Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg và gen inha từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại miền trung việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _  TRỊNH QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _  TRỊNH QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM Chuyên ngành Mã số : Công nghệ sinh học : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Bệnh lao bệnh truyền nhiễm vi trùng lao (còn gọi vi trùng Koch hay BK) gây ra, lây nhiễm từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành Bệnh gặp tất phận thể, lao phổi thể lao phổ biến (chiếm 80 85%) nguồn lây cho ngƣời xung quanh, nhƣng dễ ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng dẫn đến bệnh lao màng não, ảnh hƣởng hệ bạch huyết, hệ tuần hồn dẫn đến bệnh lao kê Bệnh chữa khỏi mà không để lại di chứng nhƣ đƣợc phát sớm, điều trị kịp thời Tuy nhiên, ngƣời bệnh điều trị không cách (bỏ dở điều trị dùng thuốc không theo dẫn thầy thuốc) gây hậu nghiêm trọng nhƣ: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng gây tử vong; gây tƣợng kháng thuốc, nguy hiểm kháng đa thuốc làm cho việc điều trị khó khăn tốn hơn; tiếp tục nguồn lây nhiễm cộng đồng Việc điều trị lao đa kháng thuốc phức tạp khó khăn Chi phí điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị tử vong bệnh nhân cao Hiện nay, để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc sở y tế nƣớc phải dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao làm kháng sinh đồ kéo dài - tuần nhƣ gặp khó khăn việc điều trị Sinh học phân tử tạo đột phá chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc khắc phục đƣợc nhƣợc điểm Thời gian chẩn đốn rút ngắn xuống vài ngày với độ nhạy độ đặc hiệu cao Kháng thuốc xảy đột biến khu vực hệ gen MTB, nhƣ: katG, inhA, ahpC, kasA ndh liên quan đến tính kháng isoniazid (INH), ropB kháng rifampicin (RIF), embB kháng ethambutol (EMB), pncA kháng pyzamid (PZA) rpsL, rrs liên quan đến tính kháng streptomycin (STR) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Xuất phát từ lí trên, tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid phương pháp xác định đột biến gen katG gen inhA từ chủng vi khuẩn lao phân lập Miền Trung - Việt Nam " Mục tiêu nghiên cứu Phát đột biến gen katG gen inhA liên quan đến tính kháng isoniazid chủng lao nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đờm bệnh nhân - Kiểm tra độ tinh DNA tổng số đo OD260nm / 280nm = 1,8 2,2 - Nhân đoạn gen katG gen inhA từ chủng vi khuẩn lao nghiên cứu - Tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli - Tách dòng gen katG gen inhA - Giải trình tự gen katG gen inhA - Phát hiện, phân tích đột biến gen katG gen inhA liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lao 1.1.1 Tình hình bệnh lao giới Nhƣ chúng ta đã biết , lao là một nhƣ̃ng bệnh nhiễm trùng mãn tí nh xuất hiện sớm nhất ở loài ngƣời và có khả lây truyền cộng đồng , mối đe dọa lớn với tất ngƣời hành tinh Nếu không có sƣ̣ kiểm soát của ngƣời bằng nhƣ̃ng phƣơng pháp và công cụ hƣ̃u hiệu, bệnh lao có thể bùng phát nhƣ một bệnh dị ch nguy hiểm , làm chết nhiều ngƣời tác động xấu đến phát triển kinh tế xã hội Hiện nay, thế giới có khoảng 2,2 tỷ ngƣời nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới ), tỷ lệ điều trị thành công 85% bằng hoá trị liệu , nhƣng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ƣớc tí nh Nhƣ vậy , nhiều bệnh nhân lao không đƣợc chƣ̃a trị đa ng tiếp tục lây lan cho cộng đồng và theo ƣớc tí nh của Tổ chƣ́c Y tế Thế giới (TCYTTG), mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu ngƣời) [3], [11] Năm 1993, Tổ chƣ́c Y tế Thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tì nh trạn g khẩn cấp toàn cầu củ a bệnh lao và mối hiểm họa tƣơng lai bệnh lao kháng thuốc [3], [11] Năm 2005, TCYTTG