Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới ion S5XLTM trong giám định hài cốt lâu năm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hoàng Thị Thúy ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI ION S5XLTM TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT LÂU NĂM LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - tháng 10 năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hồng Thị Thúy ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI ION S5XL TM TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT LÂU NĂM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS Chu Hoàng Hà Hà Nội - tháng 10 năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết thể luận văn cơng trình nghiên cứu thực tế Toàn số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa đƣợc công bố công khai khác Học Viên Hoàng Thị Thúy LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hồng Hà – Viện trƣởng Viện Cơng nghệ Sinh học, hƣớng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn ThS Hoàng Hà giám đốc Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Minh Đức ThS Lê Thị Dung tập thể cán trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học, nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luân văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Ban đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè gia đình giúp đỡ chia sẻ, động viên suốt trình học tập nhƣ thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 10 năm 2020 Học Viên Hoàng Thị Thúy BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ ý nghĩa bp Base pair CR Control region D-loop Displacement Dloop mtADN mitochondrial DNA HV Hypervariable region PCR Polymerase chain reaction NGS Next-generation sequencing dNTP Deoxyribonucleotide triphosphat PGM Personal genome machine qPCR quantitative PCR STR Short tandem repeat SNP Single nucleotide polymorphism SDS Sodium dodecyl sulphate HA Hydroxyapatite MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU VÀ MÔ HỌC XƢƠNG 1.1.1 Thành phần cấu trúc xƣơng 1.1.2 Phân bố ADN xƣơng 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến cấu trúc tồn ADN hài cốt 1.1.4 Cơ sở khoa học phân tích ADN giám định nhận dạng cá thể 11 1.2 PHÂN TÍCH ADN TY THỂ TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ 13 1.2.1 Cấu trúc hệ gen ty thể 13 1.2.2 Vùng gen điều khiển CR (Control Region hay Displacement Dloop) 14 1.2.3 Cơ sở khoa học đánh giá tính đa hình vùng D-loop ngƣời 15 1.2.4 Đặc điểm trình tự ADN ty thể ứng dụng giám định 17 1.2.4.1 Trình tự tham chiếu rCRS 17 1.2.4.2 Sự biến đ i nucleotide 17 1.2.5 Ứng dụng phân tích ADN giám định nhận dạng cá thể 18 1.2.5.1 Trên giới 18 1.2.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 20 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ 21 1.3.1 Cơng nghệ giải trình tự Sanger 21 1.3.2 Cơng nghệ đọc trình tự hệ (NGS_Next Generation Sequencing) 22 1.3.3 Cơng nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion Ion Torrent 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 VẬT LIỆU 29 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.1.2 Địa điểm thời gian thực đề tài 30 2.1.3 Hóa chất 30 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.2.2 Quy trình thực 33 2.2.2.1 Xử lý vật lý hóa học mẫu hài cốt 34 2.2.2.2 Tách chiết thu ADN từ mẫu hài cốt 34 2.2.2.3 Định lƣợng ADN t ng số 35 2.2.3.4 