Giáo trình Ứng dụng công nghệ gene trong chăm sóc sức khỏe người: Phần 1

Rất nhiều các trình tự điều hòa phiên mã có thể nằm ở vị trí cách xa gene khoảng một vài kb cả về hai phía tính từ vị trí bắt đầu phiên mã. Một vài trong số những trình tự nà[r]

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Khoa Cơng Nghệ Sinh Học

ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ GENE TRONG CHĂM SÓC

SỨC KHỎE NGƯỜI

Giảng viên: TS TRẦN HOÀNG DŨNG

Chương 1

CẤU TRÚC GENE, SỰ BIỂU HIỆN GENE VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA DI TRUYỀN

1. GIỚI THIỆU

Từ thuật ngữ “gene” đặt nhà thực vật học Đan Mạch Wilhelm Johannsen vào năm 1909, khái niệm gen mở Lúc đầu, gen cho thực thể trừu tượng khơng có ý nghĩa vật chất – cấu trúc Nó có ý nghĩa nhà tự nhiên học quan tâm đến di truyền biến đổi có lợi cung cấp vật liệu cho tiến hóa

Vào năm đầu thập niên 50, thí nghiệm Seymour Benzer locus rII T4 bacteriophage giúp định nghĩa gene dạng đơn vị chức năng, gọi “cistron” Khái niệm cistron mô tả cistron chuỗi DNA liên tục mã hóa cho polypeptide thông qua phiên mã RNA Nghiên cứu sâu Charles Yahofsky Harvey Itano cho giả thuyết “1 cistron-1 polypeptide” Khái niệm gene-protein xác định độc lập Sydney Brenner Charles Yanofsky mơ hình operon Francois Jacob Jacques Monod đưa vào năm đầu thập niên 60 tán thành khái niệm cistron Mơ hình operon giải thích phiên mã cistron điều hòa nào, mơ hình gene-protein chứng minh đột biến gene (cistron) gây biến đổi trình tự amino acid protein Vì vậy, mơ hình điều hịa biểu cistron (gene) thơng qua tương tác promoter-operator giúp thống khía cạnh cấu trúc chức gene thành khái niệm gene

Khái niệm gene xem xét lần thông qua khám phá độc lập công bố vào năm 1977 Phillip Sharp Richard Roberts, theo sau chuỗi công bố tương tự Những khám phá chứng minh gene không thiết tồn chuỗi DNA liên tục mà cịn tồn cách ngắt quãng: vùng mã hóa gene (cistron) bị ngắt quãng trình tự khơng mã hóa xen kẽ (intron) Gene phiên mã cho chuỗi dài gọi “heterogeneous nuclear RNA” (hnRNA) hay “tiền-mRNA” (pre-mRNA) Việc xử lý “tiền-mRNA” liên quan đến ba kiện: gắn mũ chụp (capping), polyadenyl hóa cắt nối (splicing) Gắn mũ chụp gắn thêm “mũ” (m7G)

vào base mRNA đầu 5′; polyadenyl hóa việc gắn thêm chuỗi dài nucleotide Adenyl (khoảng 200-250 eukaryote) vào đầu 3′ mRNA; cắt nối (splicing) việc loại bỏ đoạn intron tạo thành mRNA trưởng thành Những vùng gene có diện tiên-mRNA mà không diện mRNA trưởng thành gọi “intron”, đoạn diện mRNA trưởng thành gọi “exon” Thuật ngữ exon intron đưa Walter Gilbert

intron gene prokaryote số eukaryote Thuật ngữ “cistron” thay thuật ngữ “khung đọc mở” (ORF)

Cùng với hiểu biết ngày cao cấu trúc chức gene, q trình điều hịa phiên mã, sau phiên mã, dịch mã sau dịch mã, có nhiều khám phá đầy bất ngờ, thách thức khái niệm gene phần Một vài số khám phá gene tái cấu trúc, promoter khác thường, giai đoạn khác cắt nối khác thường bao gồm exon bên cạnh intron, gene chồng lấp (nested genes), trans-splicing mRNA, xếp RNA (RNA editing) cắt nối protein (protein splicing) nhấn mạnh tính lưu động cấu trúc gene eukaryote vượt qua khỏi mơ hình exon-intron Quan điểm truyền thống tương ứng đối gene, mRNA trình tự polypeptide khơng cịn chủ đề phổ biến nữa; thích hợp với nhiều gen eukaryote tất

