Một số đặc tính sinh học của chủng tgev (transmissible gastroenteritis virus) và pedv (porcine epidemic diarhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ MINH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG TGEV (TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS) VÀ PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) DÙNG SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢC ĐỘC ĐA GIÁ Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Giáp NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu luận văn phần đề tài “Sản xuất vacxin nhị giá nhược độc phòng bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm (TGE) tiêu chảy cấp lợn (PED)”, triển khai thực Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam Tôi xin cam đoan số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực, xác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn TS Nguyễn Văn Giáp hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày 02 tháng11năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy Virus 2.1.1 Tình hình nghiên cứu PEDV, TGEV Việt Nam 2.1.2 Tình hình nghiên cứu giới 2.2 Giới thiệu chung virus gây tiêu chảy 11 2.2.1 Phân loại 11 2.2.2 Virus gây bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm 12 2.2.3 Virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn 18 2.3 Miễn dịch vacxin phòng bệnh 26 2.3.1 Miễn dịch chống PEDV, TGEV 26 2.3.2 Vacxin phòng bệnh PEDV, TGEV 27 Phần Nội dung - nguyên liệu - phƣơng pháp nghiên cứu 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian thực đề tài 31 3.3 Nội dung nghiên cứu 31 3.3.1 Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá PEDV TGEV 31 3.3.2 Đánh giá tính nhược độc lực chủng PEDV TGEV 31 iii 3.3.3 Đánh giá đặc tính ổn định di truyền hai chủng PEDV TGEV 31 3.4 Đối tượng - vật liệu nghiên cứu 31 3.4.1 Đối tượng nghiên cứu 31 3.4.2 Vật liệu nghiên cứu 31 3.5 Phương pháp nghiên cứu 32 3.5.1 Phương pháp xác định hiệu giá virus 32 3.5.2 Phương pháp kiểm tra tính nhược độc hóa virus 33 3.5.3 Phương pháp tách ARN 33 3.5.4 Phương pháp tổng hợp CDNA 34 3.5.5 Phương pháp realtime RT-PCR định lượng virus 34 3.5.6 Phương pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S) 36 3.5.7 Phương pháp phân tích trình tự gen 37 3.5.8 Phương pháp xử lý số liệu 37 Phần Kết thảo luận 38 4.1 Đặc tính ổn định hiệu giá chủng giống PEDV, TGEV 38 4.2 Đặc điểm nhược độc hóa chủng virus PEDV, TGEV 39 4.2.1 Triệu chứng lâm sàng lợn gây nhiễm 40 4.2.2 Biến đổi bệnh lý đại thể lợn gây nhiễm 42 4.2.3 Biến đổi bệnh lý vi thể ruột non lợn gây nhiễm 44 4.2.4 Kết nghiên cứu thải phân bố virus đường tiêu hóa 47 4.3 Đặc điểm ổn định di truyền chủng giống 49 4.3.1 Đặc điểm ổn định di truyền chủng PEDV 49 4.3.2 Đặc điểm ổn định di truyền chủng TGEV 52 Phần Kết luận kiến nghị 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Kiến nghị 56 Tài liệu tham khảo 57 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cytopathogenic effect cs Cộng DMEM Dulbecco's Modified Eagle’s Medium ELISA Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum M Membrane MOI Multiplicity of Infection N Nucleocapsid ORF Open Reading Frame ORF3 Open Reading Frame PBS Phosphate Buffer Saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction S Spike protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible Gastroenteritis TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus ST Swine testicular SK Swine kidney TPB Tryptose Phosphate Broth v DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 34 Bảng Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S PEDV 36 Bảng 3 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S TGEV 37 