Một số đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử của 15 giống lợn nội việt nam TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CHĂN NUÔI NGUYỄN VĂN BA MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA 15 GIỐNG LỢN NỘI VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành:: Di truyền Chọn giống vật nuôi Mã Số:: 62 01 08 HÀ NỘI - 2021 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN CHĂN NI Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Doãn Lân TS Nguyễn Văn Hậu Phản biện 1: PGS TS Phan Xuân Hảo Phản biện 2: PGS TS Đồng Văn Quyền Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp Viện Chăn nuôi, Thụy Phương, Bắc Từ Liệm, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Viện Chăn nuôi Thư viện Quốc gia Việt Nam năm 2021 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Doãn Lân, Nguyễn Văn Ba, Phạm Thu Thảo Lê Quang Nam Đa dạng di truyền gen Cytochrome B ty thể số giống lợn địa Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn nuôi số 229, tháng năm 2018: - Nguyễn Văn Ba, Trần Thị Thu Thủy, Lê Quang Nam, Nguyễn Văn Hậu Phạm Dỗn Lân Đa hình di truyền gen MX1 MX2 15 giống lợn địa Việt Nam Tạp chí Khoa học cơng nghệ chăn nuôi số 90, tháng năm 2018: 59 - 66 Nguyen Van Ba, Le Quang Nam, Do Ngoc Duy, Nguyen Van Hau and Pham Doan Lan An assessment of genetic diversity and population structures of fifteen Vietnamese indigenous pig breeds for supporting the decision making on conservation strategies Tropical Animal Health and Production (2020) 52: 1033 - 1041 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Nguồn gen vật nuôi quan trọng an ninh lương thực sinh kế toàn cầu, đặc biệt nước phát triển Nhu cầu sản phẩm động vật ngày tăng lên, dẫn đến thay đổi sản xuất chăn nuôi hệ thống thay lai tạo giống địa phương với giống ngoại có suất cao Kết là, nhiều giống địa bị tuyệt chủng dẫn đến suy giảm đáng kể đa dạng sinh học Hơn nữa, có nhiều tài liệu chứng minh việc trì đa dạng nguồn gen động vật quan trọng để đảm bảo thích nghi tương lai chẳng hạn biến đổi khí hậu, dịch bệnh Sử dụng công nghệ sinh học nghiên cứu đánh giá đặc điểm di truyền phân tử quần thể, giống vật ni phục vụ cho mục đích bảo tồn đồng thời hỗ trợ chọn lọc giống vật ni có suất, chất lượng cao tiến hành nhiều quốc gia giới phân tích thị microsatlelite, giải trình tự phân tích hệ gen ty thể, phân tích đa hình SNP… Theo FAO (2018), nguồn gen lợn địa Việt Nam có 16 giống nuôi giữ đồng bào vùng sâu vùng xa Các giống lợn địa phương có vai trị quan trọng mặt kinh tế đời sống bà vùng sâu xa Việt Nam chúng thích nghi tốt với mơi trường sống khắc nghiệt, phù hợp với tập quán chăn nuôi vùng Các nghiên cứu nước đặc điểm di truyền trước giống lợn nội Việt Nam chủ yếu đánh giá, xác định, so sánh, phân loại thông qua đặc điểm ngoại hình Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền sai khác di truyền giống lợn mức độ phân tử chưa tiến hành đầy đủ hệ thống Do đó, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu “Một số đặc điểm di truyền mức độ phân tử 15 giống lợn nội Việt Nam” với mục đích đánh giá đặc điểm đa dạng di truyền, cấu trúc di truyền, mối quan hệ di truyền, nguồn gốc phát sinh chủng loài đặc điểm tần số kiểu gen, tần số alen số thị phân tử nhằm hỗ trợ phục vụ công tác bảo tồn, chọn giống khai thác nguồn gen giống lợn nội cách có hiệu MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền cấu trúc di truyền 15 giống lợn nội dựa 19 thị microsatellite Xác định mối quan hệ phát sinh loài 15 giống lợn nội thơng qua đa hình trình tự gen Cytochrome B ty thể Xác định kiểu gen tần số alen gen ứng cử (MX1 MX2) liên quan đến khả kháng vi rút gây viêm loét miệng vi rút gây bệnh tai xanh 15 giống lợn nội NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung Nghiên cứu đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền cấu trúc