Mặc dù có nhiều ngoại lệ quan hệ trình tự gene-mRNA-polypeptide, mơ hình exon-intron mơ hình chủ yếu việc tìm hiểu cấu trúc phân tử chức gene eukaryote Bài tiểu luận thảo luận cấu trúc gene eukaryote điển hình biểu chúng

2. CẤU TRÚC GENE

Có thể định nghĩa gene tồn trình tự nucleic acid cần cho tổng hợp phân tử sản phẩm có chức (polypeptide hay RNA) Dựa vào định nghĩa này, gen bao gồm nhiều đoạn nucleotide mã hóa cho trình tự acid amin protein Một gen bao gồm trình tự DNA cần cho việc tổng hợp phân tử RNA Ở gen eukaryote, vùng điều khiển phiên mã gọi enhancer nằm vị trí cách vùng mã hóa 50 kb Những vùng khơng mã hóa quan trọng khác eukaryote trình tự đánh dấu cắt đầu 3′ polyadenyl hóa, gọi vùng poly (A), đánh dấu cắt nối (splicing) đoạn RNA phiên mã, gọi vùng cắt nối Đột biến tín hiệu chế biến RNA làm ngăn chặn biểu mRNA chức ngăn chặn biểu polypeptide Mặc dù hầu hết gene phiên mã mRNA mã hóa cho protein, nhiên rõ ràng số trình tự DNA phiên mã thành RNA khơng mã hóa cho protein (ví dụ, tRNA rRNA) Tuy nhiên, DNA mã hóa cho tRNA rRNA gây kiểu hình đặc biệt bị đột biến, nên vùng DNA thường quy gene tRNA rRNA, sản phẩm cuối chúng khơng phải protein Ngồi cịn có nhiều loại RNA khác phiên mã từ gene không mã hóa protein

2.1.Monocistron – Polycistron

eukaryote monocistron, nghĩa phân tử mRNA mã hóa cho protein Sự khác mRNA monocistron polycistron tương ứng với khác trình dịch mã chúng (sẽ nói rõ phần sau)

Trong phân tử mRNA polycistron vi khuẩn, vùng gắn ribosome nằm gần vị trí bắt đầu vùng mã hóa protein, hay cistron mRNA Sự khởi dịch mã bắt đầu vị trí vị trí này, sản xuất nhiều loại protein khác (hình 1a) Tuy nhiên hầu hết mRNA eukaryote, cấu trúc đầu mũ chụp 5′ thị cho gắn vào ribosome dịch mã bắt đầu vị trí codon AUG gần (hình 1b)

Hình 1: So sánh cấu trúc gene, phiên mã dịch mã prokaryote và eukaryote

(a) Operon tryptophan (tryp) E.coli gồm gene (màu xanh dương) mã hóa cho enzyme cần thiết cho tổng hợp tryptophan Toàn operon được phiên mã từ promoter thành phân tử mRNA dài liên tục (màu đỏ) Sự dịch mã mRNA bắt đầu vùng khác nhau, tạo protein khác (màu xanh lá) Trật tự gene nhiễn sắc thể vi khuẩn song song tương ứng với thứ tự chức liên tiếp protein mã hóa con đường tổng hợp tryptophan.

2.2.Intron – Exon

Khác với gene không chứa intron vi khuẩn nấm men, hầu hết gene động vật thực vật đa bào chứa đoạn intron loại bỏ suốt trình chế biến mRNA Trong nhiều trường hợp, đoạn intron gene dài đáng kể so với exon Ví dụ, gene mã hóa cho protein có kích thước trung bình chứa khoảng 50.000 cặp base, 95% intron vùng không mã hóa đầu 5′ 3′ Nhiều phân tử protein lớn sinh vật bậc cao có domain lặp lại, mã hóa gen bao gồm đoạn exon tương tự lặp lặp lại xen kẽ đoạn intron có chiều dài biến thiên

2.3.Sự tổ chức gene DNA khơng mã hóa nhiễm sắc thể

Bộ gene nhiều sinh vật chứa nhiều DNA không chức So sánh ban đầu tổng DNA nhiễm sắc thể tế bào nhiều loài gợi ý đa số DNA sinh vật không mã hóa cho RNA hay có chức cấu trúc hay điều hịa rõ ràng Ví dụ nấm men, ruồi giấm, gà người nhận thấy có lượng DNA nhiễm sắc thể tương ứng với cấp độ phức tạp chúng (lượng DNA 12; 180; 1300; 3300 Mb) Tuy nhiên, số động vật có xương, lồi có lượng DNA tế bào lớn lại lưỡng cư -những lồi chắn phức tạp so với người cấu trúc lẫn hành vi Rất nhiều lồi thực vật có số lượng DNA nhiều đáng kể so với người Ví dụ tulip có số lượng DNA gấp 10 lần so với người Ngoài ra, lượng DNA tế bào biến thiên đáng kể lồi có quan hệ gần gũi với

