Nghiên cứu nhân giống cây gấc momordica cochinchinensis bằng phương pháp nuôi cấy mô

đại học thái nguyên TRNG I HC KHOA HC LÊ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY GẤC (MOMORDICA COCHINCHINENSIS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học PGS TS Ngơ Xn Bình Thái Ngun - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục đồ thị M U CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………….… … TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC…………………………………… … 1.1 Giới thiệu chung Gấc…………………………………………… 1.2 Nguồn gốc, phân loại đặc điểm thực vật học gấc……… … 1.2.1 Phân bố gieo trồng…………………………………………5 1.2.2 Đặc điểm thực vật học ………………………………………… 1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển……………………………… 1.2.4 Công dụng Gấc………………………………………9 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM VỀ CÂY GẤC………………………………………………………………….10 2.1 Tình hình nghiên cứu mặt dược lý Gấc……………… … 10 2.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Gấc phương pháp ni cấy mơ………………………………………………………………… 13 KHÁI QT VỀ NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT………… 13 3.1 Khái niệm ni cấy mô tế bào thực vật………… …………………… 13 3.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật………… ………………14 3.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật……… 16 3.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật………………… 17 3.5 Các công đoạn nuôi mô tế bào……………………………… 25 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 28 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu…………… ………… 28 1.1 Đối tượng nghiên cứu………………………… ……………………28 1.2 Thời gian nghiên cứu…………………………… …… … …… … 28 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu……………… …………… … 28 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1 Nội dung nghiên cứu…………………………………… … … …… 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu…………………… …………………… …28 2.3 Xử lý số liệu………………………………………………………….… 35 2.4 Điều kiện thí nghiệm…………………………………… …………….36 2.4.1 Thí nghiệm in vitro…………………………………… ……36 2.4.2 Thí nghiệm thích ứng in vitro ngồi điều kiện tự nhiên… 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… 37 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng hóa chất thời gian khử trùng đến tỉ lệ sống mẫu Gấc…………………… ……………… … 37 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng H2O2 đến tỷ lệ sống mẫu Gấc 37 3.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 đến tỷ lệ sống mẫu Gấc ………………………………………………………… 38 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi Gấc………………………….… 41 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Gấc…… ………….……… …………………….…… 41 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Gấc……………………………………….………… 42 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Gấc… ………… ……… 43 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến hiệu nhân chồi… 44 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến hiệu nhân chồi…………………………………………………………………… 45 3.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP Kinetin đến hiệu nhân chồi……….… ………………………… 47 3.3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP nước dừa đến hiệu nhân chồi…………………………….…… 48 3.3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi…………………………….……… 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến khả rễ chồi Gấc……………………….……………51 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến hiệu rễ…… 51 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hiệu rễ…53 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống vƣờn ƣơm…………………….……………………………54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………….… 56 KẾT LUẬN……………………………………………….