di truyền 15 giống lợn nội 19 thị microsatellite Nội dung Nghiên cứu đa dạng di truyền gen Cytocrome B 15 giống lợn nội mối quan hệ phát sinh loài với số giống lợn giới Nội dung Nghiên cứu đa hình di truyền gen MX1 MX2 15 giống lợn nội ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án cơng trình hệ thống nghiên cứu số đặc điểm di truyền mức độ phân tử 15 giống lợn nội sử dụng thị hệ gen nhân (microsatellite, MX1, MX2) hệ gen ty thể (Cytochrome B) Việt Nam - Luận án đánh giá tính đa dạng, mối quan hệ cấu trúc di truyền 15 giống lợn nội dựa 19 thị microsatellite - Đã xác định phát sinh loài thể mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ haplotype 15 giống lợn nội Việt Nam với số giống lợn giới thơng qua đa hình gen Cytochrome B - Đã xác định tính đa hình gen MX1 MX2 - gen ứng cử liên quan đến tính kháng bệnh 15 giống lợn nội Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN - Luận án tài liệu khoa học hệ thống cung cấp thơng tin tính đa dạng, khoảng cách cấu trúc di truyền dựa thị microsatellite nguồn gốc phát sinh chủng loài 15 giống lợn nội Việt Nam với số giống lợn giới thơng qua trình tự gen Cytochrom B - Luận án cơng trình hệ thống Việt Nam cung cấp thông tin tần số kiểu gen, tần số alen gen MX1 MX2, gen cho liên quan đến khả kháng bệnh 15 giống lợn nội - Các báo đăng tạp chí ngồi nước tư liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu giảng dạy - Các kết nghiên cứu đóng góp vào sở liệu nguồn gen giống lợn nội Việt Nam; tạo tiền đề cho nghiên cứu xác định giống lợn nội có khả kháng bệnh - Luận án cung cấp thơng tin hữu ích cho cơng tác bảo tồn, chọn giống, định hướng lai tạo, khai thác sử dụng nguồn gen giống lợn nội cách có hiệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các giống lợn nội Việt Nam phong phú phân bố khắp vùng đất nước, vùng có giống với nét đặc trưng riêng Theo Tạ Thị Bích Duyên cs (2013) Việt Nam có khoảng 26 giống lợn nội ni chủ yếu vùng nông thôn, vùng xa vùng cao tổ quốc, nơi có điều kiện kinh tế nghèo khổ, khí hậu thời tiết khắc nghiệt, giao thơng lại khó khăn Số lượng lợn địa vùng giảm nhanh năm gần Thuật ngữ microsatellite Litt Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm trình tự ADN lặp lại cách có trật tự có độ dài vài base pair (2-6 bp), có tính đa hình cao Các thị phân tử cơng cụ hữu ích để đánh giá mức độ đa hình di truyền sai khác di truyền nguồn gen quần thể quần thể Ty thể bào quan nằm tế bào chất sinh vật nhân chuẩn di truyền theo dòng mẹ, độc lập với gen nhân tế bào Chức ty thể sản sinh phân tử cao ATP thông qua q trình hơ hấp tế bào Gen Cytochrome B có chiều dài khoảng 1140 bp mã hóa phân tử Cytochrome B đảm nhận chức vận chuyển điện tử (proton H+) chuỗi phản ứng oxy hóa khử để tổng hợp ATP Đã có nhiều nghiên cứu di truyền quần thể phân loại học áp dụng thông tin trình tự gen Cytochrome B nghiên cứu nguồn gốc mối quan hệ họ hàng theo dòng mẹ lồi, giống vật ni Gen MX gen kích thích sản sinh interferol – protein có vai trị kháng vi rút Không giống gia cầm, gen MX động vật có vú tồn hai dạng đồng hình MX1 MX2 Gen MX1 gen mã hóa phân tử protein MX1 lần biết đến nghiên cứu kháng bệnh cúm chuột, sau coi ứng cử gen quan trọng kháng xâm nhiễm vi rút động vật CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu luận án 15 giống lợn nội phân bố tồn quốc: Móng Cái, Hạ Lang, Hương, Táp Ná, Hung, Lũng Pù, Mường Khương, Lửng, Bản, Mẹo, Vân Pa, Cỏ, Chư Prơng, Sóc Ba Xun Ngồi giống lợn ngoại (Landrace) mẫu lợn rừng Việt Nam Thái Lan sử cho số nội dung nghiên cứu luận án 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Mẫu mô tai 15 giống lợn nội thu thập từ năm 2012 2013 Các thí nghiệm phân tích đa hình thị tiến hành Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Chăn nuôi năm từ 2014 đến 2018 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp thu mẫu bảo quản