Hình 2: So sánh mật độ gene vùng ≈ 80 kb người nấm men

[Phần (a), xem F S Collins S M Weissman, 1984,Prog Nucl Acid Res Mol Biol.31:315; phần (b), xem S.G Oliver cs, 1992,Nature357:28.]

Sự khác đáng kể lượng DNA không chức sinh vật đơn bào đa bào áp lực chọn lọc khác suốt trình tiến hóa Ví dụ như, vi sinh vật cần phải cạnh tranh lượng chất dinh dưỡng có giới hạn mơi trường, việc kiểm sốt trao đổi chất đặc điểm then chốt Vì tổng hợp DNA khơng chức cần có nhiều thời gian lượng có lẽ có áp lực chọn lọc để loại bỏ DNA không chức suốt q trình tiến hóa vi sinh vật Mặt khác, chọn lọc tự nhiên loài động vật có xương phần lớn dựa vào hành vi chúng Năng lượng đầu tư vào việc tổng hợp DNA không đáng kể so với lượng trao đổi chất cần cho vận động bắp cơ; có áp lực chọn lọc để loại bỏ DNA không chức

2.4.Cấu trúc gene mã hóa protein điển hình eukaryote

Hình 3: Cấu trúc gene eukaryote điển hình

Trên hình thể mạch sense, mạch khn, TATA box, vị trí mũ chụp (vị trí bắt đầu phiên mã), tín hiệu poly(A) (AATAAA DNA AAUAAA RNA), vị trí cho nhận ghép nối intron (GT…AG DNA; GU…AG RNA), như quá trình chế biến tiền-mRNA Trên hình cho thấy đoạn exon phần nhỏ ở đầu 5′ đoạn exon đoạn khơng mã hóa, chúng cấu tạo nên 5'-UTR.

2.4.1 Vùng phiên mã

Vùng phiên mã gene gồm phần: vùng 5′ không dịch mã (5′-UTR – 5′ -untranslated region), vùng mã hóa amino acid (còn gọi khung đọc mở hay ORF), vùng 3′ không dịch mã (3′-UTR)

5′→3′, mạch DNA khuôn RNA tổng hợp từ đối song song, nên vị trí promoter tự động xác định mạch DNA dùng làm mạch khn cho phiên mã

Sự biểu đầu 3′-UTR có liên quan đến mRNA gene Vùng 5′-UTR gene (và mRNA) tồn trình tự từ vị trí bắt đầu phiên mã (vùng mũ chụp) nucleotide trước codon khởi dịch mã (ATG mạch không phiên mã – sense strand DNA; AUG mRNA) Tương tự, vùng 3′-UTR gene (và mRNA) tồn trình tự bắt đầu sau codon kết thúc dịch mã (TAG/TGA/TAA mạch không phiên mã DNA; UAG/UGA/UAA mRNA) nucleotide trước đuôi poly(A) (hình 3) Do đó, hai vùng 5′- 3′-UTR gene bao gồm tất exon không mã hóa, phần khơng mã hóa exon gồm intron

2.4.2 Vùng cánh 5' gene 2.4.2.1 Promoter

Mơ hình operon đề xuất Jacob Monod đưa khái niệm promoter phần thiếu gene hay đơn vị phiên mã, nơi mà RNA polymerase gắn vào Với tiến kỹ thuật tạo dịng phân tử, người ta phân tích xác định nhiều trình tự promoter thơng qua phân tích xóa bỏ (deletion analysis) Đặc điểm quan trọng trình tự promoter chúng điều khiển khởi phiên mã gene đặc hiệu, vị trí chúng cố định tương đối so với vị trí bắt đầu phiên mã