Chuẩn bị thƣ viện ADN cho giải trình tự hệ 37 2.2.2.5 Tiến hành cài đặt chạy máy 40 2.2.2.6 Phân tích kết 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 TÁCH CHIẾT VÀ XÂY DỰNG NỒNG ĐỘ ADN BẰNG REALTIME PCR 42 3.1.1 Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ ADN realtime 42 3.1.2 Định lƣợng gADN mẫu tách chiết 43 3.2 NGHIÊN CỨU TẠO THƢ VIỆN 48 3.2.1 Khuếch đại thƣ viện 48 3.2.2 Loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu sản phẩm dƣ thừa từ thƣ viện 49 3.2.3 Gắn đầu nối tinh thƣ viện ADN 50 3.2.4 Định lƣợng thƣ viện ADN qPCR 52 3.3 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG HỆ THỐNG ION TORRENT S5 56 3.3.1 Giải trình tự thiết bị Ion Torrent S5 56 3.3.2 Kết phân tích vùng tƣơng đƣơng Hệ thống S5 trùng khớp với Sanger 59 3.3.3 Thông qua hệ thống S5 phát trình tự bị phân hủy 64 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 KẾT LUẬN 67 4.2 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bộ xƣơng ngƣời (nhìn từ phía trƣớc) Hình 1.2 Cấu trúc xƣơng ống Hình 1.3: Ba loại tế bào xƣơng Hình 1.4 Cấu trúc nucleotide (Encyclopaedia Britannica, 2015) 13 Hình 1.5 Bản đồ hệ gen ty thể ngƣời 14 Hình 1.6 Vùng D-loop ADN ty thể 15 Hình 1.7 Kết đọc trình tự so sánh trình tự thu đƣợc với rCRS 18 Hình 1.8 Phân tử ddNTP huỳnh quang Sanger Sequencing 21 Hình 1.9 Cơng nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion Ion Torrent 27 Hình 2.1 Sơ đồ mẫu đọc chip chip 29 Hình 2.2 Vị trí 14 cặp mồi dùng cho Pool Pool 30 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 33 Hình 2.4 Thiết bị Ion Chef 40 Hình 2.5 Hệ thống Ion Chef (trái) máy đọc trình tự Ion Torrent S5 (phải) 41 Hình 3.1: Đƣờng chuẩn nồng độ ADN đầu vào 43 Hình 3.2: Đồ thị đƣờng cong realtime trình khuếch đại ADN A: Chip 1, B: Chip 44 Hình 3.3 Biểu đồ kết định lƣợng nồng độ ADN đầu vào Chip 45 Hình 3.4 Biểu đồ kết định lƣợng nồng độ ADN đầu vào Chip 46 Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá nồng độ ADN đầu vào 47 Hình 3.6 Biểu đồ đánh giá nồng thƣ viện chip chip 54 Hình 3.7 Báo cáo trích xuất liệu từ máy Ion S5 chip 57 Hình 3.8 Báo cáo trích xuất liệu từ máy Ion S5 chip 58 Hình 3.9 Phần mềm Converge Analysis hãng Appliedbiosystems 60 Hình 3.10 Ví dụ kết giải trình tự vùng CR S5 HV1 Sanger mẫu hài cốt B11-H10-12 (A: Kết giải trình tự S5; B: kết giải trình tự Sanger) 61 Hình 3.11 Phần mềm Converge phát vùng/điểm bị phân hủy chất lƣợng mẫu hài cốt B11-H10-02 65 Hình 3.12 Ví dụ vị trí phát vùng/điểm bị phân hủy chất lƣợng thơng qua phần mềm phân tích Converge mẫu hài cốt B11-H10-02 66 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thống kê tỷ lệ đột biến hệ gen ty thể 16 Bảng 1.2 T ng hợp số cơng nghệ giải trình tự hệ 24 Bảng 2.1 Danh sách 14 cặp mồi dùng cho Pool Pool 31 Bảng 2.2: Danh sách loại Kit sử dụng chuẩn bị thƣ viện 32 Bảng 2.3: Nồng độ mẫu xây dựng đƣờng chuẩn: 35 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Realtime PCR 35 Bảng 2.5: Qui trình chuẩn bị thƣ viện thủ cơng 38 Bảng 2.6 Phƣơng pháp khuếch đại với loại mẫu khác 38 Bảng 3.1: Thành phần PCR khuếch đại đoạn geb để tạo thƣ viện 49 Bảng 3.2: Nồng độ pha loãng thƣ viện 52 Bảng 3.5 Nồng độ ADN 15 mẫu có nồng độ thấp sau làm giàu thƣ viện lần 55 Bảng 3.6 Bảng t ng hợp kết giải trình tự NGS chip chip 59 Bảng 3.7: Tiêu chí đánh giá chất lƣợng giải trình tự 62 Bảng 3.8: Phân loại đánh giá kết Sanger S5 63 Bảng 3.9: Bảng t ng hợp mẫu phát có vùng bị phân hủy thơng qua phƣơng pháp đọc trình tự Ion Torrent S5 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện giới có hàng triệu ngƣời tích chiến tranh, thiên tai, tai nạn máy bay… chƣa xác định đƣợc danh tính Riêng Việt Nam, dù chiến tranh kết thúc 40 năm, nhƣng hậu chiến tranh để lại vô nặng nề Theo số liệu Cục Ngƣời có cơng, Bộ Lao Động, Thƣơng binh Xã hội có 1,1 triệu liệt sĩ hy sinh có khoảng 500.000 hài cốt liệt sĩ chƣa đƣợc định danh, 300.000 hài cốt đƣợc quy tập an táng nghĩa trang liệt sĩ khoảng 200.000 hài cốt chƣa đƣợc quy tập nghĩa trang liệt sĩ mà nằm rải rác tỉnh phía Nam, Lào Campuchia [1][2] Thông thƣờng, hệ gen nhân cho phép định danh xác đến cá thể thơng qua đoạn lặp từ 2-6 nucleotide STR (Short Tandem Repeat) locus khác nhiễm sắc thể Tuy nhiên, mẫu hài cốt lâu năm, phần mô, xƣơng bị phân hủy mạnh ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ, UV, pH, thành phần vô hệ vi sinh vật), dẫn đến toàn ADN hệ gen nhân gần nhƣ bị phân hủy hồn tồn khơng có khả phân tích Chính vậy, nay, việc giám định hài cốt liệt sĩ hoàn toàn dựa vào phân tích ADN ty thể (Mitochondiral DNA mtADN), cấu trúc dạng vòng giúp loại ADN bền dƣới tác động môi trƣờng [3] Việc xác định danh tính dựa việc so sánh nucleotide vùng siêu biến (HV1, HV2 HV3) thuộc hệ gen ty thể hài cốt với thân nhân Phƣơng pháp giải trình tự ADN ty thể dùng giám định đƣợc sử dụng ph biến Việt Nam nay, nhƣ số phịng thí nghiệm giới dựa nguyên lý Sanger Ƣu điểm phƣơng pháp dễ thực hiện, giá thành rẻ Tuy nhiên, giải trình tự Sanger đọc đƣợc mẫu, độ lặp lại thấp, chất lƣợng tín hiệu khơng n định nên gây nhiều khó khăn cho việc phân tích điểm Heteroplasmies Poly-Cytosine Hơn nữa, nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng giải trình tự phƣơng pháp Sanger tƣơng đối cao (~10 ng/µl) [4] Do đó, nhằm nâng cao suất, độ xác nhƣ tận dụng đƣợc ƣu vƣợt trội hệ thống đọc trình tự hệ (NGS) công 64 3.3.3 Thông qua hệ thống S5 phát trình tự bị phân hủy Đối với mẫu thân nhân mẫu lab member hệ thống S5 thu đƣợc tín hiệu tốt Đáng ngạc nhiên tƣợng mẫu phân hủy đƣợc quan sát thấy rõ mẫu hài cốt lâu năm nhờ viêc đọc tín hiệu tần suất gọi nu Điều thể rõ Hình 3.11 Hình 3.12 Với đoạn ADN bị phân hủy mạnh, tần suất để xác định đƣợc nu mức độ thấp (frequency 10-20% có màu đỏ, hệ thống phân tích báo tình trạng xác định nu mức “Likely” “fail” “unclear)) nu bình thƣờng cho tín hiệu tốt đạbị phân hủy mạnh, tần suất để 7) Ngoài ra, hệ thống phần mềm đồng thời so sánh với database khác EMPOP nhằm đƣa độ xác cao Điều hạn chế lớn giải trình tự Sanger Đối với mẫu hài cốt lâu năm, trình khử amin dƣờng nhƣ diễn bên ADN Quá trình chuyển đ i adenine (A) thành hypoxanthine, sau liên kết với cytosine (C) thay liên kết với thymine (T); guanine (G) đƣợc chuyển thành xanthine, tiếp tục bắt cặp với C, dẫn đến bắt cặp sai vị trí phân hủy Hoặc ảnh hƣởng điều kiện vật lý, hóa sinh làm phân liên kết sinh học chuỗi ADN Những biến thể đƣợc phần mềm Converge xác định dạng thối biến (ví dụ nhƣ Y =C/T hay R = G/A) Thơng qua giải trình tự S5, ngƣời thực biết đƣợc mức độ phân hủy mẫu, hiểu đƣợc lý trình amplified giải trình tự Sanger dù thực nhiều lần nhƣng khó thành cơng 65 Hình 3.11 Phần mềm Converge phát vùng/điểm bị phân hủy chất lượng mẫu hài cốt B11-H10-02 66 Hình 3.12 Ví dụ vị trí phát vùng/điểm bị phân hủy chất lượng thông qua phần mềm