mẫu Sử dụng kìm lấy mẫu chuyên dụng cắt miếng mơ tai khoảng 0,5 g, sau để ống eppendoft có chứa sẵn 1,5 ml cồn (99%) Mẫu vận chuyển phịng thí nghiệm bảo quản tủ lạnh sâu (-20oC) đến tiến hành tách chiết ADN 2.3.2 Phương pháp tách chiết xác định nồng độ ADN Mẫu ADN tách chiết từ mơ tai thực theo quy trình kít Bioneer K-3032 (Hàn Quốc) Xác định nồng độ độ ADN tách chiết được: Sử dụng phương pháp điện di gel Agarose 1% để xác định định tính kết tách chiết ADN Tiếp theo dùng máy Nanodrop 2000 để định lượng độ nồng độ mẫu ADN thu 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền cấu trúc di truyền thị microsatellite Mẫu sử dụng phân tích: Sáu trăm linh tám mẫu thuộc 15 giống lợn nội phân tích kiều gen với 15 mẫu lợn ngoại Landrace hai giống lợn rừng (Việt Nam-6 mẫu Thái Lan-9 mẫu) sử dụng để so sánh đối chiếu Các thị microsatellite: Trong nghiên cứu này, 19 thị microsatellite có đa hình cao sử dụng lựa chọn theo khuyến cáo FAO/ISAG (2011) chuẩn hoá tổ hợp phản ứng PCR đa mồi Phân tích đa hình thị microsatellite: Kiểu gen cá thể lợn tiến hành phân tách hệ thống điện di mao quản máy giải trình tự tự động CEQ8000 hãng Beckman Coulter Ước lượng số số liên quan đến đa dạng di truyền Số lượng alen thị, trung bình số alen thị toàn quần thể độ phong phú alen (Alenlic Richness - Rs) ước lượng phần mềm FSTAT phiên 2.9.3.2 (Goudet J 2002) Tần số dị hợp tử lý thuyết (He), dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số F (Fis, Fst) thị trung bình tồn thị quần thể ước lượng phần mềm Genetix (phiên 4.0.5.2) Giá trị thông tin đa hình (PIC) thị tính theo Botstein cs (1980) Kiểm tra tính cân di truyền Hardy-Weinberg: Độ phù hợp với cân di truyền theo Hardy-Weinberg giống kiểm tra phép thử “khi bình phương” (χ2) Xác định khoảng cách di truyền quần thể: Khoảng cách di truyền tính theo phương pháp Nei (1978): Xác định cấu trúc di truyền: Cấu trúc di truyền 15 giống lợn thực dựa phương pháp đa biến – phân tích biệt thức thành phần (Discriminant Analysis of Principal Components - DAPC) theo Jombart cs (2008) gói phần mềm “adegenet” mơi trường ngôn ngữ thống kê R phiên 2.0 (Team, 2013) 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền gen Cytochrome B mối quan hệ phát sinh loài Mẫu sử dụng phân tích: Nghiên cứu thực 284 mẫu thuộc 15 giống lợn nội mẫu lợn rừng Ngồi trình tự giống công bố ngân hàng gen với haplotype lợn Nhật bản; haplotype lợn Trung Quốc; haplotype lợn nuôi Duroc Châu Âu; haplotype lợn rừng Châu Á; haplotype lợn rừng Châu Âu sử dụng để đối chiếu Phản ứng nhân gen Cytochrome B: Tồn gen Cytochrome B ty thể với trình tự dài 1140 bp khuếch đại thông qua phản ứng PCR với cặp mồi ký hiệu H6 L7 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự: Sản phẩm phản ứng PCR tiến hành tinh kít tinh hãng Invitrogen Quá trình giải trình tự tiến hành theo bước: thứ thực phản ứng sequencing, làm sau sequencing cuối tiến hành giải trình tự máy AB3130 hãng AB (Applied Biosystem) Phân tích kết quả: Trong nghiên cứu này, liệu thơ 285 mẫu phân tích gen cytochrome b ty thể xử lý phần mềm BioEdit 6.0 Phần mềm DnaSP 5.10 sử dụng phân tích đa dạng nucleotit phát haplotype Phần mềm MEGA 7.0 sử dụng giúp xây dựng phát sinh chủng loại theo phương pháp NJ (Neighbor-Joining) 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền locus gen MX1 MX2 Mẫu sử dụng phân tích: Sáu trăm linh tám mẫu thuộc 15 giống lợn nội sử dụng để phân tích kiểu gen MX1 MX2 Phản ứng nhân gen PCR: Phản ứng PCR thực với tổng thể tích 25 µl với cặp mồi đặc hiệu cho gen theo công bố trước (MX1 intron theo Li cs.,2007; MX1 promoter theo 10 thấp lợn Mẹo-lợn Bản (0,101) lớn lợn Hươnglợn rừng Thái Lan (1,498) Trong 15 giống lợn nội lợn Ba Xun có khoảng cách di truyền xa so với giống lợn nội khác (0,561,29) Các giống lợn phía bắc Móng Cái, Hương, Hạ Lang, Lũng Pù, Mường Khương, Hung, Lửng, Bản, Táp