Do phiên mã tiến hành theo chiều 5′→3′, RNA vừa tổng hợp có định hướng đối song song với mạch khn DNA nên vị trí promoter tự động định mạch hai mạch DNA gene phiên mã Có nhiều vùng promoter gọi “promoter trung tâm” (core/basal promoter), “promoter lân cận” (proximal promoter) “promoter ngoại biên” (distal promoter) dựa chức khoảng cách chúng so với điểm khởi đầu phiên mã Đôi lúc trình tự điều hịa phiên mã nằm vùng thượng nguồn promoter trung tâm gọi chung “trình tự promoter thượng nguồn” (upstream promoter elements) Ngồi promoter cịn có trình tự DNA khác đóng góp việc điều hịa biểu gene bao gồm enhancer, silencer, vùng điều khiển locus (LCR) trình tự cách ly (insulator elements)

với chúng) nằm xa phía thượng nguồn promoter lân cận Vùng promoter lân cận nơi gắn nhóm nhân tố phiên mã khác – nhân tố hoạt hóa phiên mã Những protein hoạt hóa tương tác với cấu trúc Một vài nhân tố hoạt hóa có tính đặc hiệu với mơ gọi “những nhân tố phiên mã đặc hiệu” “nhân tố hoạt hóa đặc hiệu mơ”

a) Promoter trung tâm

Promoter trung tâm trình tự tiếp giáp, dẫn dắt khởi đầu phiên mã xác RNA poly II Nó vị trí gắn RNA poly II GTF Thơng thường dài khoảng 35 cặp base kéo dài phía thượng nguồn lẫn hạ nguồn vị trí bắt đầu phiên mã (-35 đến +35) Promoter trung tâm chứa hai hay nhiều số motif sau: hộp TATA , trình tự khởi đầu (Inr) trình tự promoter hạ nguồn (DPE)

b) Promoter lân cận

Promoter lân cận dài khoảng 250 cặp base kéo dài hai phía vị trí bắt đầu phiên mã (-250 đến +250) Tuy nhiên, theo tài liệu, trình tự xa -250 phía thượng nguồn gọi “trình tự promoter lân cận” Thơng thường nơi gắn nhân tố phiên mã đặc hiệu nhân tố hoạt hóa Hai trình tự hoạt hóa phiên mã nằm promoter gồm hộp CAAT hộp GC Hộp CAAT gắn nhân tố phiên mã NF-I (nuclear factor I, gọi NF-Y, CTF CBF), nằm vị trí khoảng nucleotide 75 phía thượng nguồn tính từ vị trí bắt đầu phiên mã có trình tự thỏa hiệp GG(T/C)CAATCT Hộp GC có trình tự thỏa hiệp GGGCGG, nằm vị trí nucleotide 90 phía thượng nguồn tính từ vị trí bắt đầu phiên mã, nơi gắn nhân tố phiên mã Sp1 (specificity protein 1) Hộp CAAT GC hoạt động giống trình tự enhancer chúng hoạt hóa phiên mã đặt hai hướng bên promoter lân cận

c) Promoter ngoại biên

Thuật ngữ “promoter ngoại biên” dùng để trình tự nằm xa phía thượng nguồn promoter trung tâm Có nhiều ví dụ kết hợp promoter lân cận promoter ngoại biên việc điều hòa phiên mã Cả hai promoter gene thể đặc hiệu mô chứa nhiều trình tự điều hịa phiên mã đặc biệt, nhận biết nhân tố phiên mã đặc hiệu mô

Ngồi ra, trình tự bên intron đóng vai trị khơng thể thiếu việc điều hòa tăng cường phiên mã gọi trình tự giống promoter bên intron (Salguerro S cs, 2000) Nhóm tác giả cho vài intron có đặc điểm tương tự promoter,như trình tự giống TATA, hộp CAAT

2.4.2.2 Các trình tự điều hịa khác (Enhancer, Silencer, LCR, Insulator)

chứa trình tự nhận biết nhiều loại protein gắn DNA đặc hiệu với trình tự có liên quan đến điều hòa phiên mã

a) Enhancer Silencer

Enhancer giúp tăng cường tốc độ phiên mã cách tăng cường vận dụng promoter Chúng vị trí gắn nhân tố hoạt hóa phiên mã đặc hiệu Một đoạn enhancer điều khiển phiên mã nhiều gene theo kiểu không phụ thuộc vào vị trí chiều hướng Những trình tự enhancer nằm vị trí gần với vị trí bắt đầu phiên mã, phía thượng nguồn lẫn hạ nguồn chí cịn nằm bên intron Hộp CAAT GC đề cập trình tự enhancer đóng vai trị khơng thể thiếu promoter lân cận hầu hết gene Người ta cho enhancer đem nhân tố hoạt hóa gắn vào tương tác với nhân tố phiên mã gắn với promoter cách uốn cong DNA Từ đó, chúng làm tăng nồng độ nhân tố hoạt hóa gần promoter nhân tố tương tác trực tiếp gián tiếp với promoter để khởi trình phiên mã