phân tích Converge mẫu hài cốt B11-H10-02 Bảng 3.9: Bảng t ng hợp mẫu phát có vùng bị phân hủy thơng qua phương pháp đọc trình tự Ion Torrent S5 Chip Mẫu Vùng phân tích thành cơng (Sanger) 27 40 15 33 Kết Sanger Ion Torrent S5 16024-16365 Tốt HV1, HV3 degraded 16024-16365 Tốt HV2, HV3 degraded Tốt HV2, HV2 degraded 16024-16365; 73340 16047-16193; 16210-16365 16038-16193; 16210-16365 Tốt Tốt HV1/ around C tract degraded HV1/ around C tract degraded 67 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Ứng dụng đƣợc phƣơng pháp giải trình tự hệ hệ thống Ion torrent S5 Ion Chef việc giải trình tự vùng D-loop hệ gen Ty thể Chúng tơi thực giải trình tự với mẫu than nhân, mẫu lab member 83 mẫu hài cốt Bƣớc đầu phân tích đƣợc kết giải trình tự thơng qua phần mềm Converge: 34 mẫu cho kết tốt, 27 mẫu trung bình 35 mẫu cho kết xấu trùng khớp với chất lƣợng ADN đầu vào Cho thấy đƣợc ƣu điểm vƣợt trội so với hệ thống giải trình tự cũ Sanger: thu đƣợc tồn tín hiệu (tốt, xấu) với thơng số xác (tần xuất) độ tin cậy cao (có so sánh qua EMPOP) thể rõ vùng có bị phân hủy, vị trí bị phân hủy 4.2 KIẾN NGHỊ Với kết thu đƣợc sau tối ƣu phƣơng pháp giải trình tự NGS để phân tích mẫu hài cốt lâu năm áp dụng thành công 83 mẫu hài cốt, đề xuất số điểm nhƣ sau: 1.Tiến hành nghiên cứu phân tích sâu, tận dụng liệu có sẵn mà phần mềm Converge cung cấp Xây dựng lại tiêu chí đánh giá, đặt lại thƣớc đo cho xác định chất lƣợng mẫu trình chạy giải trình tự Mở rộng số lƣợng mẫu số lần lặp lại thí nghiệm Tiếp tục tối ƣu quy trình để tạo thƣ viện có số lƣợng mẫu lớn, đáp ứng cho việc tạo liệu ngƣời Việt phục vụ cho nghiên cứu giám định tƣơng lai 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vietnam Ministry of Labour, War Invalids and Social Affairs, “Database of Fallen Soldier‟s Graves.” http://www.molisa.gov.vn/Pages/tintuc/chitiet.aspx?tintucID=28329 [2] Z Obermeyer, C J L Murray, Adn E Gakidou, “Fifty years of violent war deaths from Vietnam to Bosnia: Analysis of data from world health survey programme,” Bmj, vol 336, no 7659, pp 1482–1486, 2008, doi: 10.1136/bmj.a137 [3] C M Parsons TJ, “Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome.,” p 2001 Jun [4] A Alonso et al., “Specific quantification of human genomes from low copy number DNA samples in forensic Adn ancient DNA studies,” Croat Med J., vol 44, no 3, pp 273–280, 2003 [5] C Børsting, S L Fordyce, J Olofsson, H S Mogensen, adn N Morling, “Evaluation of the Ion TorrentTM HID SNP 169-plex: A SNP typing assay developed for human identification by second generation sequencing,” Forensic Sci Int Genet., vol 12, pp 144–154, 2014, doi: 10.1016/j.fsigen.2014.06.004 [6] GS Đỗ Xuân Hợp, Giải phẫu đại cương đầu mặt c 1971 [7] I Professor of Anatomy, Indiana University, Human skeleton [8] C Practice, “Skeletal system 1: the anatomy ADN physiology of bones,” vol 116(2), no 2, pp 38–42, 2020 [9] R Bartl, C Bartl, R Bartl, adn C Bartl, “Structure adn Architecture of Bone,” Bone Disord., pp 11–20, 2017, doi: 10.1007/978-3319-29182-6_2 [10] G Tortora ADN B Derrickson, “The skeletal system: Bone tissue,” Princ Anat Physiol., pp 171–193, 2014 [11] J W AGNA, H C KNOWLES, ADN G ALVERSON, “The 69 mineral content of normal human bone.,” J Clin Invest., vol 37, no 10, pp 1357–1361, 1958, doi: 10.1172/JCI103725 [12] W D Armstrong ADN L Singer, “Composition ADN constitution of the