NG U TƯƠNG T22 VI T NAM LU N VĂN TH C SĨ SINH H C Hà N i - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN C U CHUY N C U TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CH NG VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GI NG U TƯƠNG T22 VI T NAM Chuyên ngành : Sinh h c th c nghi m Mã s : 8420114 LU N VĂN TH C SĨ SINH H C NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C: PGS TS NGUY N VĂN Hà N i - 2018 NG L I CAM OAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ một học vị nào Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc Hà N i, ngày… tháng… năm 2018 Tác gi lu n văn Lê Th Mai Hương i L I C M ƠN hoàn thành b n lu n văn này, tôi xin bày t lòng bi t ơn sâu s c t i PGS TS Nguy n Văn ng ã t n tình hư ng d n và t o m i i u ki n giúp tôi trong quá trình h c t p và nghiên c u Tôi xin bày t lòng bi t ơn chân thành t i các th y cô giáo phòng Sau i h c, th y cô giáo Vi n Sinh thái và Tài nguyên sinh v t ã giúp nhi t tình và t o m i i u ki n thu n l i trong th i gian h c t p cũng như khi hoàn thành lu n văn t t nghi p Tôi xin g i l i c m ơn t i t p th cán b Phòng thí nghi m Tr ng i m Công ngh t bào Th c v t - Vi n Di truy n Nông nghi p v s giúp nhi t tình trong su t th i gian tôi th c hi n lu n văn Tôi xin trân tr ng c m ơn s h Công ngh c l p c p nhà nư c trong tr kinh phí t Chương trình Khoa h c và tài mã s 03/2012/H - T L Cu i cùng tôi xin g i t i b m , anh ch cùng b n bè l i c m ơn thân thương nh t - nh!ng ngư i ã luôn quan tâm, "ng h và là ch d a cho tôi trong su t th i gian tôi làm khóa lu n này, cũng như trong cu c s ng Tôi xin chân thành c m ơn! Hà N i, ngày tháng năm 2018 H c viên Lê Th Mai Hương ii M CL C LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….…… LỜI CẢM ƠN……………………………………………… ………… … MỤC LỤC………………………………………………………….………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………… …… DANH MỤC BẢNG.………………………………………………….……… DANH MỤC HÌNH………………………………………………… ……… CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU……………………………………………… ……… 1.1 Đặt vấn đề…….……………………………………………………… 1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài ….…………………… 1.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… … 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trong và ngoài nước.………………… 2.1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương…… 2.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới…………………… … 2.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam.……………………… 2.1.4 Tình hình phát triển và ứng dụng cây đậu tương chuyển gen trên thế giới và tại Việt Nam… ……………………………………… …… 2.2 Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương………………… …………… 2.2.1 Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn A tumefaciens… 2.2.2 Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương……………………………………………………… CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu………… ………………………… 3.2 Nội dung nghiên cứu.…….……………………………………….…… 3.3 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… … 3.4 Phương pháp nghiên cứu……… …………………………………… 3.4.1 Phương pháp biến nạp ………………………………………….… 3.4.2 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0…… 3.4.3 Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun Basta……… 3.4.4 Phương pháp thu thập và phân tích số liệu thống kê …………… 3 i ii iii v vi vii 1 1 3 3 4 4 4 7 9 10 15 15 19 27 27 27 27 30 30 32 35 36 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………….…………… 4.1 Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22……………………………………………………………………… 4.2 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng phun Basta ………… 4.3 Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen thế hệ T0.….