Ngược lại với enhancer silencer, chúng ức chế phiên mã cách gắn với nhân tố ức chế phiên mã, từ hoạt động yếu tố điều hịa âm Silencer hoạt động khơng phụ thuộc vào chiều, vị trí khoảng cách, chúng nằm bên intron

b) Vùng điểu khiển locus (LCR)

LCR (locus control region) loại trình tự tăng cường phiên mã khác LCR tăng cường phiên mã cụm gene liên kết với cách tạo hình dáng nhiễm sắc thể mở bên cạnh locus Từ đó, LCR tác động mạnh đến mức độ hoạt động vùng nhiễm sắc chất điển hình (euchromatic) nhiễm sắc thể LCR xác định locus β -globin người

c) Insulator

Insulator (trình tự cách ly) trình tự ranh giới gene quan trọng Khi gắn vào protein gắn insulator, chúng bảo vệ promoter khỏi tác động yếu tố điều hịa gần Insulator có hai dạng chức năng: chức ngăn chặn enhancer chức hàng rào dị nhiễm sắc chất (heterochromatin)

Chức ngăn chặn enhancer liên quan đến việc ngăn chặn tương tác enhancer promoter insulator nằm vị trí hai trình tự này, từ ngăn chặn hoạt hóa enhancer promoter Vì enhencer tác động đến nhiều promoter nên chức ức chế ngăn chặn tác động bừa bãi enhancer lên nhiều promoter bắt buộc chúng tác động lên promoter đặc hiệu

2.4.3 Vùng cánh 3' gene

Vùng cánh 3' gene kéo dài xa vùng 3'-UTR chứa tín hiệu kết thúc phiên mã

Ở vi khuẩn (prokaryote) có hai kiểu kết thúc phiên mã: phụ thuộc rho không phụ thuộc vào rho Kết thúc phiên mã khơng phụ thuộc rho cần có hai cấu trúc đặc trưng cần cho hai kiểu kết thúc: (i) trình tự tạo cấu trúc thịng lọng (stem-loop) (ii) vùng giàu U phía cuối cấu trúc thòng lọng Cấu trúc thòng lọng thường chứa vùng giàu GC nằm cách vùng giàu U khoảng 10 base Sự hình thành cấu trúc thịng lọng làm cho RNA poly ngừng lại, từ kết thúc phiên mã

Kết thúc phiên mã phụ thuộc vào rho phát khoảng phân nửa gene E coli Rho nhân tố kết thúc phiên mã gắn vào RNA, protein có hoạt tính helicase ATPase phụ thuộc RNA Vùng kết thúc phiên mã phụ thuộc vào rho thường giàu C nghèo G Trong suốt trình phiên mã, nhân tố rho gắn lên RNA kéo dài vị trí dài khoảng 75 nucleotide phía thượng nguồn vùng kết thúc phiên mã Sử dụng hoạt tính ATPase nó, rho di chuyển dọc theo RNA có lẽ với vận tốc nhanh RNA pol di chuyển mạch khuôn Khi RNA pol ngừng vị trí kết thúc, rho bắt kịp sử dụng hoạt tính helicase để tách đoạn mạch lai DNA-RNA, từ kết thúc phiên mã giải phóng RNA RNA pol

Ở Eukaryote người ta chưa biết nhiều kết thúc phiên mã Tuy nhiên người ta khái quát dựa hiểu biết Mỗi loại RNA pol sử dụng chế kết thúc phiên mã khác Đối với pol I III, việc dừng lại trình tự kết thúc vùng cánh 3' đóng vai trị quan trọng việc kết thúc phiên mã giải phóng RNA pol Những nhân tố giúp dừng phiên mã khơng thiết nhân tố giải phóng Những tín hiệu kết thúc nhân tố kết thúc giải phóng khác loài eukaryote khác

3. SỰ BIỂU HIỆN GENE

3.1.Đơn vị phiên mã

Ở vi khuẩn, đơn vị phiên mã bao gồm cụm gen tạo nên operon, phiên mã từ promoter xác định thành đoạn phiên mã Nói cách khác, ta phân biệt gene đơn vị phiên mã prokaryote Ngược lại, eukaryote hầu hết gene đơn vị phiên mã nhau, hai thuật ngữ thường sử dụng thay cho Tùy thuộc vào số phận đoạn phiên mã sơ cấp, đơn vị phiên mã eukaryote phân thành dạng: đơn vị phiên mã đơn giản đơn vị phiên mã phức tạp

và vùng điều hịa phiên mã ảnh hưởng đến biểu protein mã hóa đơn vị phiên mã đơn giản (hình 4)