Ná có khoảng cách di truyền gần (trong khoảng từ 0,2-0,7) Theo Lê Viết Ly cs (1999) giống lợn Ba Xuyên hình thành từ việc lai tạo lợn địa phương miền Nam với lợn châu Âu Trong nghiên cứu khoảng cách di truyền lợn Ba Xuyên với lợn Landrace gần Ishihara cs (2018) cho phần lớn giống lợn nội Việt Nam phân bố nhóm tương đồng với khoảng cách địa lý trừ lợn Ba Xuyên Tuy nhiên nghiên cứu số giống có khoảng cách di truyền không tuân theo khoảng cách địa lý Như giống lợn Mẹo Nghệ An xa Sơn La lại có khoảng cách di truyền gần với lợn Bản, lợn Ba Xuyên (miền Nam) có khoảng cách di truyền gần với lợn Lửng lợn Hạ Lang (miền Bắc) so sánh với giống nội khác chúng cách xa địa lý Cây phát sinh chủng loại thể mối quan hệ di truyền giống lợn xây dựng dựa khoảng cách di truyền trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại 18 giống lợn 13 Kết hình 3.3 cho thấy 15 giống lợn phân thành nhánh lớn giống lợn ngoại lợn rừng có phân bố nhánh tách biệt vươn xa Cụ thể sau: - Nhánh gồm giống lợn: Mường Khương, Lũng Pù, Táp Ná, Hung, Mẹo, Bản Vân Pa Các giống phần lớn lợn đen có khoảng cách địa lý gần nhau, hầu hết tập trung Bắc Việt Nam Các giống phân bố gần khoảng cách di truyền gần lợn Lũng Pù, Mường Khương lợn Hung Ba giống có xu hướng tạo thành nhánh phụ Cũng nhánh này, cách xa khoảng cách địa lý lợn Bản - Sơn La lợn Mẹo - Nghệ An lại có khoảng cách di truyền gần Kết trình di cư đồng bào dân tộc thiểu số(H’Mơng, Thái…) phía Bắc xuống phía Nam mang theo giống lợn Bản từ Sơn La vào Nghệ An trải qua thời gian dài hình thành nên giống lợn Mẹo ngày Giống lợn Vân Pa với lợn Bản lợn Mẹo tạo thành nhánh phụ lợn Vân Pa có xu hướng tách xa so với lợn Bản lợn Mẹo - Nhánh gồm giống lợn: Cỏ, Sóc, Chư Prơng giống lợn rừng (Việt Nam Thái Lan) Tuy nhiên giống lợn nhánh hình thành nhánh nhỏ Trong lợn Sóc Chư Prơng (có phân bố Tây Nguyên) nằm nhánh lợn Chư Prơng có xu hướng phân ly xa so với lợn Sóc Hai giống lợn rừng tạo thành nhánh phụ lợn Cỏ nằm riêng nhánh nhóm - Nhánh gồm giống lợn: Móng Cái, Hương, Hạ Lang, Lửng, Ba Xuyên Landrace Các giống lợn Móng Cái, Hương, Hạ Lang, Ba Xuyên có lơng, da lang trắng đen Lợn Móng Cái, Hương Hạ Lang giống lợn phân bố vùng biên giới Trung Quốc Những giống lợn có đặc điểm ngoại khả sản xuất khác hẳn với giống lợn đen địa khác Việt Nam Giống lợn Ba Xuyên có phân bố địa lý Sóc Trăng (Tây Nam Bộ) - giống lợn tạp giao với giống lợn có nguồn gốc châu Âu (Lê Viết Ly cs., 1999) - nằm nhánh gần với lợn 14 Landrace tách xa so với lợn Lửng nhóm lợn lang phía Bắc (Móng Cái, Hạ Lang Hương) 3.2.5 Cấu trúc di truyền Kết phân tích DAPC số nhóm xác định ứng với giá trị BIC nhỏ K = 12 Chi tiết cấu trúc di truyền 18 giống lợn nghiên cứu thể hình 3.5 Hình 3.5 Kết phân tích cấu trúc di truyền 18 giống lợn DAPC (a) Thành phần 12 cụm di truyền; (b) Hình ảnh phân bố 12 cụm thu từ DAPC; (c) Cấu trúc 12 cụm 18 giống lợn Cấu trúc di truyền 18 giống lợn phân bố 12 cụm di truyền thể hình 3.5, cụm số 4, phức tạp Qua hình ảnh chi tiết 12 cụm di truyền cho thấy số giống lợn có cấu trúc thuần, số giống tương đối số giống có cấu trúc pha tạp Trong giống lợn có cấu trúc như: Ba Xuyên, Landdrace, Hương, Móng Cái, Chư Prong Sóc Một số giống lợn có cấu trúc tương đối như: Bản, Cỏ, Hung, Lửng, Lũng Pù, Mẹo, Mường Khương, Vân Pa rừng Thái Lan Một số 15 giống có cấu trúc phức tạp Hạ Lang, Táp Ná lợn rừng Việt Nam Kết phân tích DAPC lợn Ba Xuyên nằm nhóm với lợn Landrace Ba giống lợn lang trắng đen gần biên giới phía Bắc (Hạ Lang, Hương, Móng Cái) nằm cụm khác Trong lợn Hương Móng Cái nằm nhóm riêng cịn lợn Hạ Lang có pha trộn gen di truyền với cụm khác Ngoài phần di truyền đặc trưng cụm số lợn Hạ Lang có pha trộn nhiều với lợn Móng Cái, tiếp đến nhóm lợn đen vùng Cao Bằng, Hà Giang Lào Cai Trong 15 giống lợn nội, lợn Ba Xuyên giống lợn Lang trắng đen có giống màu lợn đen, lại giống