[r]
(1)NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO KHÍ HYDRO SINH HỌC
TRONG ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ CỦA VI KHUẨN ƯA NHIỆT Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau DAt PHÂN LẬP Ở
VIỆT NAM
Nguyễn Thị Yên1, Lại Thúy Hiền1, Nguyễn Thị Thu Huyền1, 2, * 1
Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
2
Khoa Dược, Trường ĐH Nguyễn Tất Thành, 300A Nguyễn Tất Thành, P13, Q4, Hồ Chí Minh
*
Email:huyen308@gmail.com
Đến Tịa soạn: 20/4/2013; Chấp nhận đăng: 20/12/2014 TÓM TẮT
Hydro nguồn lượng sạch, có triển vọng thay nhiên liệu hóa thạch tương
lai Trên giới xuất nhiều cơng trình nghiên cứu tạo hydro sinh học từ trình lên men
các vi khuẩn kị khí Ở nước ta, nghiên cứu vi khuẩn tạo khí hydro sinh học bắt đầu nên có vài cơng trình cơng bố khả tạo khí hydro chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn ưa nhiệt Trau DAt phân lập từ phân trâu Việt Nam có khả sinh khí hydro điều kiện ni cấy kị khí Q trình tạo khí chủng Trau DAt diễn song song với q trình sinh trưởng với lượng khí hydro tạo thành chiếm 42,95 % tổng thể tích khí thu
được Điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình tạo khí hydro chủng Trau DAt gồm
thông số: tỉ lệ tiếp giống đầu vào 10 %, glucose 10 g/l, cao nấm men g/l; FeSO4.7H2O 0,5 g/l; pH 6,5 điều kiện nhiệt độ 55 oC Ởđiều kiện lên men kị khí thích hợp theo mẻở quy mơ bình thí nghiệm, thể tích khí thu từ chủng Trau DAt đạt 198 ml/600 ml dịch lên men Kết nghiên cứu bước đầu chứng tỏ chủng Trau DAt có tiềm ứng dụng cho q trình lên men thu khí hydro từ vi khuẩn phân lập Việt Nam
Từ khóa: hydro sinh học, lên men kị khí, điều kiện ni cấy, Việt Nam 1 MỞĐẦU
(2)Nhiều cơng trình khoa học loại vi khuẩn có khả tạo khí hydro bao gồm giống vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt như Clostridium, Thermotoga hay giốngvi hiếu khí Enterobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Bacillus, Citrobacter, Caldicellulosiruptor, Ethanologenbacterium [6, 7, 8, 9, 10, 11] Các chủng vi khuẩn tạo hydro nhờ phản ứng 2H+ + 2e- H2 có xúc tác enzym hydrogenase Mỗi chủng vi khuẩn khác có khả tạo khí hydro điều kiện tối ưu khác [6, 12] Ở Việt Nam,
nhóm nghiên cứu chúng tơi cơng bố kết phân lập định danh số chủng vi khuẩn có khả tạo khí hydro [13, 14] Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho vi khuẩn tạo khí hydro chủng vi khuẩn ưa nhiệt Trau DAt điều kiện ni cấy kị khí nhằm định hướng cho q trình lên men thu khí hydro từ vi khuẩn ưa nhiệt làm nguồn lượng mới, bền vững
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu, môi trường điều kiện ni cấy
Vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau DAt thuộc sưu tập chủng giống Phịng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Cơng nghệ sinh học Sử dụng hóa chất cao men, cao thịt, pepton (Merck), glucose (Việt Nam), hóa chất cịn lại KH2PO4, K2HPO4, KCl… (Trung Quốc) cho q trình ni cấy lên men vi khuẩn tạo khí hydro