mineral phase of bone.,” Clin Orthop Relat Res., vol 38, pp 179– 190, 1965, doi: 10.1097/00003086-196500380-00025 [13] N Lynnerup ADN C Villa, “Age estimation of skeletal remains: principal methods,” Res Reports Forensic Med Sci., p 3, 2014, doi: 10.2147/rrfms.s35660 [14] L C Palmer, C J Newcomb, S R Kaltz, E D Spoerke, adn S I Stupp, “Biomimetic systems for hydroxyapatite mineralization inspired by bone ADN enamel,” Chem Rev., vol 108, no 11, pp 4754–4783, 2008, doi: 10.1021/cr8004422 [15] E S M Iwamura, J A Soares-Vieira, and D R Muñoz, “Human identification ADN analysis of DNA in bones.,” Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo., vol 59, no 6, pp 383–388, 2004, doi: 10.1590/S004187812004000600012 [16] D Corach et al., “Additional approaches to DNA typing of skeletal remains: The search for „missing‟ persons killed during the last dictatorship in Argentina,” Electrophoresis, vol 18, no 9, pp 1608–1612, 1997, doi: 10.1002/elps.1150180921 [17] SHIGEYUKI KITAMURA KAZUMI SUGIHARA MIE KUWASAKO KIYOSHI TATSUMI, “The Role of Mammalian Intestinal Bacteria in the Reductive Metabolism of Zonisamide,” 2011 [18] E Cunha et al., “The problem of aging human remains ADN living individuals: A review,” Forensic Sci Int., vol 193, no 1–3, pp 1–13, 2009, doi: 10.1016/j.forsciint.2009.09.008 [19] P F Campos, O E Craig, G Turner-Walker, E Peacock, E Willerslev, adn M T P Gilbert, “DNA in ancient bone - Where is it located ADN how should we extract it?,” Ann Anat., vol 194, no 1, pp 7–16, 2012, doi: 10.1016/j.aanat.2011.07.003 70 [20]R D G Alex H Taylor, Rachael Miller, “New Caledonian crows reason about hidden causal agents,” 2012 [21]N Nissanka ADN C T Moraes, “Mitochondrial DNA damage ADN reactive oxygen species in neurodegenerative disease,” FEBS Lett., vol 592, no 5, pp 728–742, 2018, doi: 10.1002/1873-3468.12956 [22]L M Fondevila M, Phillips C, Naverán N, Cerezo M, Rodríguez A, Calvo R, Fernández LM, Carracedo Á, “Challenging DNA: Assessment of a range of genotyping approaches for highly degraded forensic samples,” pp 26–28, 2008 [23]G P Thomas M, “Postmortem Damage of Mitochondrial DNANo Title,” Forensic Sci Int Genet, pp 257–264, 2018 [24]R S Meindl and C O Lovejoy, “Ectocranial suture closure: A revised method for the determination of skeletal age at death based on the lateral‐anterior sutures,” Am J Phys Anthropol., vol 68, no 1, pp 57–66, 1985, doi: 10.1002/ajpa.1330680106 [25]S Sudhir Ambekar, “DNA: Damage ADN Repair Mechanisms in Humans,” Glob J Pharm Pharm Sci., vol 3, no 3, 2017, doi: 10.19080/gjpps.2017.03.555613 [26]D Franklin, “Forensic age estimation in human skeletal remains: Current concepts ADN future directions,” Leg Med., vol 12, no 1, pp 1–7, 2010, doi: 10.1016/j.legalmed.2009.09.001 [27]A C Drohat adn A Maiti, “Mechanisms for enzymatic cleavage of the N-glycosidic bond in DNA,” Org Biomol Chem., vol 12, no 42, pp 8367–8378, 2014, doi: 10.1039/c4ob01063a [28]S R Tridico, S Koch, A Michaud, G Thomson, K Paul Kirkbride, ADN M Bunce, “Interpreting biological degradative processes acting on mammalian hair in the living ADN the dead: Which ones are taphonomic?,” Proc R Soc B Biol Sci., vol 281, no 1796, 2014, doi: 10.1098/rspb.2014.1755 71 [29] A W Briggs et al., “Targeted retrieval ADN analysis of five neADNertal mtDNA genomes,” Science (80- )., vol 325, no 5938, pp 318– 321, 2009, doi: 