Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen coda vào cây cà chua

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - PHẠM THỊ NHẬT ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN CODA VÀO CÂY CÀ CHUA LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - PHẠM THỊ NHẬT ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN CODA VÀO CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS CHU HOÀNG HÀ THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học sống – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học tập hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Chu Hồng Hà – Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, người thầy dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn quan tâm, bảo TS Phạm Bích Ngọc – Phó trưởng phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học, đồng cám ơn cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng Cơng nghệ trọng điểm gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp tập thể lớp Cao học công nghệ sinh K6A động viên, giúp đỡ suốt trình học tập Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Học viên Phạm Thị Nhật Anh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn hoàn toàn hoàn thiện say mê nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp PGS.TS Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, với cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Các số liệu hình ảnh, kết trình bày, luận văn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng nhà trường Thái Nguyên, ngày tháng Học viên Phạm Thị Nhật Anh năm 2015 iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cà chua 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, giá trị cà chua 1.1.2 Đặc điểm sinh học .6 1.1.3 Một số nghiên cứu chọn tạo giống cà chua giới Việt Nam .7 1.2 Gen codA mã hóa choline oxydase 12 1.2.1 Giới thiệu gen codA 12 1.2.2 Giới thiệu glycine betaine 13 1.2.3 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betain tăng cường khả chống chịu điều kiện môi trường bất lợi 17 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Vật liệu thực vật 21 2.1.2 Chủng khuẩn 21 2.1.3 Hóa chất thiết bị thí nghiệm .21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp tạo cà chua chuyển gen 22 2.2.2 Phương pháp phân tích đánh giá chuyển gen 26 2.2.3 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Kết chuyển gen, tái sinh chọn dòng cà chua chuyển gen codA 33 3.1.1 Kiểm tra có mặt cấu trúc mang gen codA vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 33 3.1.2 Kết chuyển gen, tái sinh chọn dòng cà chua chuyển gen codA 34 3.1.3 Phân tích cà chua chuyển gen codA kỹ thuật PCR 37 3.1.4 Phân tích cà chua chuyển gen codA kỹ thuật RT-PCR 38 3.2 Đánh giá khả chịu mặn dòng cà chua chuyển gen in vitro 41 3.2.1 Chọn lọc ngưỡng chịu mặn cà chua in vitro .41 3.2.2 Kết đánh giá khả chịu mặn cà chua chuyển gen 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………………….47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số loài trồng chuyển gen codA mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp glycine betaine, tăng khả chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi 19 Bảng 2.1: Môi trường nuôi chọn lọc cà chua chuyển gen 23 Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB đặc 23 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR nhân gen 27 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ống 29 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ống 30 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR nhân gen actin từ cDNA 