Môi trường NMV (g/L ml/L) (pH 6,5) bao gồm: glucose 10; cao men 3; cao thịt 1; pepton 1; NH4Cl 1; KH2PO4 0,5; K2HPO4 0,5; KCl 0,1; NaCl 1; CaCl2 0,1; MgSO4.7H2O 0,3; FeSO4.7H2O 0,1; L-cysteine-HCl.H2O 0,5; dung dịch vi lượng ml; dung dịch vitamin 1ml; vitamin C (100 ml/l) 0.5 ml; resazurin (0,2 %) ml Dung dịch vi lượng (g/L) gồm MnSO4.7H2O 1; ZnSO4.7H2O 5; H3BO3 1; CaCl2.2H2O 1; NiSO4 1,6; CuCl2.2H2O 1,5;EDTA Dung dịch vitamin (g/L) gồm có cyanocobalamin 1;riboflavin 2,5; sodium citrate 2; pyridoxine 0,5; folic acid 1; 4-aminobenzoic acid
Các thí nghiệm ni cấy tiến hành nhiệt độ 55 oC điều kiện kị khí Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả sinh khí hydro chủng Trau DAt thực bình thí nghiệm dung tích 150 ml với 150 ml dịch ni thành phần mơi trường, điều kiện nuôi cấy điều chỉnh tuỳ theo mục đích thí nghiệm Thí nghiệm lên men tĩnh sinh hydro quy mơ bình thí nghiệm tiến hành bình thí nghiệm dung tích 600 ml với 600 ml dịch lên men
2.2 Phương pháp
Xác định khả sinh trưởng chủng vi khuẩn đo mật độ quang tế bào (OD 660nm) máy Secoman (Pháp)
Xác định thể tích khí hydro phương pháp thay nước (water displacement method) Xác định hàm lượng đường tiêu thụ phương pháp tạo màu DNS (Miller, 1959) [15] Xác định chất lượng hàm lượng khí hydro máy sắc kí khí GC-TCD (Thermo Trace GC-Thermo Electro-USA) với phương pháp thử EDC VI-003 GC
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
(3)Chủng vi khuẩn Trau DAt sau phân lập tiến hành theo dõi động thái sinh trưởng, q trình tạo khí, hàm lượng đường tiêu thụ thơng qua theo dõi mật độ tế bào, thể tích khí tạo lượng đường cịn lại q trình ni cấy Kết quảở hình cho thấy, chủng Trau DAt bắt
đầu sinh trưởng tạo khí sau nuôi cấy Sau 24 giờ, chủng đạt sinh trưởng cực đại với lượng khí tạo thành 68 ml/150 ml dịch nuôi cấy Với lượng đường ban đầu 10 g/l, sau chủng bước vào pha cân tiêu thụ khoảng 7,69 g/l glucose Lượng glucose lại 2,31 g/l, ổn định với thể tích khí tạo sau pha cân Như vậy, trình sinh trưởng, trình tạo khí hàm lượng đường tiêu thụ có tương quan chặt chẽ, chủng vi khuẩn bước vào pha cân thể tích khí tạo ổn định đồng thời lượng glucose sử dụng giảm
Cùng với theo dõi động thái sinh trưởng q trình tạo khí, thành phần khí chủng vi khuẩn Trau DAt tạo xác định phân tích GC-TCD Kết hình cho thấy khí H2 chủng vi khuẩn tạo chiếm 42,95 %, lại CO2 H2S, phát có tương đồng với kết Romano cộng [10] Theo tác giả này, chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Thermoanaerobacterium thermostercus phân lập từ phân trâu có khả tạo khí H2 kèm theo khí CO2 H2S, tỉ lệ H2 H2S tạo khác sử dụng nguồn chất khử khác Sau xác định thành phần khí Trau DAt tạo lượng khí hydro tạo thành chiếm ti lệ lớn nhất, điều kiện ni cấy phù hợp cho q trình tạo khí chủng tiếp tục nghiên cứu nhằm dần bước tối ưa hố q trình tạo khí hydro chủng Trau DAt
Hình Động thái sinh trưởng, lượng đường tiêu thụ lượng khí tạo chủng Trau DAt