màu giống màu trắng Các giống lợn đen phía Bắc tạo thành hai cụm (số số 8) điển hình Cụm số lợn đen biên giới phía Bắc (Cao Bằng, Hà Giang, Lào Cai), cụm số lợn đen phía Tây Bắc (Sơn La) Phân tích cấu trúc di truyền cụm số cho thấy phát tán nguồn gen lợn Móng Cái pha trộn giống lợn Bản, Mẹo, Hạ Lang, Táp Ná, Lửng Sự ảnh hưởng rộng rãi nguồn gen lợn Móng Cái tới số giống lợn nội khác kết trình cải tạo nâng cao suất năm 1980 giống lợn Móng Cái có đặc điểm ưu việt tầm vóc lớn, đẻ nhiều, nuôi khéo Bốn giống lợn Vân Pa, lợn Cỏ, lợn Sóc lợn Chư Prong phân bố cụm di truyền riêng tạo thành giống đặc hữu miền Trung Tây Nguyên lợn Cỏ lợn Vân Pa bị pha tạp phần 3.3 ĐA DẠNG DI TRUYỀN GEN CYTOCHROME B Ở MƯỜI LĂM GIỐNG LỢN NỘI 3.3.1 Kết phản ứng PCR Gen Cytochrome B khuếch đại thành công phản ứng PCR với cặp mồi H6 L7 có kích thước 1140 bp tương ứng với mong đợi 3.3.2 Kết giải trình tự gen Cytochrome B 16 Sảm phẩm giải trình tự chiều cho kết đọc xác tới 700 nucleotit Tồn gen Cytochrome B (1140 bp) sau giải trình tự theo hai chiều xuôi ngược tiến hành xử lý loại bỏ đoạn đầu đoạn cuối sau ghép nối thu đoạn trình tự dài 975 bp 285 mẫu lợn (284 mẫu lợn nội mẫu lợn rừng Việt Nam) 3.3.3 Đa dạng nucleotit đa hình trình tự gen Cytochrome B giống lợn nội Việt Nam Trong 15 giống lợn nội Việt Nam, giống lợn Ba Xuyên (Kế Sách - Sóc Trăng) giống lợn Mẹo (Kỳ Sơn - Nghệ An) có đa dạng haplotype cao, giống phát haplotype khác với đa dạng haplotype (Hd) 0,634; đa dạng nucleotit (Pi) 0,00124 lợn Ba Xuyên đa dạng haplotype (Hd)=0,792; đa dạng nucleotit (Pi)= 0,00183 lợn Mẹo Ngược lại, giống lợn Hương (Hoà An - Cao Bằng) phát haplotype Với 28 haplotype phát được, haplotype halotype haplotype xuất nhiều 16 giống lợn với tỷ lệ 166/285 60/285 (bảng 3.8) Đặc biệt mẫu lợn rừng thu thập có trình tự trùng với haplotype 1-haplotype xuất phổ biến 15 giống lợn nội Việt Nam Kết phân tích mức đa dạng haplotype gen Cytochrome B giống lợn Việt Nam không cao, xác định 28 haplotype khác 16 giống phân tích So sánh sai khác di truyền 28 haplotype cho thấy có khác đáng kể Trong lợn rừng có mẫu với haplotype nằm haplotype phổ biến Do tiến hành xây dựng phát sinh chủng loại giống loại bỏ liệu trình tự mẫu lợn rừng Cây phát sinh chủng loại theo dòng mẹ 15 giống lợn nội Việt Nam chia thành nhóm cụ thể sau: - Nhóm gồm giống lợn: Móng Cái Hạ Lang - Nhóm gồm 12 giống lợn: Tạp Ná, Mường Khương, Hung, Lũng Pù, Cỏ, Lửng, Vân Pa, Sóc, Mẹo, Bản, Chư Prong Ba Xuyên - Nhóm giống lợn Hương 17 Hình 3.8 Cây phân loại thể mối quan hệ theo dòng mẹ 15 giống lợn nội Việt Nam xây dựng theo mơ hình neighbor-joining Qua hình 3.8 cho thấy lợn Móng Cái lợn Hạ Lang có mối quan hệ di truyền gần gũi Điều phù hợp với kết phân tích cấu trúc di truyền dựa 19 thị microsatellite phần trước (lợn Hạ Lang có phần cấu trúc lai với lợn Móng Cái) Trong phân tích lợn Hương có khoảng cách di truyền xa nằm tách biệt nhánh so với giống cịn lại Kết phân tích cấu trúc di truyền đa dạng di truyền dựa 19 thị microsatelllite lợn Hương có cấu trúc di truyền riêng rẽ độ đa dạng mức thấp Bốn giống lợn miền núi biên giới phía Bắc tập hợp nhóm (Táp Ná, Mường Khương, Hung, Lũng Pù) có quan hệ gần gũi với (hình 3.8) Cũng nhóm bốn giống lợn “đen” có quan hệ gần gũi với lợn Lửng, Vân Pa, Cỏ Sóc Đây giống lợn có màu sắc da lơng đen, tầm vóc nhỏ tỷ lệ nạc cao (Tạ Thị Bích Duyên cs., 2013) Lợn Bản lợn Mẹo có quan hệ gần (kết tương đồng với phân tích 19 microsatellite) Lợn Chư Prong lợn Ba Xuyên nằm gần nhóm Đây chứng phân tử khẳng định nguồn gốc lợn Ba Xuyên lai lợn đực Châu Âu với lợn địa miền Nam 18 3.3.4 Mối quan hệ phát sinh lợn Việt Nam với lợn nuôi, lợn rừng Châu Á Châu Âu Mối quan hệ phát sinh 28 haplotype 16 giống lợn Việt Nam với mẫu haplotype gen Cytochrome B từ ngân hàng gen (GenBank) Tổng số 40 haplotype gen cytochrome b phân tích so sánh trình