31 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA từ cDNA 31 Bảng 3.1: Tổng hợp kết chuyển gen codA vào cà chua 34 Bảng 3.2: Kết đánh giá khả rễ cà chua in vitro điều kiện bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy 41 Bảng 3.3: Tổng hợp kết đánh giá khả chịu mặn cà chua chuyển gen 43 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Con đường sinh tổng hợp GB thực vật bậc cao 15 Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp GB vi khuẩn E coli 15 Hình 1.3: Con đường sinh tổng hợp GB vi khuẩn A globiformis 16 Hình 1.4: Sinh tổng hợp GB Actinopolyspora halophilia 16 Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 22 Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA vector chuyển gen pBI121/codA 33 Hình 3.2: Kết colony-PCR khuẩn lạc A tumefaciens 33 Hình 3.3: Một số hình ảnh chuyển gen codA vào cà chua PT18 35 Hình 3.4: Kết quả tách chiết DNA tởng sớ dịng cà chua chuyển gen 37 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA tổng số tách chiết từ số dịng cà chua chuyển gen khơng chuyển gen 37 Hình 3.6: Kết tách chiết RNA từ mẫu cà chua 38 Hình 3.7: Kết tách RNA loại DNA DNAse 39 Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen actin dòngcà chua PT18 chuyển gen 40 Hinh 3.9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen codA dòngcà chua PT18 chuyển gen 40 Hình 3.10: Cây cà chua khơng chuyển gen trên môi trường rễ nồng độ muối NaCl 42 Hình 3.11: Các dịng cà chua chuyển gen codA không chuyển gen môi trường rễ có bổ sung 200mM NaCl 44 Hình 3.12: Mảnh cà chua tái sinh mơi trường có bổ sung 200 mM NaCl 45 vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Anh µl micro lit µM micro mol AS Acetosyringone BAP 6-Benzyl amino purine Bp Base pair Nghĩa tiếng Việt Chất dẫn dụ Sợi DNA bổ sung tổng cDNA Complementary DNA hợp từ RNA thông tin nhờ enzyme mã ngược Cefo Cefotaxime CodA Choline oxidase gene Cộng Cs DNA Deoxirionucleic Acid GB Glycine betaine IBA Indolyl acetic acid Kb Kilo base MS Murashige and Skoog, 1962 Môi trường M Marker Thang Marker chuẩn mM Milimol NAA Naphtyl acetic acid NOS Nopaline synthase teminator OD Opitical density PCR Polymerase Chain Reaction RT – PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược WT Wild type Cây khơng chuyển gen MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây cà chua có tên khoa học Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ Nam Mỹ, loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae) Quả có chứa nhiều vitamin C nên có vị chua Quả cà chua mọng, chín có màu vàng đỏ, có nhiều hình dạng: trịn, dẹt, có cạnh, có múi, v.v Cà chua dùng chế biến thực phẩm, tạo vị ngon màu sắc hấp dẫn Ngoài cà chua cịn có tác dụng tốt việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe Lá cà chua có nơi dùng chữa bệnh huyết áp bệnh da Ở nước ta việc phát triển trồng cà chua cịn có ý nghĩa quan trọng mặt ln canh, tăng vụ tăng suất đơn vị diện tích, cà chua loại rau khuyến khích phát triển Diện tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập trung chủ yếu đồng trung du phía Bắc Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa phát triển mạnh theo mong muốn cà chua trồng điều kiện nóng ẩm nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể héo tươi, virus, khó phịng trị Các nghiên cứu lĩnh vực nông nghiệp cho thấy tổng sản lượng lương thực giới đạt 20% tiềm di truyền Nguyên nhân cho stress môi trường tác động lên trồng, hạn nước, hạn mặn lạnh gây lên nước nội bào mô thực vật Chính , nhằm phục vụ cơng tác tạo giống có khả chống chịu yếu tố bất lợi phi