ƣớc tí nh khu vƣ̣c Đông Nam Á có 4,8 triệu bệnh nhân lao Trong đó số ca bệnh nhân lao mắc mới là gần triệu, chiếm 34% toàn cầu Số ngƣời chết ở Đông Nam Á lá 512000 ngƣời, chiếm 1/3 tồn giới Châu Phi có sớ bệnh nhân lao là 3,8 triệu ngƣời ; số ca mới mắc là 2,5 triệu; số chết bệnh lao 544000 Hai khu vƣ̣c này có tình hình mắc lao nặng nề giới [15] WHO dƣ̣ báo chi phí điều trị cho bệnh nhân lao ở 27 nƣớc có số bệnh nhân đông nhất sẽ lên đến 16 tỷ USD vòng năm tới và coi bệnh lao là vấn đề y tế cộng đồng, nhƣ̃ng nguyên nhân chí nh gây tƣ̉ vong thế giới Không nhƣ̃ng thế, nhiều vấn đề mới nảy sinh , thậm chí đƣợc đánh giá là nghiêm trọng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương tồn cầu làm cho cơng tác phịng , chống lao gặp khó khăn , đe dọa phá vỡ nhƣ̃ng thành quả đạt đƣợc Báo cáo WHO đƣợc đƣa dựa thông tin thu thập thời gian từ 2002-2006 1/2 nƣớc giới nƣớc cịn lại khơng hợp tác Chẳng hạn Châu Phi có nƣớc cung cấp thơng tin lao kháng thuốc cho WHO Trƣớc tình hình trên, WHO thúc giục quốc gia tổ chức từ thiện giới tập trung đầu tƣ vào DOTS- chiến dịch chuẩn hóa cách phát hiện, điều trị đƣợc mở rộng Đồng thời tổ chức y tế vừa đƣa chƣơng trình DOTS- Plus (chƣơng trình DOTS mở rộng) liên quan đến việc sử dụng thuốc đa dạng nhằm chống lại dòng MDR Việc kiểm sốt dịch bệnh nƣớc khơng thể ngăn chặn sức kháng thuốc khuẩn lao, có đầu tƣ đồng vào chiến dịch phịng chống bệnh tồn giới phát huy tác dụng [3], [13] Tƣ̀ năm 2000 đến năm 2008, quan phát triển quốc tế hoa kỳ (USAID) đã cung cấp gần 900 triệu đô la cho chƣơng trì nh phòng , chống lao toàn thế giới Trong năm tài khoá 2009, USAID đã cung cấp 15 triệu đô l a cho sở sản xuất thuốc chống lao toàn cầu (DF) Bệnh lao là bệnh của ngƣời nghèo , lây lan nhanh cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dƣỡng Mƣ́c độ nặng nề của bệnh lao ản h hƣởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển ngƣời quốc gia Các nghiên cứu kinh tế y tế cho thấy , mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bì nh 3-4 tháng lao động , làm giảm 20-30% thu nhập bình qn gia đình tác động tới 70% đối tƣợng lao động chí nh của xã hội [3], [6] Đáng buồn vào thời điểm tại, 129 năm kể từ ngày nhà bác học ngƣời Đức Robert Koch cơng bố tìm ngun nhân gây bệnh lao bệnh chƣa đƣợc khống chế Có nhiều cách lý giải thực trạng song thấy đƣợc số lý chủ yếu nhƣ sau: Sự xuất mức độ hoành hành ngày tràn lan đại dịch HIV/AIDS; tình hình bệnh lao kháng thuốc; xuống cấp sở y tế điều trị chăm sóc bệnh nhân lao nhƣ thiếu quan tâm đến cơng tác phịng , chống lao tồn số quốc gia, đặc biệt nƣớc phát triển Thêm vào tình trạng di dân quốc gia, từ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương nƣớc có số ngƣời mắc lao cao sang nƣớc có số ngƣời mắc lao thấp; tình trạng di dân, thị hóa quốc gia; tình trạng nghèo đói đặc biệt phƣơng tiện để chẩn đoán điều trị lao nhiều năm qua chƣa có đổi đáng kể [38] 1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo Ủy ban điều phối liên minh phòng , chống lao toàn cầu , Việt Nam xếp thƣ́ 12 22 nƣớc có gánh nặng bệnh lao toàn cầu , cao nhiều bậc so với nhiều năm trƣớc đó Hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 bệnh nhân lao các hệ xuất hiện và khoảng 12.000 ca đồng nhiễm lao /HIV Việt Nam là nƣớc có nhiều bệnh nhân lao đƣ́ng hàng thƣ́ ba ở khu vƣ̣c Tây Thái Bì nh Dƣơng , sau Trung Quốc Philippin Tỷ lệ dân số Việt Nam mắc lao là 44% Tỷ lệ kháng th uốc là 32,5% cao so với khu vực Với nguy mắc lao ƣớc tí nh hàng năm là 1,7% Tỷ lệ chết lao khá cao : 26/100.000 dân tƣơng đƣơng với 20.000 ngƣời chết lao mỗi năm Nhƣ vậy, Việt Nam ngày có gần 400 ngƣời mắc bệnh lao và 55 ngƣời chết vì bệnh lao Kết quả điều tra dị ch tễ cho thấy nguyên nhân bệnh lao vẫn tiếp tục tăng ở Việt Nam tỷ lệ lao tăng ở nhóm tuổi trẻ và công tác giám sát lao