Bảng 4.1 Tổng hợp triệu chứng lợn nhiễm virus cường độc/ nhược độc 41 Bảng 4.2 Tổng hợp bệnh tích lợn nhiễm virus cường độc/ nhược độc 42 Bảng 4.3 Mức độ tương đồng nucleotide gen S PEDV 51 Bảng 4.4 Mức độ tương đồng amino acid protein S PEDV 51 Bảng 4.5 Sự thay đổi trình tự nucleotide amino acid PEDV 52 Bảng 4.6 Mức độ tương đồng nucleotide gen S TGEV 54 Bảng 4.7 Mức độ tương đồng amino acid protein S TGEV 54 Bảng 4.8 Sự thay đổi trình tự nucleotide amino acid TGEV 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân loại Coronavirus gây bệnh động vật 11 Hình 2.1 Cấu trúc gen TGEV 12 Hình 2.3 Sự thay đổi xóa gen tăng đột biến chủng TGEV 14 Hình 2.4 Thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm TGEV 15 Hình 2.5 Đường cong sinh trưởng TGEV tế bào PK - 15 16 Hình 2.6 Bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm virus tái tổ hợp 18 Hình 2.7 Cấu trúc gen PEDV 19 Hình 2.8 Bệnh tích tế bào PEDV gây trên tế bào Vero 22 Hình 2.9 CPE PEDV mang đột biến gen ORF3 23 Hình 2.10 Hiệu giá PEDV tồn bề mặt vật liệu theo thời gian 24 Hình 2.11 Bệnh tích đại thể vi thể lợn gây nhiễm PEDV 25 Hình 3.1 Ví dụ kết phản ứng SYBR Green realtime PCR 35 Hình 3.2 Phân tích melting curve để xác định độ đặc hiệu phản ứng 35 Hình Bệnh tích tế bào gây nhiễm PEDV TGEV 38 Hình Hiệu giá chủng PEDV TGEV lần tiếp đời 39 Hình Triệu chứng lợn nhiễm virus cường độc nhược độc 40 Hình 4 Bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm virus 43 Hình Bệnh tích vi thể lợn gây nhiễm PEDV 45 Hình Bệnh tích vi thể lợn gây nhiễm TGEV 46 Hình Sự thải phân bố virus đường tiêu hóa 47 Hình Giản đồ giải trình tự gen S PEDV TGEV 49 Hình Cây phát sinh chủng loại PEDV dựa vào trình tự gen S 50 Hình 10 Cây phát sinh chủng loại TGEV dựa vào trình tự gen S 53 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Minh Tên luận văn:“Một số đặc tính sinh học chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Đánh giá đă ̣c tính ổn định hiệu giá giố ng virus vacxin - Đánh giá tính nhược độc hai chủng giố ng virus - Đánh giá đặc tính ổ n đinh ̣ di truyền hai chủng giố ng virus Nguyên liệu: chủng virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130); lợn sơ sinh âm tính PEDV, TGEV; hóa chất dùng realtime RT-PCR định lượng tương đối Phƣơng pháp nghiên cứu Chuẩn độ virus phương pháp pha loãng tới hạn; phương pháp gây bệnh thực nghiệm; phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối; phân tích đặc điểm sinh học phân tử dựa vào phần mềm tin sinh học BioEdit, MEGA Kết kết luận Giống virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130) có hiệu giá ổn định, với mức dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ ml (PEDV) 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ ml (TGEV) Giống virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130) nhược độc lợn giai đoạn mẫn cảm Trong vòng 20 lần tiếp đời, chủng giống virus AVAC/VR/PED.98 AVAC/VR/TGE.15 có tính ổn định trình tự gen định kháng ngun viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Minh Thesis title: Some biological properties of TGEV (transmissible gastroenteritis virus) and PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) used for production of attenuated vaccine Major:Veterinary Medicine Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives - To determine the stability of viral titer - To investigate attenuated properties of the two viral strains - To study the genetic stability of the two viral strains Materials and Methods Materials:virus strains of AVAC/VR/PED.98 (the passage 100th) and AVAC/VR/TGE.15 (the passage 130th); neonatal pigs which were negative for both PEDV and TGEV; reagents for