sinh học khác nhau, công nghệ gen hiện được cho là một phương tiện giải quyết hiệu quả nhiệm vụ Những tác động bất lợi từ môi trường khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan thường làm cân áp suất thẩm thấu gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất chất lượng nhiều loài trồng [30] Một phản ứng thường gặp gặp điều kiện bất lợi nước tăng cường tổng hợp tích lũy chất chuyển hóa loại đường tan, axit amin để tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào Glycine betaine biết đến chất đóng vai trị quan trọng q trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thực vật sống điều kiện bất lợi khô, hạn, lạnh [47] Ứng dụng kĩ thuật chuyển gen việc nghiên cứu nhằm tăng cường khả chống chịu trồng cách kích thích trồng tổng hợp chất thẩm thấu tương thích giúp tế bào vượt qua điều kiện cực đoan Vì vai trị quan trọng chất tạo áp suất thẩm thấu để đáp ứng với áp lực môi trường thực vật, trồng gặp điều kiện bất lợi tăng cường tăng tích lũy chất hịa tan tương thích thơng qua nhân giống trồng truyền thống, lựa chọn trợ giúp marker kỹ thuật di truyền Một gen sử dụng để chuyển vào trồng codA giúp tự tổng hợp tích lũy Glycine betaine Xuất phát từ thực trạng đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen codA vào cà chua” Mục tiêu nghiên cứu: Tạo cà chua mang gen codA Nội dung nghiên cứu (1) Chuyển gen codA vào mầm cà chua thông qua vi khuẩn A tumefaciens (2) Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng cà chua chuyển gen mang gen codA (3) Phân tích đánh giá chuyển gen 38 1-22, 22 dòng cà chua chuyển gen (+), Đối chứng dương sử dụng khuôn DNA plasmid pBI121/35S/codA/NOS (-), Đối chứng âm, sử dụng khuôn DNA không chuyển gen Các mẫu DNA sau tách dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR nhân gen codA với cặp mồi đặc hiệu F/CODA- XbaI R/CMYC-SacI Kết sản phẩm PCR thu cho thấy 30/68 dòng cà chua chuyển gen xuất băng DNA có kích thước khoảng 1,7 kb tương ứng với băng DNA xuất mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121/codA) thang DNA chuẩn kb; mẫu đối chứng âm không xuất băng DNA (hình 3.5) Kết cho thấy 30 dịng cà chua chuyển gen codA Các dòng tiếp tục nghiên cứu đánh giá biểu gen thông qua hoạt động phiên mã 3.1.4 Phân tích cà chua chuyển gen codA kỹ thuật RT-PCR Để xác định khả hoạt động gen codA 30 cà chua chuyển gen dương tính với PCR, tiến hành phản ứng RT-PCR Đây kỹ thuật cho phép phát nhanh biểu gen chuyển thông qua hoạt động phiên mã gen ngoại lai cà chua chuyển gen Các cà chua tách chiết RNA tổng số Để tách chiết ARN, mẫu cà chua tiến hành tách chiết phương pháp CTAB Collins Symons Kết thể hình 3.6 Hình 3.6: Kết tách chiết RNA từ mẫu cà chua M: Thang DNA 1kb 39 Nhìn vào kết điện di tách chiết ta thấy xuất băng RNA 28 S 18S có lẫn băng DNA tổng số Tiến hành loại DNA tổng số ta thu RNA tổng số Kết thu hình 3.7 Hình 3.7: Kết tách RNA loại DNA DNAse RNA tổng số tế bào chứa khoảng 80-85% rRNA 15-20% tRNA, mRNA chiếm khoảng 1-5% RNA tổng số tế bào Tiến hành dùng cột oligo T để phân tách thu mRNA làm nguồn nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp cDNA enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Tiếp theo tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu codA_F codA_R Sản phẩm RTPCR kiểm tra gel agarose 0,8% Trước tiên nhóm nghiên cứu sử dụng cặp mồi actin_F actin_R để tiến hành kiểm tra biểu mức độ phiên mã gen actin, kiểm tra điều kiện thích hợp cho phản ứng RT-PCR (chất lượng, nồng độ cDNA sử dụng phản ứng) Ở cà chua chuyển gen không chuyển gen, gen actin hoạt động ổn