chƣa đƣợc quan tâm đúng mƣ́c, nguồn nhân lƣ̣c cho công tác phòng, chống lao ngày mai ; 50% số cán bộ y tế phòng, chống lao cấp huyện chƣa đƣợc đào tạo là thƣ̉ thách lớn với công tác phòng, chống lao tại Việt Nam [11] Một khảo sát vào năm 2004 chƣơng trình chống lao quốc gia cho thấy địa phƣơng có mật độ lƣu chuyển dân số đông, y tế tƣ hiệu thuốc phát triển nơi có tỷ lệ điều trị thất bại, tái phát, mãn tính bệnh lao cao Cụ thể số bệnh nhân tái phát thất bại Đà Nẵng 48, Cần Thơ 195 An Giang 570 TP.HCM 1.664 [2] Nƣớc ta thuộc loại trung bì nh về dịch tễ thế giới Đội ngũ cán chống lao các cấp hiện là 15772 (20/100.000 dân) Số cán bộ này tập trung chủ yếu ở t ỉnh miền Bắc Bắc Trung Trong đó , tỉnh phía Nam , bao gờm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương TP.HCM nơi có số bệnh nhân hàng năm cao nhất cả nƣớc , đạt 10 cán cho 100.000 dân [3] Tình hình đồng nhiễm lao/HIV thách thức lớn đƣợc đánh giá nghiêm trọng Lao bệnh nhiễm trùng phổ biến nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ngƣời nhiễm HIV Theo thống kê chƣơng trình chống lao quốc gia, tất tỉnh, thành phố nƣớc có ngƣời đồng nhiễm lao HIV Ngƣời đồng nhiễm lao/HIV tập trung tỉnh, thành phố có nhiều ngƣời nhiễm HIV mắc lao: TP Hồ Chí Minh, An Giang, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Lạng Sơn Qua khám sàng lọc lao cho 5.114 ngƣời nhiễm HIV cho thấy, có 18,6% số nhiễm HIV có mắc lao; khoảng 90% số ngƣời nhiễm lao/HIV lứa tuổi 18-40 Đáng ý, qua giám sát trọng điểm có 5% số ngƣời bệnh lao có HIV, tỷ lệ tăng gấp 10 lần so với năm 1990 Sự gia tăng đại dịch HIV/AIDS làm cho bệnh nhân lao lại thêm trầm trọng 50% số ngƣời nhiễm HIV trở thành bệnh lao nhiễm vi khuẩn lao [3] Theo kết điều tra dịch tễ lao tồn quốc 2006-2007, tình hình bệnh lao nƣớc ta cao ƣớc tính Tổ chức Y tế Thế Giới 1,6 lần Đặc biệt, bệnh lao có xu hƣớng giảm lứa tuổi già có xu hƣớng tăng lứa tuổi trẻ Ở lứa tuổi 15-24, tỷ lệ phát lao phổi AFB dƣơng tính 100.000 dân tăng từ 29,5 (năm 2000) lên 37,5 (năm 2008) nam giới nữ giới từ 16,9 lên 22,8 [10] Năm 2006, Chƣơng trì nh chống lao quốc gia xây dựng kế hoạch phịng , chớng lao giai đoạn 2006-2010 Với mục tiêu phát hiện đƣợc nhân lao và điều trị khỏi cho 70% số bệnh 90% số bệnh nhân lao đã đƣợc phát hiện , đến , chiến lƣợc DOTS (điều trị lao bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trƣ̣c tiếp ) đã đƣợc triển khai tại 100% số huyện cả nƣớc và tiếp tục xây dƣ̣ng kế hoạch phịng, chớng lao giai đoạn 2010-2015 [10], [14] Việt Nam quốc gia có tình hình lao nghiêm trọng giới (Cambodia, China, Mongolia, Papa New Guinea, Philippines, Vietnam) Đến cuối Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương 2003, Việt Nam nƣớc giới đạt đƣợc mục tiêu phát 70% số lao phối AFB(+) ƣớc tính điều trị lành 85% số bệnh nhân lao Đây mục tiêu tiến đến kiểm sốt bệnh lao tồn giới vào năm 2005 WHO khởi xƣớng từ năm 1999 [2] Cũng nhƣ nhiều nƣớc giới, nƣớc ta phải đối mặt với nhiều khó khăn , thách thức nhằm trì tính bền vững hoạt động chống lao,cũng nhƣ thành tựu đạt đƣợc Chủ đề Ngày giới phòng chống lao năm đƣợc WHO đƣa :"Đổi mới để kiểm soát tốt bệnh lao", đó đặc biệt nhấn mạnh tới việc đổi mới về cộng cụ chẩn đ ốn điều trị phịng bệnh tốt ; đổi mới phƣơng pháp tiếp cận để nhiều ngƣời đƣợc phát hiện, điều trị và đổi mới về huy động các đối tác cùng tham gia phòng , chống bệnh lao Hƣởng ƣ́ng chủ đề này , Việt Nam , đã tiến hành triển khai chiến dịch truyền thông nhân ngày 24/3: "Đổi tƣ ngƣời để kiểm soát bệnh lao tốt " Thiết nghĩ cũng chí nh là hƣớng giải pháp thích hợp hiệu bối cảnh c nƣớc ta để góp phần kiểm sốt khống chế bệnh nguy hiểm Vấn đề cốt lõi cần tiến hành thời điểm hiện tại chí nh là đởi mới tƣ về phịng chống bệnh lao [13] 1.1.3.Tình hình lao kháng thuốc Tổ chức Y tế giới (WHO) cảnh báo bệnh lao kháng thuốc (drugreisistant tuberculosis) lan nhanh nhà chuyên gia y tế dự đoán Tại số quốc gia tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lao kháng thuốc lên tới số chƣa có 20% Bác sĩ Mario Raviglione, giám đốc WHO nói "Cách 10 năm, khơng nghĩ tới số cao nhƣ Điều chứng tỏ tiếp tục phạm sai lầm việc điều trị bệnh lao" [3] Cho tới 50 năm trƣớc loài ngƣời tìm thuốc chữa lao Giờ dịng lao kháng thuốc xuất có 1,7% số ca mắc bệnh giới ca kháng đa thuốc (MDR) Năm 2006, dòng lao kháng thuốc cực mạnh (XDR) bắt đầu xuất Chủng lao XDR không kháng thuốc tuyến đầu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương mà cịn kháng loại thuốc tuyến 2- tuyến phòng thủ cuối chống vi trùng lao, vốn gây độc hại nhiều cho bệnh nhân với thời gian điều trị chi phí đắt đỏ Sự lây lan lao kháng thuốc cực mạnh đƣợc tiếp sức đại dich HIV, hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng yếu kém, lãng biện pháp kiểm sốt lây nhiễm [7] Theo ƣớc tính WHO, giới có khoảng 424.203 ngƣời bị mắc MDR, chiếm số lƣợng lớn khu vực Tây Thái Bình Dƣơng 152.203 trƣờng hợp, khu vực Đông Nam Á sau khu vực Đơng Âu Châu Phi Một số nƣớc có tỷ lệ MDR bệnh nhân lao cao là: Cộng hòa Dominica, Ecuador, Bờ biển Ngà, Latvia, Uzbekistan, Trung quốc, Iran, Israel [6] Từ nhiều năm nay, Tổ chức Y tế Thế giới định nghĩa bệnh lao kháng đa thuốc (MDR-TB: Multi Drug Resistace- Tuberculosis) vi khuẩn lao kháng lại isoniazid (rimifon) rifampicin (đây thuốc số thuốc chống lao hàng đầu gồm: isoniazid (H), rifampicin (R), ethamintol (E) streptomicin (S) Giờ WHO lại đƣa khái niệm bệnh lao cực kháng thuốc (XDR-TB: Extreme Drug Resistance- Tuberculosis) vi khuẩn kháng lại isoniazid, rifampicin từ thuốc thuốc chống lao hàng thứ trở nên gồm : kanamycin, ofloxacin, cycloserin, PAS có nghĩa XDR-TB = MDR-TB > thuốc hàng thứ [14] Trƣớc tình hình XDR ngày trầm trọng, từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO trung tâm kiểm sốt bệnh Hoa Kỳ tiến hành phân tích 17.690 mẫu đàm đƣợc gửi từ 40 quốc gia toàn giới Kết phân tích cho thấy có 20% trƣờng hợp MDR 2% XDR Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng (trong có Việt Nam) MDR 4,2% bệnh nhân lao 26% trƣờng hợp có tiền trị lao [6] Năm 1998, TCYTTG cơng bố kết khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc 35 nƣớc khu vực giới, theo công bố tỷ lệ kháng thuốc tiền phát trung bình với riêng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5% Tỷ lệ kháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương Bảng 3.5 Vị trí xảy đột biến thay acid amin chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Vị trí Mẫu TB05 - 97 144 169 I→ T TB05 - 108 186 269 S→ L L→ P E→ G TB05 - 117 TB05 - 213 TB05 - 254 Kết từ bảng 3.4 3.5 cho thấy có mẫu xuất đột biến đột biến thay cụ thể nhƣ sau: Ở mẫu bệnh phẩm TB05-97, phát điểm đột biến, điểm 431 có đột biến làm biến đổi ba ATC thành ACC dẫn đến làm thay đổi acid amin Ile thành Thr Tại điểm 557, có đột biến đổi ba TCG thành TTG dẫn đến làm thay đổi acid amin Ser thành Leu Tại điểm 806, có đột biến làm biến đổi ba CTC thành CCC dẫn đến làm thay đổi acid amin Leu thành Pro Ở mẫu bệnh phẩm TB05-108, phát đột biến, điểm 506, có đột biến làm biến đổi ba GAG thành GGG dẫn đến làm thay đổi acid amin Glu thành Gly Theo nghiên cứu Leung đồng tác giả năm 2006 chủng phân lập miền Nam - Trung Quốc, tác giả phát đột biến codon 194 (Ile194Thr) [29] Trong số nghiên cứu gần rằng, đột biến Ile194Thr 10 đột biến quan trọng có liên quan tới tính kháng isoniazid vi khuẩn lao [25], [34] Trong nghiên cứu này, không phát thấy đột biến Ile194Thr gen inhA mẫu nghiên cứu Điều giải thích thay đổi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương vị trí địa lý, phân bố chủng vi khuẩn lao với đột biến thay đổi gen inhA dẫn đến kháng isoniazid khác Bên cạnh đó, chúng tơi