relative quantitative realtime RT-PCR Method: the endpoint dilution method was applied for virus titration; reproduction of disease by challenging test; the 2-ΔΔCT methodwas applied for relative quantitative realtime RT-PCR of virus load on intestinal tract and shedding; bioinformatic tools such as BioEdit, MEGA were implemented for genetic characterization Main findings and conclusions - The virus strains of AVAC/VR/PED.98 (P100) and AVAC/VR/TGE.15 (P130) had stable titer in the range of 7.1 - 7.5 log10 TCID50/ ml (PEDV) and 8.5 - 8.7 log10 TCID50/ ml (TGEV) - AVAC/VR/PED.98 (P100) and AVAC/VR/TGE.15 (P130) were confirmed to be attenuated by challenge test - AVAC/VR/PED.98 and AVAC/VR/TGE.15 exhibit genetic stability for 20 times serial passages ix Hình 10 Cây phát sinh chủng loại TGEV dựa vào trình tự gen S Ghi chú: chủng giống TGEV vacxin (lần tiếp đời 130) mũi tên đầy màu đen Các chủng virus tiếp đời xung quanh đời 130 đánh dấu màu xanh nhạt 53 Bảng 4.6 Mức độ tƣơng đồng nucleotide gen S TGEV Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P100 0,997 P120 0,997 0,999 P130 0,997 0,999 P140 0,997 0,999 1 P150 0,997 0,999 1 P140 Kết phân tích cho biết trình tự nucleotide gen S TGEV nhược độc (đời 120 trở đi) có sai khác so với chủng TGEV độc lực (P5), với mức tương đồng 0,997 Các chủng TGEV từ lần tiếp đời 130 đến 150 giống hồn tồn trình tự nucleotide gen S (mức tương đồng 1) Từ đời 100, xuất đột biến nucleotide dẫn tới mức tương đồng so chủng giống (đời 130) 0,999 (vùng đóng khung, bảng 4.6) Chúng tơi tiếp tục phân tích trình tự amino acid suy diễn để làm rõ chất thay đổi nucleotide đời (bảng 4.7) Bảng 4.7 Mức độ tƣơng đồng amino acid protein S TGEV Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P100 0,995 P120 0,994 0,999 P130 0,994 0,999 P140 0,994 0,999 1 P150 0,994 0,999 1 P140 Mức tương đồng trình tự amino acid lần tiếp đời P100 so với lần tiếp đời sau P120-P150 giống với mức tương đồng dựa vào trình tự nucleotide (bảng 4.6), chứng tỏ đột biến nucleotide đột biến câm (silent mutation) Đáng lưu ý, 54 cácn lần tiếp đời từ P120 đến P150, không thấy đột biến nucleotide amino acid TGEV Kết phân tích tồn chiều dài gen S xác định vị trí đột biến trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Sự thay đổi trình tự nucleotide amino acid TGEV Lần tiếp đời Vị trí nu/ aa P5 64-66/ TTT /22 P100 P120 P130 P140 P150 > TCT TCT TCT TCT TCT F > S S S S S 289-291/ TGG > TCG TCG TCG TCG TCG /97 W > S S S S S 622-624/ TTT TTT > ATT ATT ATT ATT /208 F F > I I I I 1267-1269/ ACT > AGT AGT AGT AGT AGT /423 T > S S S S S 1303-1305/ TTA > TTC TTC TTC TTC TTC /435 L > F F F F F 1321-1323/ ATG > ATT ATT ATT ATT ATT /441 M > I I I I I 1366-1368/ GTC > TTC TTC TTC TTC TTC /446 V > F F F F F 1504-1506/ TGT > TTT TTT TTT TTT TTT /502 C > F F F F F Ghi chú: dấu “>“ biểu thị biến đổi nucleotide amino acid vị trí lần tiếp đời Khác với chủng giống PEDV, từ chủng giống đời P130, tiếp tục tiếp đời đến đời P150 không dẫn tới đột biến làm thay đổi trình tự amino acid mã hóa Nói cách khác, chủng giống TGEV ổn định di truyền vòng 20 lần tiếp đời kể từ đời P130 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Về đặc tính ổn định hiệu giá: Giống virus AVAC/VR/PED.98và AVAC/VR/TGE.15 có đặc tính ổn định hiệu giá, với mức dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ ml (PEDV) 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ ml (TGEV) Về đặc tính nhƣợc độc: - Chủng giống AVAC/VR/PED.98 AVAC/VR/TGE.15 không gây bệnh cho lợn chí giai đoạn mẫn cảm - So với chủng virus cường độc, chủng virus nhược độc nhân lên cách hạn chế đường tiêu hóa thời gian thải qua phân chậm Về đặc tính ổn