định, gel điện di xuất băng đặc hiệu vị trí khoảng 152 bp kiểm tra RT-PCR với cặp mồi actin_F actin_R Sau điện di kiểm tra, nhóm nghiên cứu nhận thấy 30 dòng cà chua chuyển gen xuất băng DNA có kích thước khoảng 150bp, sản phẩm PCR dịng cà chua điện di có chất lượng tốt, vạch DNA sáng tương đối đồng (hình 3.8) Bước kiểm tra chứng minh chất lượng hàm lượng 40 cDNA tổng hợp mẫu nghiên cứu tương đối đồng đều, sử dụng tốt cho phản ứng RT-PCR với gen đích codA Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen actin dòngcà chua PT18 chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; - 30: sản phẩm RT-PCR cà chua chuyển gen Hinh 3.9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen codA dòngcà chua PT18 chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; - 30: sản phẩm RT-PCR cà chua chuyển gen 41 Sau nhóm nghiên cứu thực phản ứng RT-PCR cặp mồi codA_F codA_R để tiến hành kiểm tra biểu mức độ phiên mã gen codA với lượng cDNA phù hợp giống phản ứng RT-PCR với mồi actin Kết điện di kiểm tra hình 3.9 cho thấy, cà chua chuyển gen số 1, 3, 4, 6, 12, 18, 23, 26 27 xuất băng DNA với kích thước khoảng 1,7 kb, tương ứng với kích thước gen codA Điều cho thấy số 30 cà chua T0 chuyển gen dương tính với phản ứng PCR, có mang gen chuyển codA hoạt động phiên mã tạo sản phẩm mRNA Các cà chua chuyển gen cho kết dương tính với phản ứng RT-PCR tiếp tục theo dõi phục vụ phân tích, đánh giá khả chịu mặn mức độ in vitro 3.2 Đánh giá khả chịu mặn dòng cà chua chuyển gen in vitro 3.2.1 Chọn lọc ngưỡng chịu mặn cà chua in vitro Để đánh giá khả chịu mặn dòng cà chua chuyển gen codA, trước hết tiến hành đánh giá khả chịu mặn dịng đối chứng khơng chuyển gen nuôi cấy môi trường bổ sung thêm muối NaCl sau: Chồi dịng cà chua khơng chuyển gen nuôi cấy môi trường rễ bổ sung muối NaCl với nồng độ khác (100 mM, 150 mM, 200 mM) Sau tuần nuôi dàn đèn, kết thu sau: Bảng 3.2: Kết đánh giá khả rễ cà chua in vitro điều kiện bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy Nồng độ NaCl bổ sung (mM) Tổng số in vitro Tỉ lệ % số rễ Đặc điểm 20 100 (20/20) Cây sinh trưởng phát triển tốt, hầu hết rễ 100 50 94 (47/50) Cây sinh trưởng phát triển tốt, hầu hết rễ 150 50 24 (12/50) Cây sinh trưởng kém, vàng, không rễ rễ ngắn 200 50 (0/50) Cây sinh trưởng kém, không rễ 42 Ở nồng độ 100 mM NaCl dịng cà chua sống sót sinh trưởng bình thường (thân xanh tốt); nồng độ 150 mM NaCl dịng sống sót sinh trưởng chậm lại; nồng độ 200 mM dịng cà chua có tượng ngừng sinh trưởng, héo, diệp lục, vàng úa dần chết; dòng cà chua đối chứng (bổ sung mM NaCl môi trường), sinh trưởng phát triển tốt, hầu hết rễ (bảng 3.2) Từ kết này, chọn nồng độ muối 200 mM để đánh giá cà chua chuyển gen Hình 3.10: Cây cà chua khơng chuyển gen trên môi trường rễ nồng độ muối NaCl 100 mM (A), 150 mM (B), 200 mM (C) đối chứng không bổ sung NaCl (D) 3.2.2 Kết đánh giá khả chịu mặn cà chua chuyển gen Từ dòng cà chua chuyển gen codA đánh giá mức độ phiên mã tạo sản phẩm mRNA thí nghiệm mục 3.1, tiến hành đánh giá khả chịu mặn in vitro 43 Chồi cà chua chuyển gen codA nuôi cấy môi trường rễ có bổ sung thêm 200 mM NaCl, sau tuần nuôi giàn đèn kết cho thấy hầu hết dòng cà chua chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường, có rễ Ngược lại, 100% chồi dịng cà chua khơng chuyển gen (WT) bị chết nuôi cấy môi trường bổ sung 200 mM NaCl sau tuần nuôi cấy (bảng 3.3) Từ kết sang lọc sơ cho thấy dòng cà chua chuyển gen codA rễ, sinh trưởng bình thường có xanh đậm dịng chuyển gen triển vọng chịu mặn tốt Bảng 3.3: Tổng hợp kết đánh giá khả chịu mặn