………… 56 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Bảng 3.1 Tên các bảng luận văn Ảnh hưởng nồng độ H2O2 thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu gấc (Sau 15 ngày nuôi cấy)) Trang 37 Ảnh hưởng nồng độ HgCl2 thời gian khử trùng Bảng 3.2 đến tỷ lệ sống mẫu gấc (Sau 15 ngày nuôi cấy) 38 Bảng 3.3 So sánh kết nghiên cứu khử trùng loại hoá chất (Oxy già HgCl2) 40 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến khả tái sinh chồi gấc 41 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi gấc 42 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kinetin đến hiệu nhân chồi 44 Bảng 3.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến hiệu nhân chồi 45 Bảng 3.8 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP kinetin đến hiệu nhân chồi gấc 46 Bảng 3.9 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP nước dừa đến hiệu nhân chồi gấc 48 Bảng 3.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi gấc 50 Bảng 3.11 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến hiệu rễ 51 Bảng 3.12 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hiệu rễ 52 Bảng 3.13 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình Tên các Hình luận văn Trang Hình 3.1 Ảnh hưởng chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống mẫu gấc 38 Hình 3.2 Ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 đến tỷ lệ sống mẫu gấc 39 Hình 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến khả tái sinh chồi gấc 41 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi gấc 42 Hình 3.5 Ảnh hưởng kinetin đến hiệu nhân chồi gấc 44 Hình 3.6 Ảnh hưởng BAP đến hiệu nhân chồi gấc 46 Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP Kinetin đến hiệu nhân chồi gấc 47 Hình 3.8 Ảnh hưởng kết hợp BAP nước dừa đến hiệu nhân chồi gấc 49 Hình 3.9 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi gấc 50 Hình 3.10 Ảnh hưởng IBA đến hiệu rễ gấc 52 Hình 3.11 Ảnh hưởng NAA đến hiệu rễ gấc 53 Hình 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CT Công thức ĐTST Điều tiết sinh trưởng Kinetin furfurylaminopurine MS Murashinge and Skoog, 1962 NAA Naphlene acetic acid TN Thí nghiệm IBA Indole – – butyric acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Gấc có tên khoa học Momordica cochinchinensis thuộc Vioales, họ bầu bí (Cucurbitaceae) [8] Trong gấc có chứa lycopen β-caroten với hàm lượng cao gấp nhiều lần thực phẩm sử dụng phổ biến giới Quả gấc hạt gấc chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị, đặc biệt hạt gấc dùng nhiều thuốc dân tộc để chữa bệnh [5, 6, 8] Ngoài ra, nghiên cứu gần cho thấy dầu gấc có khả sửa chữa sai lệch DNA bị chiếu tia tử ngoại [9], có tác dụng chống phóng xạ sở để sử dụng dầu gấc việc điều trị bệnh ung thư [5] Về mặt dinh dưỡng, tác giả Vương Thuý Lệ chứng minh rằng, gấc có hàm lượng β-carotene cao loại trái với hàm lượng 35,5mg/100g thịt trái [20] Hàm lượng lycopene gấc cao gấp 76 lần khoai tây [18] Vương Thuý Lệ cs (2002) khảo sát thực nghiệm tác dụng β-carotene gấc đến trẻ em (ở miền Bắc Việt Nam) cho thấy, lượng hồng cầu, β-carotene, vitamin A máu nhóm ăn xơi gấc tăng lên rõ rệt so với hai nhóm ăn dầu gấc β-carotene tổng hợp [19] Aoki cs (2002) nghiên cứu chất màu có gấc Gấc chứa β-carotene, lycopene, zeaxanthin, β-cryptoxanthin Trong hàm lượng lycopene đạt 380µg/g thịt trái [14] Ishida cs (2004) nghiên cứu thành phần acid béo carotenoid gấc cho thấy, thịt gấc chứa 22% acid béo gồm có 32% oleic acid, 29% palmitic acid 28% linoleic acid [18] Về mặt dược học, có nhiều nghiên cứu khả khắc phục hậu chất độc màu da cam phòng chữa ung thư gan β-carotene có gấc Thời gian gần , gấc bắt đầu tiếp thị khu vực châu Á với nhiều dạng sản phẩm nước ép, dầu gấc Từ năm 2002, Việt Nam sản phẩm dầ u Gấc (VINAGA) được bán nhiều thị trường và nước Nhu cầu ngày c àng tăng