…………… … 4.3.1 Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar …… ……… 4.3.2 Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc 35S::GmNAC004 4.4 Kết quả chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử……………………… 37 40 42 42 43 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………… 5.1 Kết luận………………………………………………… 5.2 Đề nghị……………………………………………… 51 51 51 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………… 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………… 53 PHỤ LỤC………………………………………………… 60 4 37 DANH M C CÁC KÍ HI U, CH VI T T T 2,4-D ADN ARN AS BĐG CCM cDNA CNSH CTAB CS DMSO DW EDTA GM IBA LB NBT OD600 Dichlorophenoxyacetic acid Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic Acetosyringone Biến đổi gen Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy Complementary DNA Công nghệ Sinh học Hexadecyltrimethylammonium bromide Cộng sự Dimethyl sulfoxide Dry weight - Trọng lượng khô Ethylendiamin Tetraacetic Acid Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt Indol butyric acid Luria-Bertani Nitrotetrazolium Blue chloride Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế PCR RT PCR RM RWC SDS SEM SIM SSC TL TT TW v/ p Polymerase Chain Reaction Real-time PCR Rooting medium - Môi trường ra rễ Relative water content - Hàm lượng nước tương đối Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi Saline-sodium citrate Trọng lượng Thứ tự Turgid weight - Trọng lượng trương vòng/ phút W YEP Weight - Trọng lượng Yeast extract peptone - Môi trường nuôi khuẩn 5 DANH M C B NG B ng 2.1 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây đậu tương………… 4 B ng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới ………………………… 8 B ng 2.3 Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới… 8 B ng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam …………………… … 9 B ng 2.5 Một số nghiên cứu về vai trò của các gen GmNAC 23 B ng 3.1 Thông tin về vector pZY101::35S::GmNAC004………………… … 28 B ng 3.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu………………… 35 B ng 3.3 Thành phần phản ứng PCR………………………………………… 35 B ng 4.1 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……………………………………… 38 B ng 4.2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………………………………… 39 B ng 4.3 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……… 40 B ng 4.4 Kết quả phun basta các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004……………………………………………………………… 41 B ng 4.5 Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 thế hệ T0………………………………………………… 44 B ng 4.6 Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương sau chuyển gen bằng phun Basta đến thế hệ T3…………………………………………………… 45 B ng 4.7 Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T1……………………… 46 B ng 4.8 Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T2……………………… 46 B ng 4.9 Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T3……………………… 47 6 DANH M C HÌNH Hình 3.1 Hạt đậu tương giống ĐT22………………………….……………… Hình 3.2 Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004……………………… Hình 4.1 Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt lá mầm của giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101 …………………………………………………… … Hình 4.2 Kết quả mẫu tạo đa chồi trên môi trường SIM………… ………… Hình 4.3 Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi trên môi trường SEM………… Hình 4.4 Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp sử dụng cấu trúc gen 35S::GmNAC004 và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101…… Hình 4.5 Kết quả chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………… …… Hình 4.6 Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số của các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 ……………………………………… Hình 4.7 Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………………………… … Hình 4.8 Kết quả phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen T0……………………………………… …………… Hình 4.9 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen đồng hợp đến thế hệ T3………… Hình 4.10 Các dòng đậu tương được chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta được chăm sóc đến khi ra hoa, kết quả……… Hình 4.11 Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển gen T1 Hình 4.12 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1 ……………………………………………… Hình 4.13 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T2…………………………………………………… Hình 4.14 