tự Kết cho thấy haplotype lợn nuôi Nhật Bản (AB015078) trùng với haplotype số 28 haplotype 16 giống lợn Việt Nam Do 39 haplotype tổng hợp để phân tích Kết đánh giá đa dạng di truyền dựa trình tự 39 haplotype khác xác định 51 điểm đa hình đa dạng trình tự nucleotit (Pi) haplotype 0.00157 Cây phân loại mối quan hệ di truyền 39 mẫu haplotype xây dựng theo mơ hình neighbor-joining (hình 3.9) Hình 3.9 Cây phân loại thể mối quan hệ di truyền 39 haplotype xây dựng theo mơ hình neighbor-joining phần mềm MEGA7 19 Qua hình 3.9 cho thấy mẫu haplotype lợn Việt Nam có mối quan hệ di truyền gần gũi với lợn rừng Châu Á, tách biệt hoàn tồn so với lợn ni lợn rừng Châu Âu Đặc biệt mẫu lợn nuôi Việt Nam chia thành nhánh Một nhánh gần với mẫu lợn Trung Quốc Nhật Bản Một nhánh trung gian nhánh lại gần với mẫu lợn rừng Châu Á Các haloptype xác định giống lợn nội, kể giống thu thập Gia Lai Đắc Lắc (lợn Chư-Prơng, lợn Sóc), gần mặt di truyền với lợn rừng Châu Á Kết phù hợp với nghiên cứu Lê Thành Long cs (2014) cho mẫu lợn ni địa khu vực Tây Ngun có khoảng cách di truyền gần với lợn rừng Châu Á Kết nghiên cứu không phát kiểu haplotype lợn Châu Âu mẫu lợn địa Việt Nam Trong đó, Clop cs (2004) tìm thấy có mặt hai kiểu haplotype lợn Châu Á Châu Âu phân tích giống lợn Châu Âu (lợn đen Canarian, lợn Pietrain Đức, lợn Pietrain Bỉ lợn Landrace) Theo kết phần nội dung 3.1 (nghiên cứu mối quan hệ di truyền dựa thị microsatellite) lợn Ba Xuyên có quan hệ gẫn gũi với lợn Landrace Tuy nhiên phân tích mối quan hệ di truyền dựa trình tự gen Cytochrome B cho thấy khơng có haplotype lợn Việt Nam nằm nhánh lợn châu Âu, kể lợn Ba Xuyên Điều giả thiết lợn Ba Xuyên hình thành trình dài lai tạo lợn mẹ địa Việt Nam với lợn châu Âu nên phần di truyền dòng mẹ (ADN ty thể) lợn Việt Nam bảo tồn giống lợn Kết phân tích đa hình trình tự gen Cytochrome B khẳng định 15 giống lợn nội Việt Nam không nguồn gốc dòng mẹ với lợn châu Âu 3.4 ĐA DẠNG DI TRUYỀN GEN MX1 VÀ MX2 Ở MƯỜI LĂM GIỐNG LỢN NỘI 3.4.1 Kết phản ứng nhân gen PCR 20 3.4.1.1 Gen Mx1 intron Sau chạy phản ứng PCR đoạn gen Mx1 intron với trình tự mồi theo Li cs (2007), nhân đoạn gen Mx1 có kích thước khoảng 1133 bp, phù hợp với kích thước cơng bố ngân hàng gen (AH015318.2) Kết phản ứng PCR đoạn gen Mx1 giống lợn nội Việt Nam có kích thước cao so với kết Li cs (2007); Feng cs (2012) lợn địa Trung Quốc (911 bp) 3.4.1.2 Gen Mx1 promoter Đa hình gen Mx1- Promoter: Đã nhân thành công đoạn gen Mx1 promoter xác định đa hình kiểu gen mồi đặc hiệu tương ứng với alen A (461 bp) B (736 bp) Kiểu gen AA có kích thước 461 bp, kiểu gen AB có kích thước 736 461, kiểu gen BB có kích thước 736 bp 3.4.1.3 Gen Mx2 Đã nhân thành công đoạn gen Mx2 có kích thước khoảng 211 bp (hình 3.12) cặp mồi theo Sasaki cs (2014) 3.4.2 Đa dạng di truyền gen MX1 MX2 3.4.2.1 Gen Mx1 - intron Sau nhân thành công đoạn gen Mx1-intron có kích thước khoảng 1133 bp Sản phẩm phản ứng PCR đoạn gen Mx1 - intron cắt emzym giới hạn SnaBI để xác định đa hình kiểu gen Kết thu kiểu gen: AA , AB BB với alen A (1133 bp) B (764 369 bp) Kết phân tích đa hình đoạn gen Mx1intron 15 giống lợn nội Việt Nam thể bảng 3.9 21 Bảng 3.9 Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen Mx1- intron Tỷ lệ kiểu gen tần số alen (%) Giống AA AB BB Bản 41,7 37,5 20,8 60,4 39,6 2,24 Ba Xuyên 96,8 3,2 0,0 98,4 1,6 0,01 Cỏ 53,6 21,4 25,0 64,3 35,7 7,96 Chư Prong 52,6 31,6 15,8 68,4 31,6 2,75 Hung 37,1 20,0 42,9 47,1 52,9 12,54 Hạ Lang 65,2 28,3 6,5 79,4 20,7 0,87 Hương 28,2 43,6 28,2 50,0 50,0 0,64 Lũng Pù 19,2 27,7 53,2 33,0 67,0 6,59 Lửng 63,6 27,3 9,1 77,3 22,7 1,65 Móng Cái 52,1 33,3 14,6 68,8 31,3 2,41 Mẹo 53,9 28,2 18,0 68,0 32,1 4,85 Mường Khương 29,8 21,3 48,9 40,4 59,6 14,65 Sóc 84,6 10,3 5,1 89,7 10,3 7,65 Táp Ná 34,1 36,4 29,6 52,3 47,7 3,24 Vân Pa 84,9 9,1 6,1 89,4 10,6 8,94 53,2 25,3 21,6 65,8 34,2 