Hình Thành phần khí chủng Trau DAt tạo (từ trái qua phải phổ cao phổ H2, tiếp
theo phổ H2S, cuối phổ CO2)
3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đầu vào đến khả sinh trưởng tạo khí chủng Trau DAt
(4)10 % (kết khơng trình bày ởđây) Vì vậy, tỉ lệ tiếp giống 10 % phù hợp cho trình sinh trưởng tạo khí chủng vi khuẩn Kết tương đồng với nghiên cứu Alalaayah cộng sự, chủng Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 cũng cho thể tích khí H2 cao với tỉ lệ tiếp giống 10 % [6]
3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng tạo khí chủng Trau DAt
Các chủng vi khuẩn tạo khí hydro nghiên cứu sử dụng nguồn cacbon đa dạng cho trình tạo khí chúng [2, 5, 8, 12, 16] Để lựa chọn nguồn cacbon tốt cho q trình tạo khí H2 chủng Trau DAt, tiến hành nuôi cấy chủng nguồn nguồn cacbon khác saccharose, rỉ đường, glucose, mannose, galactose, trehalose, glycerol, tinh bột, cellulose (CMC), sau theo dõi q trình sinh trưởng, lượng khí tạo thời gian chủng phát triển đến pha cân Kết hình cho thấy, chủng Trau DAt tạo khí sinh trưởng nguồn cacbon glucose, mannose, galactose saccharose Tuy nhiên, với loại nguồn cacbon khác nhau, thời gian cho trình sinh trưởng khác lượng khí tạo khác Lượng khí cao thu chủng sinh trưởng glucose mannose Trên hai nguồn cacbon này, chủng Trau DAt cho thể tích khí tương đương Tuy nhiên, nguồn cacbon glucose chủng Trau DAt cần 26 giờđểđạt thể tích khí mật độ tế bào cao nhất, nguồn mannose, chủng cần 30 giờđểđạt thể tích khí mật độ tế bào cực đại Với nguồn cacbon galactose, thời gian để chủng đạt thể tích khí cao thời gian nguồn glucose (26 giờ), lượng khí tạo lại thấp so với hai nguồn bon glucose manose Với nguồn cacbon saccharose thời gian để chủng vi khuẩn Trau DAt sinh trưởng tạo khí kéo dài nhất, lên đến gần 40 Từ kết cho thấy với nguồn cacbon đường đôi, thời gian để chủng vi khuẩn sinh trưởng tạo khí dài đường đơn Kết thu phù hợp với kết luận Romano cộng hầu hết chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sử dụng glucose mannose tạo khí H2 [10] Như vậy, với thời gian nuôi cấy ngắn nhất, chủng Trau DAt tạo khí tốt nguồn cacbon glucose
Sau chọn nguồn cacbon glucose, tiến hành xác định hàm lượng glucose tối ưu cho trình tạo khí chủng Trau DAt Ni cấy chủng Trau DAt hàm lượng đường khác 1, 5, 10, 20, 40 g/l với tỉ lệ tiếp giống 10 %, thể tích khí theo dõi đến chủng
(5)Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau DAt
Hình Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau
DAt
3.4 Ảnh hưởng nguồn nitơđến khả sinh trưởng tạo khí chủng Trau DAt
Để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơđến q trình tạo khí H2, chủng Trau DAt nuôi nguồn nitơ khác pepton, cao thịt, cao men, NH4SO4, NH4NO3, NH4Cl, urê với nguồn cacbon glucose tỉ lệ tiếp giống 10 %, thể tích khí theo dõi đến chủng bước vào pha cân trình sinh trưởng Kết hình cho thấy, chủng Trau DAt tạo khí tốt nguồn nitơ cao men, tiếp đến nguồn cao thịt, nhiên chủng Trau DAt không tạo khí nguồn nitơ pepton nguồn nitơ vô khác Theo nhiều nghiên cứu, chủng vi khuẩn tạo khí H2 có khả sử dụng cao nấm men làm nguồn nitơ, ra, chủng vi khuẩn sử dụng nitơ vơ pepton cho q trình sinh trưởng tạo khí [17], chủng Trau DAt khơng có khả sử dụng riêng rẽ nguồn nitơ vơ cho q trình tạo khí hydro, nguồn nitơưa thích chủng cao men