phát hiện một số điểm đột biến mới Các đột biến này chƣa tƣ̀ng đƣợc công bố trƣớc Với sớ lƣợng mẫu hạn chế và chƣ a có khả nghiên cứu sâu protein nên chúng chƣa khẳng đị nh đƣợc các đột biến này có liên quan tới tí nh kháng thuốc isoniazid hay không Có thể đột biến đột biến phát sinh khơng ảnh hƣởng tới tính kháng thuốc, hoặc cũng đột biến có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid mức độ định Để có thể đƣa một kết luận chí nh xác về tí nh kháng thuốc của các chủng vi khuẩn lao liên quan đến vị trí đột biến cần p hải tiến hành nghiên cứu sâu Tóm lại, qua nghiên cứu 17 mẫu bệnh phẩm có 13/17 mẫu có mang đột biến với nhiều dạng khác nhận thấy tỷ lệ đột biến gen katG gần 77%, tỷ lệ đột biến gen inhA gần 40% Tại mẫu bệnh phẩm có đột biến đột biến S315T chiếm tỷ lệ cao 76% Các kết nghiên cứu đống với nghiên cứu tác giả khác giới Đồng thời kết củng việc ứng dụng sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc gen katG inhA vi khuẩn lao góp phần chẩn đốn vi khuẩn lao kháng isoniazid Việt Nam Điều có ý nghĩa lớn cho cơng tác điều trị kiểm sốt bệnh lao nƣớc ta Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương KẾT LUẬN Trình tự gen katG có kích thƣớc 684 bp gen inhA có kích thƣớc 501 bp 17 chủng M tuberculosis thu thập từ bệnh nhân nhiễm lao bệnh viện Trung ƣơng Huế đƣợc thu nhận, tách dịng giải trình tự Kết nghiên cứu 17 mẫu bệnh phẩm có 13/17 mẫu có mang đột biến với nhiều dạng khác Chúng nhận thấy tỷ lệ đột biến gen katG gần 77%, tỷ lệ đột biến gen inhA gần 40% Tại mẫu bệnh phẩm có đột biến đột biến S315T gen katG chiếm tỷ lệ cao 76%.3 Có mẫu bệnh phẩm kháng đa thuốc khơng có đột biến Ile194Thr gen inhA liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu với số lƣợng chủng M tuberculosis lớn để đánh giá tỉ lệ, vị trí tƣơng quan kháng thuốc xảy gen katG gen inhA hệ gen vi khuẩn lao Nghiên cứu mối quan hệ vị trí đột biến phát mẫu bệnh phẩm với tính kháng thuốc vi khuẩn lao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sĩ sinh học Bộ Y tế , Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005 Bộ Y tế, Viện Thông tin Thƣ viện Y học Trung ƣơng (2007), Tình hình bệnh lao (http://www.hoilhpn.org.vn/) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đì nh Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Phan Thƣợng Đạt (2008) Tình hình bệnh lao kháng thuốc cách phịng ngừa Bùi Khắc Hậu (2009), Tại vi khuẩn lao kháng thuốc (http://www.toquoc.gov.vn/Print/Article/Tai-Sao-Vi-Khuan-Lao-Khang-thuoc/pdf) Phan Trọng Hồng, Ngơ Văn Trƣờng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2007), "Tách dòng gen biểu mã gen mã hóa tiểu đơn vị p66 enzyme phiên mã ngược virus HIV-1" Tạp chí Cơng nghệ sinh học tập 5, số 4, tr 463-470 Nguyễn Văn Hƣng(2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Mycrobacterium Tuberculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phô , Luâ ̉ i ̣ n án tiến sỹ Y họ.c 10 Trà Long (2009), Cơng tác phịng, chống lao Việt Nam: trở ngại nhiều (http://www.unaids.org.vn/sitee/index.php?option=com_content&task=view&id=36 6&Itemid=67&lang=vietnam) 11 Lê Thị Lún (2007), Bợ Y tế , Tình hình dịch tễ , điều trị , dự phòng và nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tƣ̉ về bệnh lao , Đại học Quốc gia Hà Nội, tháng 8/2007 12 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị , Nhà xuất bản giáo dục Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương 13 Thơng cáo báo chí (2010), Hoa Kỳ kỷ niệm Ngày Thế giới phòng, chống Lao 2010 (http://vietnamese.vietnam.usembassy.gov/pr240310.html) 14 Thuốc - sƣ́c - khỏe (2009), Thuốc chống lao (http://www.thuoc- suckhoe.com/khainiem/baiviet/phanloai062.htm) 15 Lê Huyền Ái Thúy, Hồ Thi Thanh Thủy, Nguyễn Văn Hƣng, Nguyễn Bảo Toàn, '' Phát nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc Isoniazid, Rifampin Ethambutol Realtime PCR'' , Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009, NXB Đại học Thái Nguyên, tr 881-884 16 Phùng Công Thƣởng(2007), Nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin bằng phương pháp xác đị nh đột biến gene rpoB , Luận văn thạc sỹ Y học 17 Quyền Đì nh Thi (2005), Công nghệ sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 18 Nguyễn Xuân Triều (2006), "Chẩn đoán lao", Bài giảng lao bệnh phổi Khoa Sau đại học, Học viện quân y 19 Phạm Hùng Vân (2007), Các quy trình kỹ thuậ t sinh học phân tử thường được sử dụng chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh B Tiếng Anh 20 Ahmad S, Fares E, Araj GF, Chugh TD, Mustafa AS (2002), Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut Inter J Tuber and lung dis 6(10), pp 920-926 21 Amina A (2009), Genotypic detection of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 8,pp 22 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G (2008), ”Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương 23 Balganesh, T.S., Alzari, P.M., Cole, S.T (2008), “Rising standards for tuberculosis drug development” Trends Pharmacol Sci., 29(11), pp 576-581 24 Basso LA, Santos DS, de Souza ON (2005) Molecular dynamics simulation studies of the wild-type, I21V, and I16T mutants of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase (InhA) in complex with NADH: toward the understanding of NADH-InhA different affinities Biophys J 89(2), pp 876-884 25 Chomezynski and Sacchi (1987), ''A rapid DNA isolation procedure for the identification of Campylobacter jejuni by the polymerase chain reaction''http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2672.2000.00841.x/pdf 26 Dale, JW, No RM., Ramayah S, Tang TH., Zainuddin ZF (1999), “Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia”, J Clin Microbiol., 37(5), pp 1265-1268 27 Dalla Costa and et al (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America 28 Department of Biological Sciences 1000 Hilltop Circle Baltimore (2007), Preparation of Genomic DNA from Bacteria (http://www.research.umbc.edu/~jwolf/genomic) 29 Leung ET, Ho PL, Yuen KY, Woo WL, Lam TH, Kao RY, Seto WH, Yam WC (2006) Molecular characterization of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis: identification of a novel mutation in inhA Antimicrob Agents Chemother 50(3), pp 1075-8 30 Marttila HJ, Soini H, Huovinen P, Viljanen MK (2009), katG mutations in isoniazidresistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8878604?ordinalpos=11&itool=EntrezSystem2.PEnt rez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương 31 Naga, S., Urvashi, B.S., Jyoti, A., Jitendra, N.P., Pradeep, S., Jyotish, C.S (2006), “Rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis by inhouse, reverse line blot assay”, Diagn Microbio Infect Dis., 56(2), pp 133-140 32 Noordhoek, G.T., Kaan, J.A., Mulder, S., Wilke, H., Kolk, A.H (1995), “Routine application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis in clinal samples”, J Clin Pathol., 48, pp 810-814 33 Palo.mino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care www.tubercuosistextbook.com 34 Ramaswamy, S, Musser, J.M (1998), “Molecular genetic basis of anti-microbial agent resistance in Mycobacterium Tuberculosis” Tuber Lung Dis., 79(1), pp 3-29 35 Shin Scholossberg, D (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections, Fifth edition McGraw-Hill, Medical Publishing Division Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương 36 Shitrit, D., Vertenshtein, T., Shitrit, A.B., Shlomi, D., Kramer, M.R., (2005), “The role of routine culture for tuberculosis during bronchoscopy in a nonendemic area: analysis of 300 cases and review of the literature”, Infect Control 33(10), pp 602-605 37 W.H.O (2004), “Anti-tuberculosis drug resistant in the world”, WHO Report No 2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 38 W.H.O, (2007), “Global tuberculosis control surveillance, planning, financing”, WHO Report 2007 39 Wengenack NL, Todorovic S, Yu L, Rusnak F (2009), Evidence for differential binding of isoniazid by Mycobacterium tuberculosis KatG and the isoniazidresistant mutant KatG(S315T), Biochemistry 1998 Nov 10;37(45):15825-34 40 Zhang, Y., Yew, W.W (2009), “Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”, Tuberc Lung Dis., 13(11), pp 1320-1330 41 Zhu, X., Chang, S., Fang, K., Cui, S., Liu, J., Wu, Z., Yu, X., Gao, G.F., Yang, H., Zhu, B., Wang, J (2009), “MyBASE: a database for genome polymorphism and gene function studies of Mycobacterium”, BMC Microbiol, pp 9: 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương PHỤ LỤC + Các dung dịch sử dụng tách chiết plasmid từ vi khuẩn.: - Sol I: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM - Sol II: NaOH 0,2M; SDS 1% - Sol III: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M + Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8 + Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1), 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol + Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris-HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8 + Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml + Các loại môi trƣờng: - Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl - Môi trƣờng LB đặc: môi trƣờng LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga - Môi trƣờng chứa chất cảm ứng IPTG: mơi trƣờng LB có bổ xung IPTG tới nồng độ cuối 1mM Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lao .3 1.1.1 Tình hình bệnh lao giới .3 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 1.1.3.Tình hình lao kháng thuốc 1.2 Vi khuẩn lao 11 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lao .11 1.2.2 Cấu tạo vi khuẩn lao 12 1.2.3 Cơ chế gây bệnh 13 1.3 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao .14 1.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán lao kháng thuốc 15 1.4.1 Các phƣơng pháp xác định kiểu hình 15 1.4.2 Các phƣơng pháp xác định kiểu gen 16 1.5 Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid 16 1.5.1 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 18 1.5.2 Gen katG với chế kháng thuốc isoniazid vi khuẩn lao 18 1.5.3 Gen inhA với chế kháng thuốc isoniazid vi khuẩn lao 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .20 2.2 Vật liệu, hóa chất dụng cụ nghiên cứu 21 2.2.1 Các sinh phẩm hóa chất 21 2.2.2 Máy thiết bị sử dụng nghiên cứu .22 2.2.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu 22 2.2.4 Vector tách dòng đƣợc sử dụng nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Kỹ thuật tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn lao .24 2.3.2.Kỹ thuật PCR - Nhân dòng đoạn gen katG gen inhA 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương 2.3.3 Tinh sản phẩm PCR kit hãng AccuPrep@ Gel purification kit - Bioneer .27 2.3.4 Kỹ thuật tách dòng gen (cloning) 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số .33 3.2 Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tổng số 33 3.3 Kết nhân dòng đoạn gen katG gen inhA .35 3.3.1 Kết nhân dòng đoạn gen inhA 35 3.3.2 Kết nhân dòng đoạn gen katG 35 3.4 Kết tinh sản phẩm PCR 36 3.5 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37 3.5.1 Phản ứng gắn gen cần nghiên cứu vào vector pBT 37 3.5.2 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α .38 3.5.3 Kết thực phản ứng PCR từ khuẩn lạc .39 3.5.4 Kết kiểm tra gen đích .41 3.6 Kết xác định trình tự phát đột biến gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 43 3.7 Kết xác định trình tự gen inhA với mẫu bệnh phẩm nghiên cứu