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T3…………………………………………………… vii 28 30 37 38 39 40 41 42 43 44 48 49 49 50 50 50 CHƯƠNG 1 M 1.1 U tv n Đậu tương (Glicine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabacea), bộ Fabales, là cây trồng lấy hạt và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, do khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ với sản lượng đậu tương thu được chiếm 85,4% tổng sản lượng đậu tương trên toàn thế giới, tiếp đến là Châu Á đạt 12,1% (FAOSTAT, 2016) Tại Việt Nam, đậu tương là cây thực phẩm có vai trò quan trọng nhưng năng suất cây trồng này còn thấp, chưa thể đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước Nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến năng suất và sản lượng đậu tương của Việt Nam là do các bệnh dịch hại, sâu bệnh và chủ yếu là do hạn hán Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn, nhiễm mặn ngày một tăng Việc nghiên cứu các đáp ứng của cây lương thực, bao gồm cây đậu tương, trồng trong điều kiện môi trường thiếu nước, mặn, lạnh… ngày càng trở nên quan trọng (Petit và cộng sự, 1999; Manavalan và cộng sự, 2009; Tran và Mochida, 2010) Một trong những kỹ thuật luôn mang lại nhiều kỳ vọng đó là nghiên cứu, phát triển giống đậu tương biến đổi gen dựa trên việc phân lập các gen có lợi và thiết kế các véc tơ hiệu năng cao để chuyển các gen mục tiêu vào giống đậu tương xác định Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) đã được báo cáo là tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các điều kiện bất thuận như hạn, mặn và lạnh (Tran et al., 2010) Theo nghiên cứu mới nhất của Reem M Hussain và cộng sự (2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, nghiên 1 lệ 3:1 Kết quả này khẳng định hai dòng số 1 và số 3 phân ly theo đúng tỷ lệ của Mendelian Do vậy, để chọn lọc được dòng đồng hợp, với dòng số 1, số 3 và 2 dòng còn lại tôi lựa chọn ngẫu nhiên 1 dòng ở thế hệ T2 để phân tích thế hệ T3 (Bảng 4.9) B ng 4.9 Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T3 D H T ò ) n t n g 7 07 07 07 0 S T T 0 0 c â l l 1 03 1 3, 7 ~ 5, 6 3~ 8, 1 Như vậy từ Bảng 4.9 cho thấy, đến thế hệ T3 dòng số 1 không có sự phân ly, tỷ lệ kháng Basta đạt 100 % nên dòng này có khả năng đồng hợp tử Dòng số 3 có tỷ lệ cây kháng đạt 76 %, tỷ lệ phân ly đạt ~ 3:1 Dòng số 2 và số 4 có tỷ lệ cây kháng Basta đạt lần lượt 33 %, 68%, phân ly không theo tỷ lệ 3:1 nên 2 dòng này không được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo Dòng số 1 và số 3 được giữ lại thu hạt để tiếp tục đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển và khả năng chịu hạn trong điều kiện nhân tạo Quá trình sàng lọc bằng phun Basta đến thế hệ T3 được thể hiện qua Hình 4.9, 4.10 như sau: 47 Cây đối chứng ĐT22 trước khi phun basta Cây đối chứng ĐT22 sau khi phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T1 phân ly sau khi phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 thế hệ T2 chết và phân ly sau khi phun basta Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T3 phân ly Dòng chuyển gen thế hệ T3 có khả năng đồng hợp Hình 4.9 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen đồng hợp đến thế hệ T3 48 Hình 4.10 Các dòng đậu tương được chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta được chăm sóc đến khi ra hoa, kết quả Trong quá trình sàng lọc bằng phun Basta, sự biểu hiện gen chuyển ở từng thế hệ của 4 dòng được kiểm tra lại bằng phân tích PCR ngẫu nhiên một số cây đại diện Kết quả cho thấy, cả 4 dòng đều có mặt của gen chuyển ở thế hệ sau (Hình 4.11, 4.12, 4.13, 4.14) Hình 4.11 Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler; (-): H2O; (P4): Plasmid 35S/ GmNAC004; (1-9): Cây chuy n c u trúc gen 35S::GmNAC004;( c): Cây không chuy n gen T22 Hình 4.12 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P4): i ch ng dương; (-): H2O; (1-6): Cây chuy n gen 35S::GmNAC004 th h T1 M P (-) đc 1 2 3 4 5 6 7 1500bp 1000bp Hình 4.13 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T2 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): i