sản phẩm g ấc làm nguyên liệu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chế biến ở mức công nghiệp đã hì nh thành các vùng sản xuất nguyên liệu tại nhiều tỉ nh khu vực phía Bắc phía Nam Việt Nam Ở Việt Nam gấc trồng rải rác khắp nơi, tập trung nhiều vùng phía Bắc Gấc trồng hạt hay giâm cành cho hệ số nhân giống không cao [8] Mặt khác, gấc lo ại đơn tính khác gốc, mọc từ hạt sẽ phân hóa thành đực và cái ri êng biệt Việc trồng gấc phương pháp gieo hạt truyền thống làm giảm hiệu sản xuất , tốn kém về cơng sức và chi ph í khơng thể phân biệt được đặc điểm giới tính giai đoạn đầu trước hoa Vì vậy, để phát triển vùng nguyên liệu sản xuất gấc, cần thiết phải tiến hành các kỹ thuật nhân giớng vơ tính từ có suất chất lượng ổn định Phương pháp chứng tỏ phương pháp có ý nghĩa quan trọng cho công tác giống trồng, mang lại hiệu kinh tế cao Xuất phát từ tính cấp thiết đề tài, tiến hành: “Nghiên cứu nhân giống gấc (Momordica cochinchinensis) phương pháp nuôi cấy mơ” Mục đích nghiên cứu nội dung nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Xây dựng thành cơng quy trình nhân giống gấc có suất cao phương pháp ni cấy mơ Nhờ đó, người ta nhân lên hàng vạn giữ nguyên tính trạng di truyền mẹ Đồng thời, nghiên cứu nuôi cấy mô đặt sở cho nghiên cứu chọn giống gấc có ưu lai cao Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng hoá chất khử trùng đến tỉ lệ sống mẫu gấc; Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn  Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả tái sinh chồi gấc;  Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi gấc;  Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả rễ chồi gấc;  Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển in vitro vườn ươm Ý nghĩa đề tài: - Ý nghĩa khoa học  Kết nghiên cứu đưa số kỹ thuật vi nhân giống gấc phương pháp in vitro Từ đó, đánh giá tác động số chất điều tiết sinh trưởng nhân giống gấc  Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy sản xuất giống gấc thương phẩm có suất cao - Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu góp phần hoàn thiện kỹ thuật nhân giống gấc nhằm cung cấp giống gấc với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thời giữ đặc tính di truyền chọn lọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4.0 Hệ số nhân chồi(lần) 3.5 Chiều cao chồi (cm) 3.0 Tỷ lệ 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.6 Ảnh hƣởng BAP đến hiệu nhân chồi gấc Kết sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy: Bổ sung BAP vào mơi trường ni cấy hệ số nhân chồi tăng lên rõ rệt Ở nồng độ BAP khác cho kết nhân nhanh khác Bổ sung BAP 0,2mg/l cho hệ số nhân chồi cao đạt 3,32 lần, công thức cho chất lượng chồi tốt, thân chồi mập, xanh đậm, công thức đối chứng hệ số nhân đạt 1,00 lần Khi tăng nồng độ BAP lên từ 0,4mg/l đến 1mg/l (công thức đến công thức 6) hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình chồi chất lượng chồi giảm So sánh kết nghiên cứu cho thấy, công thức cho hệ số nhân chồi tốt so với công thức khác Vì vậy, mơi trường có bổ sung BAP 0,2mg/l môi trường phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh gấc 3.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp BAP kinetin đến hiệu nhân chồi Bảng 3.