Hình 4: Đơn vị phiên mã đơn (simple transcription unit)

Một đơn vị phiên mã đơn giản gồm vùng mã hóa cho protein, kéo dài từ mũ chụp đầu 5’ vùng poly(A) đầu 3’ vùng điều hịa có liên quan Các đoạn intron nằm xen kẽ đoạn exon (hình chữ nhật màu xanh) và được loại bỏ suốt trình chế biến tiền-mRNA khơng diện trên phân tử mRNA chức đơn cistron (monocistron) Những đột biến vùng điều hòa phiên mã (đột biến a, b) làm giảm hay ngăn chặn phiên mã, từ đó làm giảm hay xóa bỏ tổng hợp protein mã hóa Một đột biến bên trong đoạn exon (đột biến c) tạo protein bất thường Một đột biến bên trong đoạn intron (đột biến d) cho vị trí cắt nối mới, kết tạo mRNA bị cắt nối không bình thường, mã hóa cho protein chức năng.

Hình 5: Đơn vị phiên mã phức (complex transcription unit)

Đơn vị phiên mã phức tạo đoạn phiên mã sơ cấp chế biến theo nhiều cách khác nhau: (i) Nếu đoạn phiên mã sơ cấp có chứa vị trí cắt nối khác nhau, chế biến mRNA với exon ở đầu 5’ 3’ khác exon bên trong; (ii) Nếu đoạn phiên mã sơ cấp có hai vị trí poly(A), chế biến thành mRNA với exon đầu 3’ khác nhau; (iii) Nếu promoter khác (f g) kích hoạt những dạng tế bào khác nhau, mRNA1 - sản xuất dạng tế bào mà đó promoter f kích hoạt - có exon (1A) khác với mRNA2 - sản xuất ở một dạng tế bào khác mà promoter g kích hoạt exon 1B sử dụng thay cho 1A Những đột biến vùng điều hòa (a b) đột biến bên exon (c) giống mRNA khác có ảnh hưởng đến những protein mã hóa hai mRNA chế biến khác Ngược lại, đột biến bên đoạn exon (d e) khác mRNA khác có tác động ảnh hưởng đến protein mã hóa từ mRNA Đối với gene được

i)

ii)

phiên mã từ promoter khác dạng tế bào khác nhau, đột biến ở các vùng điều hòa khác (f g) có tác động ảnh hưởng dạng tế bào mà trong đoạn promoter hoạt hóa.

Hình mơ tả ba cách chế biến RNA khác xảy trình biệt hóa giới tính Drosophila Thơng thường mRNA tạo từ đơn vị phiên mã phức vài dạng tế bào, mRNA khác tạo dạng tế bào khác Ví dụ khác cách ghép nối đoạn phiên mã fibronectin sơ cấp tế bào fibroblast tế bào gan định liệu protein tiết có bao gồm domain đóng vai trị bám vào bề mặt tế bào hay khơng

Hình 6: Chuỗi điều hòa cắt nối điều khiển định đoạt giới tính phơi Drosophila

Chuỗi điều hịa cắt nối điều khiển định đoạt giới tính thơng qua biểu hiện gene sxl (sex-lethal), tra (transformer) và dsx (double-sex) phơi Drosophila Hình thể đoạn exon (hình chữ nhật) intron (đường gạch đen) - nơi xảy điều hòa cắt nối Đường đứt khúc màu đỏ thể cắt nối (splicing) tiền-mRNA tương tự đường màu xanh thể cắt nối ở con đực Đường dọc màu đỏ bên đoạn exon biểu thị codon stop bên trong khung đọc - ngăn chặn tổng hợp protein chức Chỉ phôi cái sản xuất proteinSxlchức - protein ức chế việc cắt nối exon và 3 tiền-mRNA sxl (a) exon tiền-mRNA tra (b) (c) Ngược lại, việc gắn mang tính điều phối proteinTra và hai proteinSR,Rbp1 và Tra2, hoạt hóa việc cắt nối exon và cắt/polyadenyl hóa An ở đầu 3’ của