Hình Ảnh hưởng nguồn nitơđến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau Dat
(6)Sau chọn nguồn nitơ cao men, hàm lượng tối ưu nguồn nitơ xác
định Tiến hành nuôi chủng Trau DAt hàm lượng cao men khác 1, 3, 5, 10, 15 g/l nguồn cacbon glucose, kết hình cho thấy chủng sinh trưởng tốt môi tường chứa g/l cao men Các chủng vi khuẩn tạo khí H2 khác sử dụng nguồn nitơ phù hợp với hàm lượng khác [6, 17] Chủng Trau DAt sinh trưởng tạo khí phù hợp nguồn nitơ cao nấm men với hàm lượng g/l
3.5 Ảnh hưởng hàm lượng sắt đến khả sinh trưởng tạo khí chủng Trau DAt Sắt có vai trò chất mang điện tử liên quan đến q trình oxi hóa pyruvat thành acetyl-CoA, CO2, H2 [8] Để nghiên cứu ảnh hưởng sắt đến q trình tạo khí, chủng vi khuẩn Trau DAt ni mơi trường có hàm lượng FeSO4.7H2O khác 0, 1, 5, 10, 100, 500, 1000 mg/l với nguồn cacbon glucose, nguồn nitơ cao men, tỉ lệ giống ban đầu 10 %, thể tích khí theo dõi đến chủng đạt pha cân Kết hình cho thấy, với hàm lượng FeSO4.7H2O nhỏ mg/l, thể tích khí tạo thấp Ở hàm lượng 10, 100 1000 mg/l FeSO4
7H2O thể tích khí tạo tương đương Thể tích khí chủng Trau DAt tạo nhiều nuôi cấy môi trường chứa 500 mg/l FeSO4.7H2O, Tuy nhiên thời gian cho chủng vi khuẩn vào pha cân dài, đến 28 so với thời gian 26 giờở hàm lượng nhỏ 10 mg/l FeSO4.7H2O Hàm lượng sắt mà chủng vi khuẩn sử dụng để tạo khí H2 cao nhiều so với chủng vi khuẩn nghiên cứu [6]
Hình Ảnh hưởng hàm lượng FeSO4 H2O đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng
Trau DAt
Hình Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau DAt
(7)sinh trưởng chủng Trau DAt 6,5, kết tương tự nhiều kết công bố [9, 10]
Hình Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau DAt
Hình 10 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng, tạo khí chủng Trau DAt
3.7 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng tạo khí hydro chủng Trau DAt
Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng tạo khí chủng Trau DAt tiến hành nồng độ NaCl khác nhau, 0, 0.5, 1, 2, 3, % với thể tích 150 ml dịch ni cấy ởđiều kiện 55 oC với yếu tốđã tối ưu Kết hình 10 cho thấy,
nồng độ NaCl cao thể tích khí tạo mật độ tế bào giảm Nồng độ NaCl % phù hợp cho trình tạo khí với thể tích khí tạo cao gần 80 ml /150 ml dịch
nuôi cấy Kết khác với kết qủa Romano cộng nghiên cứu [10]
3.8 Lên men tạo khí hydro chủng Trau DAt điều kiện môi trường phù hợp quy mơ bình thí nghiệm
Sau xác định điều kiện môi trường phù hợp, tiến hành lên men chủng Trau DAt quy mơ bình thí nghiệm (hình 11) Thể tích khí, hàm lượng đường tiêu thụ mật độ tế bào
được theo dõi đến chủng phát triển vào pha cân (hình 12) Tổng thể tích khí hydro thu