5,00 Trung bình Alen B χ2 Alen A Kết phân tích đa hình đoạn gen Mx1- intron 15 giống lợn nội cho thấy có khác biệt giống Những giống lợn có tỷ lệ kiểu gen AA cao BB thấp (tần số alen A cao, alen B thấp) 22 Ba Xuyên, Sóc, Vân Pa Trong giống lợn Ba Xuyên có tần số alen A cao (98,4%) 96,8% số mẫu mang kiểu gen đồng hợp AA Giống lợn có tần số alen A cao gần tương đương với giống lợn Landrace (Li cs., 2007; Ze cs., 2012) giống lợn nội Việt Nam có nguồn gốc lai tạo với lợn châu Âu Ngược lại, giống có tần số alen A thấp, alen B cao Lũng Pù, Mường Khương Một số giống có tần số alen A B mức trung bình như Móng Cái, Bản, Mẹo, Táp Ná Trung bình tổng đàn tỷ lệ kiểu gen AA 53,2%, AB 25,3%, BB 21,5% Tần số alen A B trung bình 65,8% 34,2% Kết kiểm định tính cân theo định luật Hardy-Weinberg tần số alen gen Mx1 – intron giống lợn cho thấy: giống lợn Bản, Ba Xuyên, Chư Prong, Hạ Lang, Hương, Lửng, Móng Cái Táp Ná cân theo định luật Hardy-Weinberg (χ2 < χ2(1;0,05) = 3,81) Các giống lại lợn Cỏ, Hung, Lũng Pù, Mẹo, Mường Khương, Sóc Vân Pa khơng cân theo định luật Hardy-Weinberg Nguyên nhân giống chịu áp lực chọn lọc theo xu hướng riêng giao phối cận huyết 3.4.2.2 Gen Mx1- promoter Đã nhân thành công đoạn gen Mx1- promoter xác định đa hình kiểu gen tương ứng với alen A (461 bp) B (736 bp) phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu theo Li cs (2015) Kiểu gen AA có kích thước 461 bp, kiểu gen AB có kích thước 736 461, kiểu gen BB có kích thước 736 bp Sự khác kích thước alen A B xuất đa hình đoạn trình tự lặp ngắn chèn vào vùng promoter gen MX1 (trình tự SINE) có kích thước 275 bp vị trí - 547 gen Mx1 Kết đa hình gen Mx1 – promoter giống lợn nội Việt Nam minh họa qua bảng 3.11 23 Bảng 3.11 Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen Mx1-promoter 15 giống lợn nội Tỷ lệ kiểu gen tần số alen (%) Kiểu gen AA Kiểu gen AB Kiểu gen BB Alen A Alen B Bản 0,0 4,7 95,3 2,3 97,7 0,024 Ba Xuyên 81,0 14,2 4,8 88,1 11,9 4,272 Cỏ 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 N Chư Prong 0,0 11,1 88,9 5,6 94,4 0,125 Hung 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 N Hạ Lang 8,9 17,8 73,3 17,8 82,2 6,911 Hương 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 N Lũng Pù 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 N Lửng 4,8 52,3 42,9 31,0 69,0 2,135 Móng Cái 0,0 5,3 94,7 2,6 97,4 0,028 Mẹo 0,0 16,7 83,3 8,3 91,7 0,397 Mường Khương 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 N Sóc 0,0 13,0 87,0 6,5 93,5 0,224 Táp Ná 2,5 10,0 87,5 7,5 92,5 3,12 Vân Pa 0,0 27,3 72,7 13,6 86,4 1,097 6,5 11,5 82,0 12,2 87,8 Giống Trung bình N: Khơng xác định 24 χ2 Kết phân tích đa hình đoạn gen Mx1-promoter 15 giống lợn nội Việt Nam cho thấy tần số alen A B giống có khác lớn Tỷ lệ alen B trung bình tồn đàn cao (87,8%) alen A thấp (12,2%) Tuy nhiên giống lợn Ba Xuyên (có nguồn gốc lai tạo từ lợn Châu Âu với lợn nội) lại có tần số alen A cao (88,1%) với phần lớn cá thể mang kiểu gen AA (81,0%), tỷ lệ nhỏ mang kiểu gen AB BB (14,2% 4,8%) Các giống lợn nội cịn lại có tỷ lệ alen A thấp, alen B cao (trên 90 % trừ lợn Lửng, Vân Pa Hạ Lang) Tỷ lệ kiểu gen đồng hợp BB toàn đàn cao, loại trừ giống Ba Xuyên nói kiểu gen BB đặc trưng cho lợn nội Việt Nam Kiểm định tính cân theo định luật Hardy-Weinberg tần số alen gen Mx1-promoter giống lợn cho thấy giống: lợn Bản, Chư Prong, Lửng, Móng Cái, Mẹo, Sóc, Táp Ná Vân Pa cân theo định luật HardyWeinberg (χ2 < χ2(1;0,05) = 3,81) Hai giống lợn Ba Xuyên Hạ Lang không cân theo định luật Hardy-Weinberg Theo Li cs (2015), alen B coi alen đặc trưng cho giống lợn địa Trung Quốc có tần số cao (0,88 – 0,92) Trong alen A alen đặc trưng cho lợn châu Âu với tần số cao (trên 0,90) Kết nghiên cứu nhóm tác giả thấy alen B (chứa vùng trình tự xen SINE)- có liên quan đến khả kháng vi rút tai xanh đề cử đoạn gen marker tiềm