10.1126/science.1174462 [30] Nông Văn Hải, Một số kết nghiên cứu gen hệ gen người Việt Nam 2019 [31]E Murphy, “Forensic DNA Typing,” Annu Rev Criminol., 2017 [32]C Ginther et al., “Genetic variation among the Mapuche Indians from the Patagonian region of Argentina: mitochondrial DNA sequence variation ADN allele frequencies of several nuclear genes.,” EXS, vol 67, pp 211–219, 1993, doi: 10.1007/978-3-0348-8583-6_17 [33]M Eduardoff, C Xavier, C Strobl, A Casas-Vargas, ADN W Parson, “Optimized mtDNA control region primer extension capture analysis for forensically relevant samples ADN highly compromised mtDNA of different age ADN origin,” Genes (Basel)., vol 8, no 10, 2017, doi: 10.3390/genes8100237 [34]T D Cottrell DA, “Mitochondria ADN ageing,” Curr Opin Clin Nutr Metab Care, pp 473–478, 2000 [35]K Sekiguchi et al., “Mitochondrial DNA population data of HV1 ADN HV2 sequences from Japanese individuals,” Leg Med., vol 10, no 5, pp 284–286, 2008, doi: 10.1016/j.legalmed.2008.02.002 [36]W Thompson, S Ford, T Doom, M Raymer, ADN D E Krane, “Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defense review,” The Champion, vol XXVII, no 2, pp 16–25, 2003, [Online] Available: http://www.nacdl.org/public.nsf/698c98dd101a846085256eb400500c01/c1d6 3d2bd1a582cf85256e540074c146?OpenDocument%7B&%7DHighlight=0,ra ymer [37]M VADNewoestyne ADN D Deforce, “Laser capture microdissection in forensic research: A review,” Int J Legal Med., vol 124, no 6, pp 513–521, 2010, doi: 10.1007/s00414-010-0499-4 72 [38]PGS.TS Nguyễn Trọng Toàn, “nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ADN việc giám định hài cốt liệt sĩ,” 2006 [39]H Minh, “Bàn giao 669 kết giám định ADN liệt sĩ.” https://vnexpress.net/ban-giao-669-ket-qua-giam-dinh-adn-liet-si4136656.html (accessed Oct 22, 2020) [40]F Sanger, S Nicklen, ADN A R Coulson, “DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.,” Proc Natl Acad Sci U S A., vol 74, no 12, pp 5463–5467, 1977, doi: 10.1073/pnas.74.12.5463 [41]B Quintáns, V Álvarez-Iglesias, A Salas, C Phillips, M V Lareu, ADN A Carracedo, “Typing of mitochondrial DNA coding region SNPs of forensic ADN anthropological interest using SNaPshot minisequencing,” Forensic Sci Int., vol 140, no 2–3, pp 251–257, 2004, doi: 10.1016/j.forsciint.2003.12.005 [42]W Parson et al., “Identification of West Eurasian mitochondrial haplogroups by mtDNA SNP screening: Results of the 2006-2007 EDNAP collaborative exercise,” Forensic Sci Int Genet., vol 2, no 1, pp 61–68, 2008, doi: 10.1016/j.fsigen.2007.08.007 [43]H D Lamlertthon W, Hayward MC, “Emerging technologies for improved stratification of cancer patients: a review of opportunities, challenges, ADN tools.,” Cancer, 2011 [44]M Margulies et al., “Genome sequencing in microfabricated highdensity picolitre reactors,” Nature, vol 437, no 7057, pp 376–380, 2005, doi: 10.1038/nature03959 [45]H P J Buermans ADN J T den Dunnen, “Next generation sequencing technology: Advances ADN applications,” Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis., vol 1842, no 10, pp 1932–1941, 2014, doi: 10.1016/j.bbadis.2014.06.015 [46]B Clinton, “President Clinton announces the completion of the first survey of the entire human genome,” 2000 73 [47]NIH, “International Consortium Announces the 1000 Genomes Project,” NIH News Releases, 2008 https://www.nih.gov/news-events/newsreleases/international-consortium-announces-1000-genomes-project [48]“Internation Human Epigenome Consortium (IHEC),” 2010 [49]S Goodwin, J D McPherson, ADN W R McCombie, “Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies,” Nat Rev Genet., vol 17, no 6, pp 333–351, 2016, doi: 10.1038/nrg.2016.49 [50]D Ballard, J Winkler-Galicki, ADN J Wesoły, “Massive parallel sequencing in forensics: advantages, issues, technicalities, ADN prospects,” Int J Legal Med., vol 134, no 4, pp 1291–1303, 2020, doi: 10.1007/s00414-020-02294-0 [51]E L Van Dijk, Y Jaszczyszyn, ADN C Thermes, “Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias,” Exp Cell Res., vol 322, no 1, pp 12–20, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.01.008 [52]W Parson et al., “Reprint of: Evaluation of next generation mtGenome sequencing using the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM),” Forensic Sci Int Genet., vol 7, no 6, pp 632–639, 2013, doi: 10.1016/j.fsigen.2013.09.007 [53]M Yuan et al., “Genome sequence ADN transcriptome analysis of the radioresistant bacterium deinococcus gobiensis: Insights into the extreme environmental adaptations,” PLoS One, vol 7, no 3, 2012, doi: 10.1371/journal.pone.0034458 [54]A Baez-Ortega et al., “IonGAP: Integrative bacterial genome analysis for Ion Torrent sequence data,” Bioinformatics, vol 31, no 17, pp 2870–2873, 2015, doi: 10.1093/bioinformatics/btv283 [55]Z Xue, M E Kable, ADN M L Marco, “Impact of DNA Sequencing ADN Analysis Methods on 16S rRNA Gene Bacterial Community Analysis of Dairy Products,” mSphere, vol 3, no 5, 2018, doi: 10.1128/msphere.00410-18 74 [56]M Fujimoto et al., “Application of ion torrent sequencing to the assessment of the effect of alkali ballast water treatment on microbial community diversity,” PLoS One, vol 9, no 9, 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0107534 [57]M Chen et al., “Loss-of-function variants in FSIP1 identified by targeted sequencing are associated with one particular subtype of mucosal melanoma,” Gene, vol 759, 2020, doi: 10.1016/j.gene.2020.144964 [58]Y P Hsiao, C Te Lu, J Chang-Chien, W R Chao, ADN J J Yang, “Advances ADN applications of Ion torrent personal Genome Machine in cutaneous squamous cell carcinoma reveal novel gene mutations,” Materials (Basel)., vol 9, no 6, 2016, doi: 10.3390/ma9060464 [59]L Liu et al., “Comparison of next-generation sequencing systems,” J Biomed Biotechnol., vol 2012, 2012, doi: 10.1155/2012/251364 [60]I C Kit, I C Kit, ADN I C Kit, “Precision ID mtDNA Panels with the HID Ion for use with : Precision ID mtDNA Whole Genome Panel Precision ID mtDNA Control Region Panel for use with :” [61]“https://www.mitomap.org/MITOMAP.” 75 PHỤ LỤC Danh sách mẫu đọc trình tự chip 76 77 Danh sách mẫu đọc trình tự chip 78 ... chất Precision ID mtADN Control Region Panel (Thermofisher Scientific) Quantification Kit Precision ID Library Kit Precision ID Ioncode 1-96 giếng Trang thiết bị Ion Chip 520 Precision ID Ioncode... hệ (NGS) công tác giám định hài cốt liệt sĩ Việt Nam, thực đề tài “Ứng dụng cơng nghệ giải trình tự Ion Torrent S5XLTM việc giám định hài cốt lâu năm? ?? Nghiên cứu sử dụng kit Precision ID mtADN... khoảng 40 năm gần Công nghệ lần đƣợc thƣơng mại hóa Hệ sinh học ứng dụng vào năm 1986 (Adams, 2008) Ngày nay, công ty thƣơng mại cho đời hệ máy đọc trình tự dựa nhiều công nghệ (Next Generation Sequencing