Đối với trường hợp đơn vị phiên mã phức, quan hệ đột biến gene lúc trung thực hay trực tiếp Một đột biến vùng điều hòa hay đoạn exon mRNA khác ảnh hưởng đến tất protein khác mã hóa đơn vị phiên mã phức Mặt khác, đột biến exon diện số mRNA khác ảnh hưởng đến protein mã hóa mRNA

3.2.Sự phiên mã gene mã hóa protein hình thành mRNA chức năng

Khái niệm đơn giản gene “đơn vị DNA bao gồm thông tin định tổng hợp chuỗi polypeptide hay phân tử RNA chức (như tRNA).” Và phần lớn gene mang thơng tin để tạo nên phân tử protein, RNA gene mã hóa protein cấu thành nên phân tử mRNA tế bào Ở virus phân tử DNA chứa vài gene, động thực vật bậc cao phân tử DNA nhiễm sắc thể chứa đến vài ngàn gene

Q trình tổng hợp RNA (phiên mã) đơn giản chép lại ngôn ngữ gồm bốn base DNA bao gồm A, G, C T thành ngôn ngữ gồm bốn base tương tự RNA, trừ U thay cho T Mặt khác, trình tổng hợp protein phiên dịch lại ngôn ngữ thành ngôn ngữ 20 amino acid protein Dưới trình hình thành mRNA chức từ gene mã hóa protein điển hình

3.2.1 Sự polymer hóa ribonucleotide

Hình 7: Sự polymer hóa ribonucleotide RNA polymerase trình phiên mã

Các ribonucleotide gắn vào đầu 3' mạch RNA định bởi sự bắt cặp base mạch DNA khuôn ribonucleoside triphosphate (rNTP) bổ sung Một liên kết phosphodiester hình thành RNA polymerase xúc tác phản ứng 3' O mạch dài với α phosphate của rNTP bắt cặp xác Mạch RNA ln tổng hợp theo hướng 5' 

3' ngược lại với chiều phân cực mạch khuôn DNA.

3.2.1 Các giai đoạn phiên mã[1]

ribonucleotide chuỗi RNA nối với liên kết phosphodiester (bước 3)

Hình 8: Ba bước trình phiên mã

Trong suốt trình khởi phiên mã, RNA polymerase tạo nên bóng phiên mã bắt đầu polymer hóa ribonucleotide (rNTP) vị trí bắt đầu nằm bên vùng promoter Khi vùng DNA phiên mã, mạch lại đã tách phục hồi trở lại thành cấu trúc xoắn kép Đầu 5’ mạch RNA rời khỏi RNA polymerase thông qua rãnh bên enzyme Sự kết thúc dịch mã xảy polymerase gặp trình tự kết thúc đặc hiệu.

Sau vài ribonucleotide gắn vào, RNA pol tách khỏi promoter nhân tố phiên mã chung Trong suốt giai đoạn kéo dài mạch, RNA pol chạy dọc theo mạch DNA khuôn base một, đồng thời tháo gỡ mạch đơi DNA phía trước phục hồi mạch đơi phía vừa qua (bước 4) Lần lượt ribonucleotide thêm vào đầu 3' mạch RNA sinh giai đoạn kéo dài phiên mã polymerase Enzyme trì vùng tháo gỡ khoảng 14 cặp base, gọi bóng phiên mã Khoảng chừng nucleotide đầu

Kết thúc Khởi sự

Kéo dài

Bước 5: Tại vị trí ngừng phiên mã, polymerase giải phóng RNA hoàn thành rời khỏi DNA

Bước 4: Polymerase di chuyển theo chiều 3'5' mạch khuôn, tháo gỡ mạch đôi DNA gắn rNTP vào mạch RNA

Bước 2: Polymerase tháo gỡ mạch đôi DNA gần vị trí bắt đầu phiên mã tạo thành bóng phiên mã

3' mạch RNA tổng hợp vần bắt cặp base với mạch DNA khn bóng phiên mã Phức hợp kéo dài phiên mã bao gồm RNA polymerase, DNA khuôn mạch RNA dài Phức hợp ổn định

Trong trình kết thúc phiên mã, phân tử RNA hoàn thành, hay đoạn phiên mã sơ cấp, giải phóng khỏi RNA polymerase polymerase tách khỏi mạch khn DNA (bước 5) Những trình tự đặc biệt DNA khn tín hiệu cho RNA polymerase kết thúc phiên mã Sau giải phóng, RNA pol tự phiên mã cho gene lần gene khác