quan trọng liên quan đến kháng vi rút PRRSV 3.4.2.3 Gen Mx2 Đoạn gen Mx2 khuyếch đại phản ứng PCR với cặp mồi theo Sasaki cs (2014), có kích thước 214 bp Sau cắt emzym giới hạn XhoI thu kiểu gen AA (214 bp), AB (214, 191 23 bp) BB (191 23 bp) Tuy nhiên kết cắt emzym thu 100% kiểu gen AA toàn 15 giống lợn nội Theo kết Sasaki cs., 2014 alen A có liên quan đến khả kháng vi rút viêm nhiệt miệng VSV vai trò alen đa hình axit amin 514 gen Mx2 lợn tới khả kháng vi rút giống tương tự đa hình axit amin 631 gen Mx gà 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đa dạng di truyền, cấu trúc di truyền 15 giống lợn dựa thị microsatellite Mười lăm giống lợn nội Việt Nam nghiên cứu thể tính đa dạng di truyền cao Trong giống lợn Bản, lợn Mẹo lợn Táp Ná có đa dạng di truyền cao sau đến lợn Ba Xuyên, Hung, Hạ Lang, Mường Khương, Móng Cái, Lửng, Lũng Pù, Sóc Vân Pa; giống có đa dạng di truyền thấp lợn Hương, lợn Cỏ lợn Chư Prong Khoảng cách di truyền 15 giống lợn nội với lợn rừng lợn ngoại phần lớn có tương đồng theo phân bố địa lý Mối quan hệ di truyền 15 giống lợn nội với giống lợn rừng lợn Landrace phát sinh chủng loài cho thấy 18 giống lợn phân bố nhánh lớn Cấu trúc di truyền 18 giống lợn phân thành 12 cụm Trong giống lợn có cấu trúc như: Ba Xuyên, Landdrace, Hương, Móng Cái, Chư Prong Sóc Một số giống lợn có cấu trúc tương đối như: Bản, Cỏ, Hung, Lửng, Lũng Pù, Mẹo, Mường Khương, Vân Pa rừng Thái Lan Một số giống có cấu trúc pha tạp Hạ Lang, Táp Ná lợn rừng Việt Nam Đa dạng di truyền gen Cytochrome b ty thể Đã xác định 28 haplotype gen Cytochrome b tổng số 285 mẫu lợn 15 giống lợn nội mẫu lợn rừng Việt Nam Mức độ đa dạng haplotype gen cytochrome b 15 giống lợn nội thấp, nhiên mức sai khác di truyền haplotype lại tương đối cao phân thành nhóm Kết nghiên cứu chứng phân tử mối quan hệ phát sinh chủng loại lợn nội Việt Nam với lợn nuôi lợn rừng châu Á, châu Âu chứng minh lợn nội Việt Nam có nguồn gốc từ lợn rừng châu Á 26 Đa hình di truyền gen MX1 MX2 Gen Mx1 – intron có đa hình cao 15 giống lợn nội, tần số alen A (65,8%) chiếm ưu so với alen B (34,2%) Những giống lợn có alen B thấp Ba Xuyên, Sóc, Vân Pa Những giống có tần số alen B cao Lũng Pù, Mường Khương, Hung, Hương, Táp Ná Bản Tần số alen gen Mx1 –promoter 15 giống lợn nội có khác giống Tần số alen A trung bình tồn đàn thấp (12,2 %) alen B có tần số cao (87,8 %) Những giống có tần số alen B cao lợn Bản, Cỏ, Chư Prơng, Hung, Hương, Lũng Pù, Móng Cái, Mẹo, Mường Khương, Sóc, Táp Ná Tần số alen B thấp lợn Ba Xun Gen Mx2 khơng có đa hình 15 giống lợn nội Việt Nam, tồn giống lợn nghiên cứu xuất kiểu gen AA với tần số alen A 100% ĐỀ NGHỊ Từ kết nghiên cứu đưa số đề nghị sau: Một số giống lợn có hệ số cận huyết cao (Hung, Hạ Lang, Móng Cái Sóc) cần có sách quản lý giống chặt chẽ nhằm tránh tác hại giao phối cận huyết Một số giống lợn có cấu trúc di truyền pha tạp lợn Hung, Hạ Lang, Táp Ná cần chọn lọc nhân Cần có nghiên cứu tiến hành giải phân tích trình tự tồn hệ gen để khai thác đặc điểm di truyền đặc trưng giống lợn nội Việt Nam Cần có chương trình nghiên cứu sâu nhằm tìm kiếm, đánh giá, chọn tạo giống lợn nội có khả kháng bệnh dựa thị phân tử 27 ... giống lợn mức độ phân tử chưa tiến hành đầy đủ hệ thống Do đó, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu ? ?Một số đặc điểm di truyền mức độ phân tử 15 giống lợn nội Việt Nam? ?? với mục đích đánh giá đặc điểm. .. xanh 15 giống lợn nội NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung Nghiên cứu đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền cấu trúc di truyền 15 giống lợn nội 19 thị microsatellite Nội dung Nghiên cứu đa dạng di truyền. .. 975 bp 285 mẫu lợn (284 mẫu lợn nội mẫu lợn rừng Việt Nam) 3.3.3 Đa dạng nucleotit đa hình trình tự gen Cytochrome B giống lợn nội Việt Nam Trong 15 giống lợn nội Việt Nam, giống lợn Ba Xuyên (Kế