cà chua chuyển gen Số dòng Tỉ lệ % số rễ MT Tỉ lệ % mảnh sống sót chuyển gen chọn lọc sau tuần (số MT chọn lọc sau tuần (số rễ /tổng số cây) mảnh sống sót /10) 100% (2/2) 80% (8/10) 100% (1/1) 70% (7/10) 50% (1/2) 70% (7/10) 75% (3/4) 80% (8/10) 100% (2/2) 70% (7/10) 100% (1/1) 50% (5/10) 66,6% (2/3) 90% (9/10) 75% (3/4) 80% (8/10) 100 % (1/1) 100% (10/10) WT 0% (0/3) 0% (0/10) 44 Để kiểm chứng lần dòng cà chua chuyển gen codA rễ môi trường muối (200 mM NaCl) có khả chịu mặn tốt so với đối chứng không chuyển gen Chúng tiến hành thí nghiệm thử khả tái sinh chồi từ mảnh cà chua chuyển gen dịng đối chứng khơng chuyển gen (WT) môi trường tái sinh chồi bổ sung 200 mM NaCl Các mảnh cắt với kích thước 0,5*0,5 cm dao cấy sắc nuôi cấy môi trường tái sinh có bổ sung 200 mM NaCl, sau tuần kết cho thấy hầu hết mảnh cà chua chuyển gen có khả tái sinh chồi, sinh trưởng phát triển bình thường môi trường bổ sung 200 mM NaCl; mảnh cà chua khơng chuyển gen (WT) bị diệp lục không tái sinh chồi (bảng 3.2, hình 3.12) Kết này, lần cho thấy dòng cà chua chuyển gen codA có khả chịu mặn tốt so với dịng cà chua khơng chuyển gen Hình 3.11: Các dịng cà chua chuyển gen codA không chuyển gen môi trường rễ có bổ sung 200mM NaCl (A): Dịng cà chua chuyển gen; (B) dịng cà chua khơng chuyển gen (WT) 45 Hình 3.12: Mảnh cà chua tái sinh mơi trường có bổ sung 200 mM NaCl (A): dịng chuyển gen codA; (B) dịng khơng chuyển gen Các nghiên cứu tương tự công bố khả chịu mặn trồng chuyển gen codA Cây Hồng chuyển gen codA tăng cường khả chịu hạn mặn (Huang et al., 2000), thuốc chuyển gen codA tăng cường khả chịu mặn cao (Bùi Văn Thắng cs, 2014); Ngoài ra, nghiên cứu chuyển loại gen khác tham gia vào đường sinh tổng hợp GB kết cho thấy chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện mặn Cây cải dầu chuyển gen COX tham gia sinh tổng hợp GB tăng cường khả chịu hạn mặn (Huang et al., 2000), lúa chuyển gen betA chống chịu tốt với điều kiện hạn mặn (Takabe et al., 1998) Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp tích lũy GB khơng tăng cường khả chịu mặn mà chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt khác Cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA chống chịu tốt với nhiệt độ cao (Alia et al., 1998b), cường độ ánh sáng mạnh (Alia et al., 1999), băng giá (Sakamoto et al., 2000); lúa chuyển gen codA tăng cường khả chống chịu lạnh (Sakamoto et al., 1998); thuốc chuyển gen BADH sinh trưởng tốt điều kiện nhiệt độ cao (Yang et al., 2005) Bởi vậy, dòng cà chua chuyển gen codA tạo cần tiếp tục đánh giá khả chống chịu với điều kiện cực đoan khác (như nhiệt độ cao, lạnh, hạn, tác nhân oxy hóa, v.v.) 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 mang gen codA biến nạp thành công vào mầm cà chua Tái sinh chọn lọc 68 chồi rễ thuộc lơ thí nghiệm Kết PCR cho thấy 30/68 dịng chuyển gen dương tính với PCR (mang gen codA) Kiểm tra mức độ phiên mã gen codA chuyển gen kỹ thuật RT-PCR cho thấy: có 9/30 mang gen codA hoạt động phiên mã tạo sản phẩm mRNA Thử nghiệm đánh giá thành công khả chịu mặn nhân tạo cà chua chuyển gen Hầu hết dòng chuyển gen chịu mặn tốt dịng đối chứng khơng chuyển gen (cụ thể thí nghiệm thu dịng chuyển gen sống sót mơi trường có nồng độ muối NaCl 200 mM) ĐỀ NGHỊ Tiếp tục phân tích, đánh giá khả chống chịu điều kiện hạn, lạnh, nóng dịng cà chua chuyển gen codA điều kiện phịng thí nghiệm Đánh giá khả chịu mặn dòng cà chua chuyển gen điều kiện trồng nhà lưới Phân tích hàm lượng Glycine betain tích lũy cà chua chuyển gen 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu Tiếng Việt Tạ Thu Cúc (2002), Kỹ thuật trồng cà chua, Nxb Nông Nghiệp Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy trình tái sinh hệ thống chuyển gen cho số giống cà chua (Lycopersicon esculentum L.) Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(2), tr.217-223 Lê Thị Ánh Hồng, Nguyễn Hữu Đống, Đặng Thị Chín (1993), “Ứng dụng phương pháp ưu lai chọn giống cà chua”, Tạp chí sinh học, Nguyễn Hồng Minh (2000), Chọn giống cà chua, Trong giáo trình chọn giống Nguyễn Văn Hiển chủ biên, Nxb Giáo dục, tr 300-343 Hoàng Minh (2005), Kỹ thuật trồng chăm sóc dưa hấu, bí ngịi, cà chua, ngơ, Nxb Lao động Xã hội Nguyễn Thanh Minh (2004), Khảo sát tuyển chọn giống cà chua cho chế biến công nghiệp đồng Bắc Bộ, Luận án tiến sĩ nông nghiệp Nguyễn Hồng Minh (2007), Phát triển sản xuất cà chua lai F1 trồng trái vụ, chất lượng cao, góp phần thay giống nhập khẩu, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp 2007 Nguyễn Hồng Minh, Kiều Thị Thư (2000), “Giống cà chua lai HT7”, Báo cáo công nhân giống cà chua lai HT7, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Dương Kim Thoa, Trần Khắc Thi (2005), “Kết chọn tạo giống cà chua chế biến PT18”, Tạp chí NN&PTNT, (7), tr 33-35 10 Trần Khắc Thi (2005), Kỹ thuật trồng rau – rau an toàn chế biến rau xuất khẩu, Nxb Thanh Hóa 11 Bùi Văn Thắng (2014), Nghiên cứu tăng cường khả chống chịu hạn mặn Xoan ta (Melia azedarachL.) chuyển gen, Luận án tiến sỹ, Viện Công nghệ sinh học 12 Phạm Đồng Quảng (2006), Kết điều tra giống 13 trồng chủ lực nước – giai đoạn 2003-2004, Nxb Nông Nghiệp, tr 157-170 B Tài liệu nƣớc 48 13 Ahmad R., Kim M.D., Back K.H., Kim H.S., Lee H.S., Kwon S.Y., Murata N., Chung W.I & Kwak S.S (2008), “Stress-induced expression of choline oxidase in potato plant chloroplasts confers enhanced tolerance to oxidative, salt, and drought stresses”, Plant Cell Reports 27, pp 687–698 14 Allakhverdiev SI, Los DA, Mohanty P, Murata N (2007), “Glycinebetaine alleviates the inhibitory effect of moderate heat stress on the repair of photosystem II during photoinhibition”, Biochim Biophys Acta 1767, pp 163-171 15 Alia, Hayashi H., Sakamoto A & Murata N (1998b), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, The Plant Journal 16, pp 155–161 16 Alia, Sakamoto A., Nonaka H., Hayashi H., Saradhi P.P., Chen T.H.H & Murata N (1999), “Enhanced tolerance to light stress of transgenic Arabidopsis plants that express the codA gene for a bacterial choline oxidase”, Plant Molecular Biology 40, pp 279–288 17 Avinash Chandra Rai, Major Singh, KavitaShah (2013), “Engineering drought tolerant tomato plants over-expressing BcZAT12 gene encoding a C2H2 zinc finger transcription factor”, Phytochemistry, Vol 85, pp 44-50 18 Berry AN, Beaupre CE, and Dale M (1995), “Inhibition of virB mediated transfer of diverse subsstrate from Agrobacterium tumefaciens by the IncQ plasmid RSF-0110, Journal of Bacteriology 177, pp 4890 19 Chen TH., Murata N (2002), “Enhancement of tolerance to abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes”, Curropin Plant Biol 5, pp 250-257 20 Chen WP, Li PH, Chen THH (2000), “Glycinebetaine increases chilling tolerance and reduces chilling-induced lipid peroxidation in Zea mays L”, Plant Cell Environ 23, pp 609-618 21 Collins G.G and Symons R.H (1992), “Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure”, Plant Mol Biol Rept 10, pp 233235 22 Frary A, and Earle D.E (1996), “An examination of factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of tomoto”, Plant Cell Reports 16, pp 235-240 49 23 Haldimann