3.3.Biến đổi tiền-mRNA thành mRNA chức Eukaryote[1] [3]

Ở tế bào prokaryote khơng có nhân, dịch mã phân tử mRNA thành protein đầu 5' mRNA lúc đầu 3' tổng hợp RNA polymerase Nói cách khác, phiên mã dịch mã xảy đồng thời prokaryote Tuy nhiên, tế bào eukaryote nhân tách khỏi tế bào chất – nơi dịch mã xảy nên không gian hai trình phiên mã dịch mã khác Hơn đoạn phiên mã sơ cấp tiền-mRNA, cần phải trải qua vài biến đổi – gọi chung trình chế biến RNA để hình thành nên phân tử mRNA chức (RNA trưởng thành) Phân tử mRNA sau phải vận chuyển tế bào chất trước dịch mã thành protein Vì vậy, phiên mã dịch mã xảy đồng thời tế bào eukaryote

3.3.1 Gắn mũ chụp 5’[1] [3]

Đầu tiên, tất tiền-mRNA eukaryote biến đổi hai đầu nó, biến đổi giữ lại mRNA trưởng thành Tại đầu 5' chuỗi RNA vừa tách khỏi RNA pol II, tác động vài enzyme kết hợp tổng hợp nên mũ chụp 5', 7-methylguanylate liên kết với nucleotide cuối RNA liên kết 5', 5' triphosphate

Mũ chụp viết làm7Gppp, viết tắt m7G haym7G Cấu trúc mũ chụp m7G

Hình 9: Những cấu trúc mũ chụp mRNA eukaryote

Ở eukaryote bậc thấp, trình gắn mũ chụp tạo cap0 Ở eukaryote bậc cao, trình gắn mũ chụp tạo cap1 cap2 biến đổi như methyl hóa 2'-O ribose nucleotide tiền-mRNA, methyl hóa N6của base tiền-mRNA base adenine.

Những enzyme gắn mũ chụp đưa đến tiền-mRNA cách gắn vào domain đầu C (CTD) phosphoryl hóa RNA polymerase II (RNA pol II) Đi CTD chứa nhiều đoạn gồm peptide lặp lặp lại có tính bảo tồn cao với trình tự thỏa hiệp (consensus sequence) Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (YSPTSPS) Số lượng lặp lại biến thiên từ 26 nấm men đến 52 động vật có vú Năm số bảy amino acid motif thỏa hiệp điểm tiếp nhận phosphate, phosphoryl hóa biến đổi sau dịch mã chủ yếu đuôi CTDin vivo. Sự khả vào trình chế biến đoạn phiên mã tạo RNA pol I III cho đuôi CTD enzyme

3.3.2 Gắn đuôi poly(A)[1]

Sự biến đổi đầu 3' tiền-mRNA liên quan đến phân cắt endonuclease để có nhóm 3'-hydroxyl tự – vị trí gắn chuỗi adenylic acid enzyme poly(A) polymerase Kết tạo đuôi poly(A) khoảng 100-250 base động vật có xương Poly(A) polymerase phần phức hợp protein định vị phân cắt đoạn phiên mã vị trí đặc hiệu sau thêm vào adenyl theo q trình mà khơng cần có mạch khn

3.3.3 Cắt nối (splicing)[1]

Bước cuối trình biến đổi nhiều loại mRNA eukaryote cắt nối RNA (RNA splicing): trình cắt bỏ đoạn intron bên đoạn phiên mã tiếp sau q trình nối lại đoạn exon mã hóa

Hình 10: Tổng quan q trình chế biến RNA tạo RNA trưởng thành ở eukaryote

Gene β-globin chứa ba exon mã hóa protein (vùng mã hóa, màu đỏ) hai intron khơng mã hóa xen kẽ (màu xanh) Những đoạn intron làm đứt quãng trình tự mã hóa protein codon cho amino acid 31 32, 105 106 Sự phiên mã gene mã hóa protein eukaryote bắt đầu trước trình tự mã hóa cho amino acid kéo dài qua khỏi trình tự mã hóa cho amino acid cuối cùng, kết tạo vùng khơng mã hóa (màu xám) cuối đoạn phiên mã sơ cấp (tiền-mRNA) Những vùng không dịch mã (UTR) giữ lại suốt trình Đầu 5’ gắn thêm mũ chụp (m7Gppp) suốt trình hình thành đoạn phiên mã RNA Đoạn phiên mã kéo