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của kết hợp BAP và kinetin đến hiệu quả nhân chồi gấc (Sau 30 ngày nuôi cấy) CT Nồng độ BAP(mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Số chồi TB thu đƣợc Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 1(đ/c) 0,2 0,0 398 3,32 3,70 + 0,2 0,1 540 4,50 4,65 ++ 0,2 0,2 461 3,84 4,22 ++ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 0,2 0,3 453 3,77 3,97 ++ 0,2 0,4 443 3,69 3,79 + 0,2 0,5 427 3,56 3,73 + LSD05 0,11 CV % 0,5 Ghi chú: + Sinh trưởng kém; ++ Sinh trưởng trung bình; +++ Sinh trưởng tốt 5.0 Hệ số nhân chồi(lần) 4.5 Chiều cao chồi (cm) 4.0 3.5 Tỷ lệ 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.7 Ảnh hƣởng kết hợp BAP kinetin đến hiệu nhân chồi gấc Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy trê n môi trườn g nền MS có bổ sung BAP (0,2mg/l) kết hợp với kinetin ở các nồng độ khác được thể hiện ở bảng 3.8 Các công thức bổ sung thêm kinetin hệ số nhân chồi đạt từ 3,56 đến 4,5 lần Công thức 2, bổ sung 0,1mg kinetin/l, cho hệ số nhân chồi cao (4,5 lần), chồi sinh trưởng trung bình, chiều cao đạt 4,65cm 3.3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp BAP nƣớc dừa đến hiệu nhân chồi Nước dừa chất điều tiết sinh trưởng tự nhiên giàu hợp chất hữu cơ, chất khống chất kích thích sinh trưởng Nước dừa thường sử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 dụng để kích thích phân hóa nhân nhanh chồi nuôi cấy mô tế bào Hơn với vai trò chất điều tiết sinh trưởng tự nhiên nước dừa mang lại hiệu khơng hệ số nhân chồi mà cho chất lượng chồi tốt, bền vững trì in vitro Qua nhiều lần nhân nhanh chất lượng chồi có xu hướng giảm sút Để giải vấn đề đảm bảo hệ số nhân chồi nhân nhanh, việc bổ sung nước dừa vào môi trường nhân nhanh tốt thu thí nghiệm (mơi trường có bổ sung BAP 0,2mg /l) phù hợp với mục đích nghiên cứu khả nâng cao chất lượng chồi nước dừa nhân nhanh Kết sau tuần nuôi cấy thu bảng 3.9 Hình 3.8 Bảng 3.9 Nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp BAP nƣớc dừa đến hiệu nhân chồi (Sau 30 ngày nuôi cấy) CT Nồng độ BAP(mg/l) Nƣớc dừa (ml) Số chồi TB thu đƣợc Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 1(Đ/c) 0,2 398 3,32 3,70 + 0,2 50 431 3,59 3,74 + 0,2 100 495 4,13 4,51 +++ 0,2 150 429 3,57 3,80 ++ 0,2 200 409 3,41 3,75 ++ 0,2 250 389 3,24 3,72 + LSD0,5 0,11 0,12 CV % 1,8 1,7 Ghi chú: + Sinh trưởng kém; ++ Sinh trưởng trung bình; +++ Sinh trưởng tốt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Tỷ lệ 5.0 Hệ số nhân chồi(lần) 4.5 Chiều cao chồi (cm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.8 Ảnh hƣởng kết hợp BAP nƣớc dừa đến hiệu nhân chồi gấc Qua bảng 3.9 Hình 3.8 cho ta thấy, công thức đối chứng (môi trường không bổ sung nước dừa) cơng thức thí nghiệm có khả nhân chồi, hệ số nhân chồi dao động từ 3,24 lần đến 4,13 lần Trong đó, mơi trường bổ sung BAP 0,2mg/l 100ml nước dừa cho hệ số nhân chồi cao đạt 4,13 lần, cao so với môi trường bổ sung BAP 0,2mg/l (3,32 lần) chiều cao chồi cao đạt 4,51cm Mặt khác, nhận thấy bổ sung nước dừa nồng độ 100ml/l kết hợp với BAP 0,2mg/l chồi sinh trưởng phát triển tốt, thân chồi mập, xanh hình thái khỏe khơng bổ sung kết hợp 3.3.5 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi Để tăng khả nhân chồi nuôi chồi môi trường MS + BAP 0,2mg/l (nồng độ tốt tìm thí nghiệm 3.3.2) + 30g Sucrose/l + 5,7g aga/l + 100mg inositol/l, pH=5,6 bổ sung thêm IBA mức nồng độ thay đổi sau: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 Bảng 3.10 Nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp BAP IBA đến khả nhân nhanh chồi gấc (Sau 30 ngày nuôi cấy) CT Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Số chồi TB thu đƣợc Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 1(đ/c) 0,2 0,0 398 3,32 3,70 + 0,2 0,02 606 5,05 5,63 +++ 0,2 0,04 483 4,02 4,30 ++ 0,2 0,06 465 3,88 3,80 ++ 0,2 0,08 451 3,76 3,40 + 0,2 0,1 421 3,51 3,00 + LSD0,5 0,44 0,19 CV % 0,6 2,8 Tỷ lệ Ghi chú: + Sinh trưởng kém; ++ Sinh trưởng trung bình; +++ Sinh trưởng tốt Hệ số nhân chồi(lần) 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Chiều cao chồi (cm) Cơng thức thí nghiệm Hình 3.9 Ảnh hƣởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi gấc Qua bảng 3.10 Hình 3.9 nhận thấy: Khi bổ sung tổ hợp BAP IBA thu hệ số nhân chồi cao, dao động từ 3,32 lần đến 5,05 lần Ở công thức bổ sung IBA với nồng độ 0,04 đến 0,1mg/l cho hệ số nhân chồi thấp giảm dần từ 4,02 lần xuống 3,51 lần, cụm chồi phát triển Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 không đồng đều, chồi nhỏ thấp Riêng cơng thức có bổ sung BAP 0,2mg/l kết hợp với IBA 0,02mg/l cho hệ số nhân chồi cao đạt 5,05 lần, chất lượng chồi tốt, đồng đều, xanh đậm So sánh kết nghiên cứu cho thấy công thức cho chất lượng chồi tốt so với công thức khác Do vậy, môi trường bổ sung tổ hợp BAP 0,2mg/l IBA 0,02mg /lđược chọn để nhân nhanh chồi cho thí nghiệm 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến khả rễ chồi gấc Giai đoạn rễ cơng đoạn cuối quy trình nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro Kết thúc giai đoạn thu hoàn chỉnh (đầy đủ rễ, thân lá) Trong giai đoạn này, người ta thường sử dụng chất ĐTST thuộc nhóm Auxin để kích thích rễ Trên thực tế, gấc loại có rễ chùm, để đảm bảo sinh trưởng, phát triển tốt tự nhiên, việc nghiên cứu tạo rễ khoẻ, cứng cáp yếu tố then chốt, định thành công giai đoạn Với mục đích trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng NAA IBA đến rễ chồi gấc Sau 30 ngày nuôi cấy thu kết sau: 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng IBA đến hiệu rễ Bảng 3.11 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng IBA đến hiệu rễ (Sau 30 ngày nuôi cấy) CT Nồng độ IBA Tỷ lệ rễ (mg/l) (%) Sau 30 ngày Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) Mầu sắc rễ 0,0 0 0,1 100 1,16 2,44 Nâu 0,2 100 2,31 3,15 Trắng 0,3 100 2,36 2,85 Nâu 0,4 100 3,04 2,59 Trắng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 0,5 100 3,71 3,93 LSD0,05 0,84 0,55 CV(%) 2,3 1,2 Số rễ/cây (rễ) 4.0 Chiều dài rễ (cm) 3.5 Tỷ lệ Nâu 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.10 Ảnh hƣởng IBA đến hiệu rễ gấc Kết nghiên cứu cho thấy: Ở môi trường không bổ sung IBA, rễ khơng hình thành Sau 30 ngày nuôi cấy, công thức bổ sung IBA (0,1mg/l IBA đến 0,5 mg/l) rễ hình thành Số rễ chiều dài rễ đạt giá trị cao công thức bổ sung 0,2mg IBA/l Tuy nhiên quan sát sinh trưởng cho thấy, rễ sinh trưởng tốt chồi sinh trưởng kém, vàng, chồi nhỏ, thân nhỏ Điều cho thấy IBA chưa thực phù hợp phù hợp cho giai đoạn rễ để tạo hoàn chỉnh gấc 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến hiệu rễ Bảng 3.12 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến hiệu rễ CT Nồng độ NAA (mg/l) Sau 30 ngày Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) 0,0 0 0,10 100 4,23 4,2 Trắng 0,20 100 3,62 3,2 Trắng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Mầu sắc rễ http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 0,30 100 2,41 2,91 Trắng 0,40 100 2,35 2,62 Trắng 0,50 100 1,19 2,48 Trắng LSD0,05 0,11 0,29 CV(%) 1,8 0,6 Tỷ lệ 4.5 Số rễ/cây (rễ) 4.0 Chiều dài rễ (cm) 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.11 Ảnh hƣởng NAA đến hiệu rễ gấc Qua bảng 3.12 Hình 3.11 chúng tơi nhận thấy: Mơi trường có bổ sung NAA, chồi gấc rễ với tỷ lệ 100% Sau tuần nuôi cấy cho tỷ lệ rễ từ 1,19 – 4,23 rễ/cây chiều dài rễ đạt từ 2,48 – 4,2cm Trong đó, mơi trường có bổ sung 0,1mg NAA/l cho tỷ lệ rễ cao hai giá trị số rễ/cây chiều dài rễ (sau tuần đạt 4,23 rễ/cây, chiều dài rễ trung bình 4,2cm), phát triển tốt, xanh, thân mập 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống vƣờn ƣơm Sau thời gian nuôi cấy môi trường tạo rễ, gấc in vitro phát triển hoàn chỉnh 4- lá, chiều cao từ - 8cm đưa trồng vườn ươm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 Để giúp thích nghi từ từ với mơi trường nên mở nắp bình đựng in vitro, sau để vườn ươm khoảng vài ngày, dùng kẹp nhẹ nhàng gắp khỏi bình, rửa aga, đem trồng giá thể