P, Feller U (2004), “Inhibition of photosynthesis by high temperature in oak (Quercus pubescens L.) leaves grown under natural conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the activation state of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase”, Plant Cell Environ 27, pp 1169-1183 24 Haldimann P, Feller U (2005), “Growth at moderately elevated temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to heat stress in pea leaves”, Plant Cell Environ 28, pp 302-317 25 Hamza S., Chupeau Y (1993), “Re-evaluation of conditions for Plant Regeneration and Agrobacterium-Mediated Transformation from Tomato (Lycopersicum esculentum)”, Journal of Experimental Botany, 44 (12), pp 1837-1845 26 Hayashi H, Alia Mustardy L, Deshnium P, Ida M, Murata N (1997), “Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase; accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress”, Plant Journal 12, pp 42 –133 27 Huang J., Hirji R., Adam L., Rozwadowski K.L., Hammerlindl J.K., Keller W.A & Selvaraj G (2000), “Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations”, Plant Physiology 122, pp 747–756 28 Ikuta S, Mamura S, Misaki H, Horiuti Y (1997), “Purufication and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis”, J Biochem 82, pp 1741-1749 29 Ling Q.H., Kriseleit D., and Ganal W.M (1998), “Effect of ticarcillin/potassium claculanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicom esculentum Mill.)”, Plant Cell Reports 17, pp 843-847 30 Linhui Y, Xi C, Zhen W, Shimei W, Yuping W, Qisheng Z, Shihui L, Chengbin X (2012), “Arabidopsis enhanced drought tolerance 1/HOMEDOMAIN 50 GLABROUS11 confers drought tolerance in transgenic rice without yield penalty”, Plant physiol, 162 (3), pp 1378-1391 31 McKersie BD, Leshem YY (1994), Chilling stress In: McKersie BD, Leshem YY (eds) Stress and Stress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Boston-London, pp 79-103 32 Mohanty A., Kathuria H., Ferjani A., Sakamoto A., Mohanty P., Murata N & Tyagi A.K (2002), “Transgenics of an elite indica rice variety Pusa Basmati harboring the codA gene are highly tolerant to salt stress”, Theoretical and Applied Genetics 106, pp 51–57 33 Nyyssola A, Kerovuo J, Kaukinen P, von Weymarrn N, Reinikainen T (2000), “Extreme halophiles synthesize betaine from glycine by methylation”, J Biol Chem 275, pp 22196-22201 34 Paniti et al (2012), “Gene Stacking in Transgenic Tomato Resistance to Viral Diseases”, Agricultural Sci.J, 43(2-3), pp 311-324 35 Park H.S., Morris L.J., Park E.J., Hirschi D.K., and Smith H.R (2003), “Efficient and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation”, Journal of Plant Physiology 160, pp 1253-1257 36 Park E.J., Jeknic Z., Sakamoto A., DeNoma J., Yuwansiri R., Murata N & Chen T.H.H (2004), “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage”, The Plant Journal 40, pp 474– 487 37 Park EJ, Jeknic Z, Pino MT, Murata N, Chen THH (2007a), “Glycinebetaine accumulation is more effective in chloroplasts than in the cytosol for protecting transgenic tomato plants against abiotic stress”, Plant Cell Environ 30, pp 9941005 38 PapageorgiouGC, Murata (1995), “The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen-evolving Photosystem II complex”, Photosynth Res 44, pp 234-252 39 Qiu D., Diretto G., Tavarza R., and Giuliano G (2007), “Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomoto and production of transgenic 51 plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD”, Scientia Horticulturae 112, pp 172-175 40 Rathinasbapathi B, Burnet