kháng thuốc isoniazid .55 KẾT LUẬN .60 ĐỀ XUẤT 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT Bp CNSH CTCLQG DNA Base pairs Công nghệ sinh học Chƣơng trì nh chống lao quốc gia Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxyribonucleotide Triphosphate E.coli Escherichia coli EDR Exetensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng) EMB Ethambutol HRS Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin HRSE Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol INH Isoniazid IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb Kilo base LB Luria - Bertani MDR Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) PAS Paraminosalicylic acid PAZ Pyrazinamid PCR Polymerase Chain Reaction RMP Rifampicin RNA Ribonucleic Acid TAE Tris-Acetate-EDTA Taq-DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase TCYTTG X-gal Tổ chƣ́c y tế thế giới 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm kháng sinh đồ chủng vi khuẩn lao .20 Bảng 2.2 Các sinh phẩm hóa chất 21 Bảng 2.3 Bảng đặc điểm cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Kết đo OD mẫu nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Các vị trí xảy đột biến nucleotide đoạn gen katG chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 47 Bảng 3.3 Các vị trí xảy đột biến thay acid amin chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 51 Bảng 3.4 Vị trí đột biến xảy gen inhA chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .57 Bảng 3.5 Vị trí xảy đột biến thay acid amin chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sĩ Trịnh Quốc Phương DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn lao dƣới kính hiển vi với đặc tính nhuộm Ziehl - Neelsen 12 Hình 1.2 Cấu tạo thành tế bào M tuberculosis 12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo isoniazid 16 Hình 1.4 Cơ chế kháng thuốc isoniazid gen inhA 19 Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pBT 23 Hình 2.2 Sơ đồ phƣơng pháp nghiên cứu 24 Hình 2.3 Sơ đồ chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .27 Hình 3.1 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen inhA .35 Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen katG .36 Hình 3.3 Điện di sản phẩm tinh DNA 37 Hình 3.4 Kết biến nạp khuẩn lạc .39 Hình 3.5 (A) Kết Clony-PCR mẫu ĐA1 - ĐA15 với gen katG 40 Hình 3.5 (B) Kết Clony-PCR mẫu ĐO1-ĐO2-ĐO8-ĐO10-ĐO11ĐO12 với gen katG 40 Hình 3.6 (A) Điện di sản phẩm cắt plasmid dòng mẫu: ĐA1-ĐA3-ĐA4ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA1O: M thang chuẩn 1kb 41 Hình 3.6.(B) Điện di sản phẩm cắt plasmid dòng mẫu: ĐO8-ĐO9-ĐO11ĐO12-ĐA13-ĐA15: M thang chuẩn 1kb 42 Hình 3.7.(A) Điện di sản phẩm cắt plasmid dòng mẫu ĐA1-ĐA3-ĐA4ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA1O-ĐA11: M thang chuẩn 1kb 42 Hình 3.7.(B) Điện di sản phẩm cắt plasmid dòng mẫu ĐO8-ĐO9-ĐO12ĐA13-ĐA15: M thang chuẩn 1kb .43 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide chủng dại H37Rv 45 Hình 3.9 So sánh trình tự acid amin mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin chủng dại H37Rv 46 Hình 3.10 So sánh trì nh tƣ̣ nucleotide các mẫu bệnh phẩm với trì nh tƣ̣ nucleotide chủng dại H37Rv 56 Hình 3.11 So sánh trình tự acid amin mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin chủng dại H37Rv 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... TRỊNH QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VI? ??T NAM Chuyên... Quốc Phương Xuất phát từ lí trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid phương pháp xác định đột biến gen katG gen inhA từ chủng vi khuẩn lao phân lập Miền. .. đoạn gen katG gen inhA từ chủng vi khuẩn lao nghiên cứu - Tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli - Tách dòng gen katG gen inhA - Giải trình tự gen katG gen inhA - Phát hiện, phân