1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ
1.3.3. Công nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion bằng Ion Torrent
Công nghệ này đƣợc cấp phép từ ADN Electronics Ltd và đƣợc phát triển bởi Ion Torrent Systerms Inc và ra đời năm 2010.
Đọc trình tự bán dẫn ion (Ion semiconductor sequencing) là phương pháp đọc trình tự ADN trên cơ sở phát hiện ion hydro đƣợc giải phóng trong quá trình polyme hóa của ADN, còn đƣợc gọi là đọc trình tự giải phóng ion (ion torrent sequencing), đọc trình tự thông qua pH (pH-mediated sequencing), đọc trình tự silicon (silicon sequencing). Ứng dụng chính của công nghệ này gồm: Đọc lại các trình tự của các mẫu có nhiều chỉ thị barcode; đọc trình tự các thƣ viện đã đƣợc gắn adapter (vùng 100 kb-1Mb);
đọc trình tự genome của vi khuẩn và virus; đọc trình tự các mẫu metagenomic; đọc trình tự các RNA ngắn; Giá trị số liệu trình tự thu trên các máy khác nhau.
Nguyên lý của công nghệ: Khác với các công nghệ đọc trình tự khác,
công nghệ đọc trình tự ion torrent sử dụng nucleotide không bị biến đ i hoặc không sử dụng các mắt đọc. Trong hệ thống đọc trình tự, mỗi giếng chứa một sợi ADN khuôn và đƣợc đƣa vào một loại dNTP. Nếu loại dNTP này b sung với nucleotide trên sợi khuôn thì nó sẽ liên kết và kéo dài sợi t ng hợp. Điều này dẫn tới sự giải phóng một ion hydro, tạo thành một cảm ứng ion ISFET (ion-sensitive field-effect transistor) và xác định một phản ứng đã xảy ra. Nếu trình tự sợi khuôn có sự lặp lại của một loại nucleotide, thì sẽ có nhiều phân tử dNTP kết hợp trong cùng một chu kỳ, dẫn tới số phân tử hydro tương ứng đƣợc giải phóng và tín hiệu điện tử tăng lên một cách tỷ lệ thuận.
Quy trình công nghệ: Mỗi giếng trên chip bán dẫn có chứa một phân tử ADN khuôn sợi đơn, một ADN polymerase được nhũ tương hóa với mỗi loại dNTP A, C, G hoặc T (Rusk, 2011; Pennisi, 2010; Perkel, 2011). Nếu một dNTP đƣa vào b sung với nucleotide trên sợi khuôn thì nó liên kết vào sợi ADN t ng hợp bằng ADN polymerase và có phản ứng hóa học xảy ra. Ion hydro giải phóng làm thay đ i pH của dung dịch và nó đƣợc phát hiện bởi ISFET. Những dNTP không được t ng hợp, được rửa sạch trước khi một chu kỳ mới với một loại dNTP khác đƣợc đƣa vào (Pennisi, 2010).
Dưới các giếng là một lớp nhạy cảm với ion, tiếp theo là một lớp cảm ứng ion ISFET. Tất cả các lớp đƣợc chứa trong một chip bán dẫn CMOS, giống với các chip đang đƣợc sử dụng trong công nghiệp điện tử. Mỗi chip chứa một dãy giếng với một máy phát hiện ISFET đƣợc cảm ứng bằng ion hydro giải phóng. Một loạt tín hiệu điện tử đƣợc truyền dẫn từ chip tới máy tính và đƣợc dịch thành một trình tự ADN không cần qua một tác nhân trung gian. Hiện tƣợng liên kết nucleotide đƣợc đo trực tiếp bằng điện tử, không dùng nucleotide biến đ i và đo đạc bằng quang học (Davies, 2010; Pennisi, 2010).
Hình 1.9. Công nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion bằng Ion Torrent [50]
Ƣu nhƣợc điểm của máy Ion Torrent: độ chính xác của máy đọc trình tự bán dẫn ion năm 2011 là 99,6% trên 50 base đƣợc đọc với 100 Mb /lần
chạy với chiều dài đọc đƣợc là 100 cặp base. Độ chính xác cho các đoạn lặp lại là 98%. Ƣu điểm chính của đọc trình tự bán dẫn ion là: tốc độ đọc nhanh; chi phí vận hành và đầu tƣ thấp [51]; không dùng nucleotide biến đ i và xác định bằng quang học. Vì hệ thống ghi lại hiện tƣợng liên kết nucleotide tự nhiên nên đọc trình tự trong một thời gian thực. Tốc độ đọc trình tự chỉ bị giới hạn bởi vòng quay nucleotides trong hệ thống Ion Torrent Systems Inc; mỗi liên kết đọc mất 4 giây và mỗi lần chạy khoảng 1 giờ đọc đƣợc 100-200 bp [52].
Nếu chip đƣợc nâng cấp thì số lần đọc sẽ đƣợc tăng lên. Tuy nhiên, có hạn chế vì rất khó để xác định một đoạn lặp lại. Tín hiệu đƣợc tạo ra từ số lặp lại cao sẽ là khó khăn để phân biệt đƣợc từ sự lặp lại của một số khác nhau nhưng tương tự. Ví dụ: lặp lại của đoạn 7 khó phân biệt với đoạn 8. Hạn chế khác của hệ thống này là chiều dài đọc ngắn hơn các phương pháp khác như Sanger sequencing hoặc Illumina. Chiều dài đọc đƣợc là một lợi thế cho quá trình lắp ráp genome de novo, với Ion Torrent Systems có thể đọc đƣợc 400 cặp base cho một lần chạy [51]. Chính vì vậy, việc lựa chọn thế hệ máy đọc Ion Torrent sẽ là sự lựa chọn phù hợp cho việc giải trình tự hệ gen các cơ thể sinh vật với điều kiện của các viện nghiên cứu của Việt Nam hiện nay.
Đối với máy đọc trình tự bán dẫn ion, với ƣu điểm là đọc trình tự nhanh, liên tục và kinh tế, máy có thể sử dụng trong đa số phòng thí nghiệm lớn và nhỏ nhƣ một máy để bàn [49] hoặc ở ngoài các trung tâm đặc trƣng, trong các bệnh viện. Công nghệ này phù hợp trong các ứng dụng nhỏ nhƣ đọc trình tự của hệ gen của vi khuẩn, đọc trình tự transcriptome vi khuẩn, đọc trình tự gen đích amplicon, hoặc kiểm tra chất lƣợng của thƣ viện trình tự [53] [54].
Từ khi ra đời tới nay công nghệ đọc trình tự bán dẫn ion đã đƣợc ứng dụng trong nhiều công trình nghiên cứu, nhƣ: dựa trên đọc trình tự ADN của rRNA để định danh vi khuẩn hay vi nấm [55]; đọc trình tự hệ gen vi sinh vật [56]; nghiên cứu đột biến, chức năng của gen đích [57][58], nghiên cứu y sinh [45], các nghiên cứu cũng đƣa ra đƣợc ƣu nhƣợc điểm của công nghệ [59].