M, Hanson AD (1997), “Choline monooxygenase, an unusual ironsulfur enzyme catalyzing the first step of glycine betaine synthesis in plants: Prosthetic group characterization and cDNA cloning”, ProcNatlAcadSci USA 94, pp 3454-3458 41 Rathinasbapathi B, Fouad WM, Sigua CA (2001), “b-Alanine betaine synthesis in the Plumbaginaceae Purification and characterization of a trifunctional, Sadenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase from Limonium latifoliumleaves”, Plant Physiol 126, pp 1241-1249 42 Roekel J., Damm B., Melchers L., and Hoekema A (1993, “Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicum esculentum)”, Plant Cell Reports 12, pp 644-647 43 Saneoka H, Nagasaka C, Rhodes D (1995), “Salt tolerance of glycine betaine deficient and containing maize lines”, Plant Physiol 107, pp 631-638 44 Sakamoto A., Alia & Murata N (1998), “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold”, Plant Molecular Biology 38, pp 1011–1019 45 Sakamoto A & Murata N (2000), “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for enhancement of stress tolerance”, Journal of Experimental Botany 51, pp 81–88 46 Sakamoto A., Murata N.(2002), “The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgenic plants”, Plant Cell Environ 25, pp 163171 47 Savio PR, Aline ML, Claudia RBS (2012), Recent molecular advances on downstream plant responses to abiotic stress”, Int J Mol Sci, 13(7), pp 8628-8647 48 Sun J.H., Uchii S., Watanabe S., and Ezura H (2006), “A highly efficent transformation protocol for Micro-Tom, a model cultuvar for tomato functional genomics”, Plant Cell Physiol, 47(3), pp 426-431 52 49 Takabe T, Hayashi Y, Tanaka A (1998), Evaluation of glycine betain accumulation for stress tolerance in transgenic rice plants, In: Proceedings of International Workshop on Breeding and Biotechnology for Environmental Stress in Rice”, Hokkaido Agricultural Experiment Station, Sapporo, pp 63-68 50 Tao Lin, Guangtao Zhu, Xiangyang Xu et al (2014), “Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding”, Nature Genetics 46, pp 1220-1226 51 Thomashow MF (1999), “Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanism”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, pp 571-599 52 Waditee R., Bhuiyan M.N.H., Rai V.,et al (2005), “Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic-stress tolerance in Synechococcusand Arabidopsis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, pp 1318–1323 53 Ward JM, Hirschi KD, Sze H (2003), “Plants pass the salt”, Trends Plant Sci 8, pp 200-201 54 Yang W., Rich P.J., Axtell J.D (2003), “Genotypic variation for glycinebetain in sorghum”, Crop science 43, pp 162-169 55 Yang X, Liang Z, Lu C (2005), “Genetic engineering of the biosynthesis of glycine betain enhances photosynthesis against high temperature stress in transgenic tobacco plants”, Plant Physiol 138, pp 2299-2309 C Tài liệu internet 56 http://faostat.fao.org ... chuyển gen vào mầm cà chua 3.1.2 Kết chuyển gen, tái sinh chọn dòng cà chua chuyển gen codA Dựa vào quy trình chuyển gen tái sinh cà chua tối ưu Đỗ Xuân Đồng cs (2007), gen codA chuyển vào cà. .. tiêu nghiên cứu: Tạo cà chua mang gen codA Nội dung nghiên cứu (1) Chuyển gen codA vào mầm cà chua thông qua vi khuẩn A tumefaciens (2) Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng cà chua chuyển gen mang. .. dòng cà chua chuyển gen codA 34 3.1.3 Phân tích cà chua chuyển gen codA kỹ thuật PCR 37 3.1.4 Phân tích cà chua chuyển gen codA kỹ thuật RT-PCR 38 3.2 Đánh giá khả chịu mặn dòng cà chua chuyển