ch ng dương; (-): H2O; c: Cây không chuy n gen T22; (1-7): Cây chuy n gen 35S::GmNAC004 th h T2 Hình 4.14 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T3 Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): i ch ng dương; (1-5): Cây chuy n gen 35S::GmNAC004 th h T2; T22: Cây không chuy n gen 50 CHƯƠNG 5 K,T LU%N VÀ 1 NGHN 5.1 K.t lu n 1 Kết quả chuyển gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 mang vector pZY101::35S::GmNAC004 đã thu được 22 cây đậu tương sống sót sau quá trình chọn lọc, trong đó có 9 cây sống sót sau khi ra đất Sau khi sàng lọc bằng phun Basta, kết quả thu được 5 cây dương tính với phun Basta 2 Kết quả phân tích cây chuyển gen đã xác định được 4 cây đậu tương có phản ứng dương tính với gen đích thông qua phương pháp PCR 3 Kết quả sàng lọc gen bằng phương pháp phun Basta đến thế hệ T3 đã xác định được 1 dòng có khả năng đồng hợp tử và 1 dòng mang 1 đoạn chèn của gen quan tâm 5.2 ngh' 1 Tiến hành thí nghiệm khẳng định lại sự có mặt của gen đích cũng như ước đoán số bản copy bằng phương pháp Southern blot của dòng chuyển gen thu được 2 Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng đậu tương chuyển gen có khả năng đồng hợp trong điều kiện nhà lưới 51 DANH M3C CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ,N LU%N VĂN 1 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hương, Nguyễn Trung Anh (2018), “Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101”, T p chí Khoa h c và Công ngh Nông nghi p Vi t Nam, 11(96), 32-37 52 TÀI LI U THAM KH-O Tài li u ti.ng Vi t 1 Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Đăng Tôn, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội, Trần Đình Long (2003), “Gen mã hoá Dehydrin từ một số giống đậu tương Việt Nam”, T p chí Công ngh Sinh h c, 1(2), 237-244 2 Đinh Thị Ngọc, Chu Hoàng Mậu, Bùi Thị Tuyết, Phạm Thị Thanh Nhàn (2008), “Nghiên cứu khả năng chịu hạn và tách dòng gen chaperonin của một số giống đậu tương (Glycine max Merill) địa phương ở vùng Tây Nguyên”, T p chí Công ngh Sinh h c, 6(1), 79-88 3 Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2004), “Thiết kế véc tơ thế hệ mới mang gen kháng côn trùng cryIAc để chuyển vào cây trồng”, T p chí Công ngh Sinh h c, 2(1), 85-92 4 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, T p chí Công ngh Sinh h c, 5(1), 1-18 5 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max(L.) Merill) phục vụ cho chuyển gen”, T p chí khoa h c & công ngh , 52(4), 82-88 6 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương và Nguyễn Hữu Kiên (2012), “Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, T p chí Khoa h c và Công ngh Vi t Nam, 9(39), 119-124 53 7 Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội (2010), Niên Giám Thống Kê 2009 8 Trần Thị Cúc Hoà (2007), “Khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương Việt Nam”, T p chí Nông nghi p và Phát tri n nông thôn, 18, 9-14 9 Trần Thị Cúc Hoà (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MT 176, HL 202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, T p chí Nông Nghi p và Phát tri n nông thôn 10.Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (2003), “Protein của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn khác nhau”, T p chí Công ngh Sinh h c, 1(1), 95-100 Tài li u ti.ng Anh 11.Dorothea B., Ramanjulu S (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”, Critical Reviews in Plant Sciences, 24, 23-58 12.Friedman M., Brandon D (2001), “Nutritional and health benefits of soy proteins”, J Agric Food Chem, 49(3), 1069-1086 13.Hadiarto T., Tran L.S (2011), “Progress studies of drought-responsive in rice”, Plant Cell Rep, 30, 297-310 14.Hoisington, D.A (1992), Laboratory Protocols, CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory, Mexico DF, 1-86 15.Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L (2006), “Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice”, Proc Natl Acad Sci U S A, 103(35), 12987-12992 54 16.Hussain, R M., Ali, M., Feng, X., & Li, X (2017), “The essence of NAC gene family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max L Merr.) cultivars”, BMC Plant Biol, 17(1), 55 17.Kovtun Y., Chiu W.L., Tena G., Sheen J (2000), “Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants”, Proc Nalt Acad Sci USA, 97, 2940-2945 18.Le D.T., Choi J D., Tran L.S (2010), “Amino acids conferring herbicide resistance in tobacco acetohydroxyacid synthase”, GM Crops, 1(2), 6267 19.Le D.T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L.S (2011), “Genome-wide expression profiling of soybean two-component system genes in soybean root and shoot tissues under dehydration stress”, DNA Res., 18(1), 17-29 20.Lee K., Yi B.Y., Kim K.H., Kim J.B., Suh S.C., Woo H.J., Shin S.S., Kweon S.J (2011), “Development of efficient transformation protocol for soybean (Glycine max L.) and characterization of transgene expression after Agrobacterium –mediated gene transfer”, J Korean Soc App Biol Chem, 54(1), 37-45 21.Li Z., Xing A., Moon B.P., Richard P M., Mills K., Falco S.C (2009), “Site-Specific Integration of Transgenes in Soybean via RecombinaseMediated DNA Cassette Exchange”, Plant Physiol, 151(3), 1087-1095 22.Liener I.E (1994), “Implications of antinutritional components in soybean foods”, Crit Rev Food Sci Nutr., 34(1), 31-67 23.Manavalan L.P., Guttikonda S.K., Tran L.S., Nguyen H.T (2009), “Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in soybean”, Plant and Cell Physiology, 50(7), 1260-1276 55 24.Manuela M.C., João P.M., João S.P (2003), “Understanding plant response to drought from genes to the whole plant”, Functional Plant Biology, 30, 239-264 25.Nakashima K., Tran L.S., Dong N.V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, the Plant journal, 51(4), 617-630 26.Nelson D E., Repetti P P., Adams T R et al (2007), “Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres”, PNAS, 104, 16450-16455 27.Nishihama R., Soyano T., Ishikawa M., Araki S., Tanaka H., Asada T., Irie K., Ito M., Terada M., Banno H., Yamazaki Y., Machida Y (2002), “Expansion of the cell plate in plant cytokinesis requires a kinesin-like protein/MAPKKK complex”, Cell, 109, 87-99 28.Ohnishi T., Sugahara S., Yamada T., Kikuchi K., Yoshiba Y., Hirano H.Y., Tsutsumi N (2005), “OsNAC6, a member of the NAC gene family, is induced by various stresses in rice”, Genes Genet Syst., 80(2), 135-139 29.Ososki A.L., Kennelly E.J (2003), “Phytoestrogens: a review of the present state of research”, Phytotherapy Research, 17, 845-69 30.Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta, 216, 723-735 31.Olhoft P M., Flagel L E., Somers D A (2004), “T-DNA locus structure in a large population of soybean plants transformed using the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method”, Plant Biotechnol J., 2(4), 289-300 56 32.Paz M., Martinez J C., Kalvig A., Fonger T., Wang K (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25, 206-213 33.Paz M., Wang K (2009), “Soybean transformation and regeneration using half-seed explants”, US Patent, 7473-7822 34.Petit J.R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N.I., Barnola J.M., Basile I., Bender M., Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M., Kotlyakov V.M., Legrand M., Lipenkov V.Y., Lorius C., Pespin L., Ritz C., Saltzman E., Stivernard M (1999), “Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica”, Nature, 399, 429-436 35.Sakai T., Kogiso M (2008), “Soy isoflavones and immunity”, J Med Invest., 55(3-4), 167-173 36.Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, Vol 1, 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 37.Schmutz J., Steven B C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W., David L H., Qijian S., Jay J T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May G.D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M.K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Montona F.G., Abernathy B., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang X.C., Shinozaki K., Nguyen H.T., Wing R.A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R.C., Jackson S.A (2010), “Genome sequence of the palaeopolyploid soybean”, Nature, 463, 178-183 57 38.Shou H., Bordallo P., Wang K (2004), “Expression of the Nicotiana protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize”, Journal of Experimental Botany, 55(399), 1013-1019 39.Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stressinducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive ciselement in the early responsive to dehydration stress 1 promoter”, Plant Cell, 16(9), 2481-2498 40.Tran L.S., Mochida K (2010), “A platform for functional prediction and comparative analyses of transcription factors of legumes and beyond”, Plant Signaling & Behavior, 5(5), 1-3 41.Tran L.S., Mochida K (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Funct Integr Genomics, 10, 447-462 42.Tran L.S., Mochida K (2010), “Identification and prediction of abiotic stress responsive transcription factors involved in abiotic stress signaling in soybean”, Plant Signaling & Behavior, 5(3), 255-257 43.Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (2010), “Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach”, GM Crops, 1(1), 32-39 44.Tran L.S., Quach T.N., Guttikonda S.K., Aldrich D.L., Kumar R., Neelakandan A., Valliyodan B., Nguyen H.T (2009), “Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean, Division of Plant Sciences”, Mol Genet Genomics, 281(6), 647-664 58 45.Tran L.S., Urao T., Qin F., Maruyama K., Kakimoto T., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of AHK1/ATHK1 and cytokinin receptor histidine kinases in response to abscisic acid, drought, and salt stress in Arabidopsis”, PNAS, 104(51), 20623-20628 46.Truyen N Quach, Lam-Son Phan Tran, Babu Valliyodan, Hanh TM Nguyen, Rajesh Kumar, Anjanasree K Neelakandan, Satish Kumar Guttikonda, Robert E Sharp, Henry T Nguyen (2014), “Functional Analysis of Water Stress-Responsive Soybean GmNAC003 and GmNAC004 Transcription Factors in Lateral Root Development in Arabidopsis”, PLOS ONE, 9(1), e84886 47.Wang C R., Yang A.F., Yue G.D., Gao Q., Yin H.Y., Zhang J.R (2008), “Enhanced expression of phospholipase C1 (ZmPLC1) improves drought tolerance in transgenic maize”, Planta, 227(5), 1127-1140 48.http://www.isaaa.org 49.http://www.fao.org 50.http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/342 genetically_modified_soybean_global_area_under_cultivation.html 59 PH3 L3C Hóa ch t và môi trư$ng s* d ng trong chuy n gen T T1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 10 1 2 1 31 41 51 6 1 7 1 18 29 20 1 2 2 2 23 42 52 26 27 8 ThY G C S S R Bà E 1 MC I E M ac 05 Y ea 5 N a B 1 1 1 5 01 01 01 B 5Fe 01 1 01 1 1 rr 0 0 10 10 M S 01 01 M S M 3 0 00 00 E Su 2 ,3 ,3 ,3 ,2 7 05 05 05 05 05 pcr H 1 1, ,1 ,1 1, ,1 A ga trùng 2 1 201phút, 2 sau 3 3 Khử đó bổ2 sung: K an Ri 52 fa Sp 5 ec St 05 re 0 A 1 ce to A 2 2 sp B 2 2 2 2 2 5 B 0, 0, A 1 11 1 0, C ef 5 Di 1 thi ot IA 0, A, 1 G 0, 0, A 25 Gl 1 50 uf , L1 cy 61 N aV 1 5 1 an 0 0 Ghi chú:YEP (Yeast extract peptone): Môi trư ng nuôi khu n GM (Germination medium): Môi trư ng n y m m h t CCM (Cocultivation medium): Môi trư ng ng nuôi c y SIM (Shoot induction medium): Môi trư ng t o a ch i SEM (Shoot elongation medium): Môi trư ng kéo dài ch i RM (Rooting medium): Môi trư ng ra r 60 u tương ... soycry1Ac không mang gen thị chọn lọc bar - Vi? ??n Nghiên cứu Bông nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c) vào phương pháp vi tiêm thông qua vi khu? ??n A tumefacien - Vi? ??n Nghiên cứu Hệ gen: Gen mã hóa chitinase... Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen trực tiếp súng bắn gen, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen vi tiêm,… Nhưng với phương pháp chuyển gen súng bắn gen phương pháp chuyển gen thông qua vi khu? ??n Agrobacterium... thống gen GmNAC, tiến hành thực đề tài đề tài ? ?Nghiên c u chuy n c u trúc Promoter: :Gen- GmNAC (35S: :GmNAC0 04) thông qua vector pZY101Asc ch ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA101 vào gi