Trồng vào giá thể giai đoạn cuối q trình nhân giống, việc đưa từ mơi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên lựa chọn giá thể thích hợp cho sinh trưởng phát triển quan trọng Mỗi giá thể có đặc tính khác Mỗi loại trồng có yêu cầu khác điều kiện ngoại cảnh Nhìn chung, gấc sau ni cấy mơ có yêu cầu chặt điều kiện môi trường, độ ẩm phải lớn không bị úng, nhiệt độ mơi trường khơng q cao, giá thể có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn vườn ươm Để xác định giá thể phù hợp, tiến hành thử nghiệm 45 ngày kết thu bảng sau: Bảng 3.13 Nghiên cứu ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống vƣờn ƣơm (Sau 45 ngày) Giá thể CT Số Số sống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Cát 60 12 20 2,5 Đất 60 30 50 3,12 Đất: trấu hun (2 :1) 60 56 93,3 6,4 Cát: đất: trấu hun(1 :2 :1) 60 36,7 61,1 4,28 LSD 0,05 3,6 CV(%) 3,4 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Tỷ lệ sống (%) 100 Tỷ lệ sống (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.12 Ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống vƣờn ƣơm Qua bảng 3.13 Hình 3.12 chúng tơi nhận thấy Các giá thể lựa chọn đưa vào thí nghiệm thích hợp cho phát triển in vitro giai đoạn luyện Tỷ lệ sống giá thể sau 45 ngày, dao động từ 20% đến 93,3% Trên giá thể cát, với tỷ lệ sống đạt 20%, sinh trưởng yếu, phát triển, chiều cao đạt 2,5cm Trên giá thể (đất), tỷ lệ sống đạt 50%, sinh trưởng bình thường, nhỏ xanh nhạt, chiều cao đạt 3,12cm Trên giá thể (Đất: trấu hun = 2:1) tỷ lệ sống đạt 93,3%, mập, khỏe, to xanh thẫm, dày bản, chiều cao đạt 6,4cm Trên giá thể (Cát: đất: trấu hun theo tỷ lệ 1: : 1), tỷ lệ sống đạt 61,1%, sinh trưởng bình thường, mỏng, chiều cao đạt 4,28cm Như vậy, so sánh kết cho thấy giá thể phù hợp để luyện vườn ươm giá thể đất : trấu hun theo tỷ lệ 2:1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Khử trùng mẫu gấc dung dịch HgCl2 0,1% thời gian 15 phút thích hợp nhất, cho tỉ lệ mẫu sống cao 58,9% Môi trường tái sinh MS + 1mg BAP/l + 5,7g aga/l + 30g Sucrose/l + 100mg inositol/l, pH = 5,6, mơi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi gấc, tỷ lệ nảy chồi cao đạt 80,6% Môi trường MS + BAP 0,2mg /l + IBA 0,02mg /l + 5,7g aga /l + 30g đường/l + 100mg inositol /l, pH= 5,6 mơi trường thích hợp cho việc nhân nhanh cho hệ số nhân chồi cao đạt 5,05 lần Môi trường 1/2MS + 0,1mg NAA/l + 30g Sucrose/l + 5,7g aga/l + 100mg inositol/l, pH = 5,6 mơi trường thích hợp để rễ gấc Giá thể Đất : trấu hun theo tỷ lệ (2:1) cơng thức thích hợp cho gấc sinh trưởng phát triển vườn ươm KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục đưa giống gấc nuôi cấy mơ ngồi sản xuất đồng ruộng để khảo sát sinh trưởng, phát triển, suất kiểm tra chất lượng giống Xây dựng mơ hình trồng gấc công nghệ cao phục vụ nhu cầu sản xuất thương phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình (1997) Cơng nghệ thực vật cải tiến giống trồng, NXB nông nghiệp, Hà Nội, tr 64, 100 Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt Nam (Quyển 1), Nhà xuất Trẻ, trang 568 Lê Văn Hồ (2009) Nhân giống vơ tính gấc (momordica cochinchinensis (lour.) spreng) phương pháp ni cấy mơ tế bào, Tạp chí Khoa học 2009:11,Tr 163-172, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Hồng (2009) Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống hoa đồng tiền phương pháp nuôi cấy mô Thái Nguyên, Luận Văn Thạc Sĩ khoa học Nông nghiệp, tr36-38 Nguyễn Kim Ngân (1991) Tác dụng Gacavit việc bảo vệ phóng xạ Tóm tắt báo cáo hội nghị Hóa sinh phục vụ sản xuất đời sống toàn quốc lần thứ hai Hà Nội 17-18 tháng 12, 1991, tr.85 Phan Tuấn Nghĩa (1988) Bước đầu nghiên cứu chất kìm hãm trypxin hạt mướp đắng (Momodica charantia L.) Luận án phó tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa (1996) Nhân nhanh gấc (momordica cochinchinensis spreng) phương pháp nuôi cấy mô Kết nghiên cứu khoa học 1986- 1996 NXB Nông nghiệp, tr.141 Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, Trang 886 Lê Đình Lương, Hà Văn Mạo, Mai Hồng Bàng (1988) Tác dụng sửa chữa AND bị tổn thương tia tử ngoại dầu gấc Việt Nam Tạp chí di truyền học Ứng dụng, số 2: tr.8 10 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, (2006) Công nghệ sinh học NXB Giáo dục 11 Nguyễn Tường Vy (2008) Nghiên cứu thành phần hố học góp phần tiêu chuẩn hoá chất lượng dầu gấc Việt Nam dùng thuốc Luận án tiến sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Đỗ Thị Ngọc Oanh (2004) Giáo trình phương pháp thí nghiệm đồng ruộng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Trung Phong (2005) Phân lập,nhận dạng cấu trúc khảo sát hoạt tính sinh học saponin từ rễ gấc(momordica cochinchinensis (lour.) spreng) Tạp chí Dược học số 356, T14-16,28 Tiếng Anh 14 Aoki, H., N.T Kieu, N Uze, K Tomi Saka, N.V Chuyen (2002) Carotenoid Pigments in Gac Fruit (Momordica cochinchinensis Spreng.), Biosci Biotechnol Biochem 66, pp 2479-2482 15 D S Burke, C.R Smidt, L.T Vuong (2005) "Momordica cochinchinensis, rosa roxburghii, wolfberry, and sea buckthorn—highly nutritional fruits supported by tradition and science", Current Topics in Nutraceutical Research Vol 3, No 4, pp 259-266, 16 George, E.F.(1993) Plant Propagation by Tissue Culture, 2nd Ed Exegetics Limited, pp 441 17 Huda A K M N, B Sikdar (2006) In vitro plant production through apical meristem culture of Bitter Gourd ( Momordica charantia L.) Plant Tissue Cult & Biotech, pp 31-36 18 Ishida, B.K., C Turner, M.H Chapman, T.A Mckeon (2004) Fatty acid and carotenoid composition in Gac (Momordica cochinchinensis Spreng.) fruit, J Agric Food Chem 52, pp 274-279 19 Le T Vuong, S.R Ducker, S.P Murphy (2002) Plasma β-carotene and retinol concentration of children increase after a 30-d supplementation with the fruit Momordica cochinchinensis (gac) Am J Clin Nutr 75, pp 872-879 20 Murashige T, Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue culture Physiol.plant 15, pp 473 21 Overbeek J van et al (1944) Coconut Milk used for growth and development of very young Datura embryos, Science, 94, pp 350-351 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC HÌNH ẢNH MINH HOẠ Hình ảnh minh họa chồi gấc tái sinh sau 20 ngày nuôi cấy môi trường: MS + 5,7g agar/l + 1mg BAP/l + 30g saccharose/l + 100mg inositol/l Hình ảnh minh họa giai đoạn nhân nhanh chồi gấc sau 30 ngày nuôi cấy môi trường MS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng Hình ảnh minh họa giai đoạn nhân nhanh chồi gấc sau 30 ngày nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung kết hợp 0,2mg BAP/l + 0,02mg IBA/l Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình ảnh minh họa giai đoạn rễ chồi gấc sau 30 ngày ni cấy mơi trường 1/2MS có bổ sung 0,1mg NAA/l Hình ảnh minh họa giai đoạn huấn luyện sau 45 ngày giá thể Đất : trấu hun Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... hành: ? ?Nghiên cứu nhân giống gấc (Momordica cochinchinensis) phương pháp nuôi cấy mô? ?? Mục đích nghiên cứu nội dung nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Xây dựng thành cơng quy trình nhân giống gấc có... hình nghiên cứu nhân giống gấc phƣơng pháp nuôi cấy mô Hiện nay, giới Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu nuôi mô tế bào thực vật gấc Năm 1996, tác giả Phan Tuấn Nghĩa cộng hoàn thiện quy trình nhân. .. cao phương pháp ni cấy mơ Nhờ đó, người ta nhân lên hàng vạn giữ nguyên tính trạng di truyền mẹ Đồng thời, nghiên cứu nuôi cấy mô đặt sở cho nghiên cứu chọn giống gấc có ưu lai cao Nội dung nghiên