định di truyền: Trong vịng 20 lần tiếp đời, chủng giống virus AVAC/VR/PED.98 AVAC/VR/TGE.15 có tính ổn định trình tự gen định kháng ngun 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu đặc tính chủng giống AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130) khía cạnh: (i) đặc tính nhược độc lợn nái lợn thịt; (ii) đặc tính sinh miễn dịch khả bảo hộ chéo với chủng virus lưu hành Việt Nam 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Huỳnh Minh Trí, Nguyễn Hồng Việt Nguyễn Ngọc Hải, (2017) Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp (porcine epidemic diarhea virus - PEDV) heo nái xác định yếu tố nguy liên quan đến bệnh PED tỉnh Tiền Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 52 tr 1-7 Lê Văn Phan, Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Bá Hiên, (2015) Một số đặc điểm sinh học phân tử virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn (porcine epidemic diarrhea - PED) Quảng Trị, Thái Nguyên Thái Bình từ năm 2013 - 2014 Tạp chí Khoa học Phát triển 13 (7) tr 1089-1100 Nguyễn Tất Toàn Đỗ Tiến Duy (2012) Đặc trưng kiểu gen virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) heo số tỉnh miền Đông Nam Bộ Khoa học Kĩ thuật Thú y 19 (7) tr 34-41 Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang Lâm, Trịnh Đình Thâu Ngơ Thị Hạnh, (2018) Nghiên cứu phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus PED (porcine epidemic diarrhea virus) Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 16 (3) tr 257-267 Nguyễn Văn Điệp, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa R Yamaguchi (2014) Một số đặc điểm dịch tễ bệnh lý bệnh tiêu chảy thành dịch heo số tỉnh phía Bắc Việt Nam Khoa học Kĩ thuật Thú y 21 (2) tr 43-55 Vũ Thị Lan Hương, (2007) Nghiên cứu tình hình phơi nhiễm virus transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) rotavirus (RV) lợn phương pháp Ab-ELISA Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp I II Tài liệu tiếng Anh: An Kang, Liurong Fang, Rui Luo, Dang Wang, Lilan Xie, Jing Yang, Huanchun Chen and Shaobo Xiao, (2014) Quantitative proteomic analysis reveals that transmissible gastroenteritis virus activates the JAK-STAT1 signaling pathway Journal of proteome research 13 (12) pp 5376-5390 57 Barrera Maritza, Ana Garrido-Haro, Mar Vaca, #xed, a S., Danilo Granda, Alfredo Acosta-Batallas, #xe9 and Lester J rez, (2017) Tracking the Origin and Deciphering the Phylogenetic Relationship of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Ecuador BioMed Research International 2017 Bernard Serge and Hubert Laude, (1995) Site-specific alteration of transmissible gastroenteritis virus spike protein results in markedly reduced pathogenicity Journal of general virology 76 (9) pp 2235-2241 Bernasconi C, F Guscetti, A Utiger, K van Reeth, M Ackermann and A Pospischil, 1995: Experimental infection of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus: clinical, histopathological and immunohistochemical findings Immunobiology of viral infections Proceedings 3rd Congress of the European Society for Veterinary Virology Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994 pp 542-546 Foundation Marcel Merieux Bohl Edward H and Linda J Saif, (1975) Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: immunoglobulin characteristics of antibodies in milk after inoculating virus by different routes Infection and immunity 11 (1): 23-32 Boonsoongnern Prapassorn, Alongkot Boonsoongnern, Urai Pongchairerk and Tanatpon Paompa, (2018) The comparison of villous damage at different ages of piglets infected with porcine epidemic diarrhea virus Chiang Mai Veterinary Journal 16 (1) pp 37-46 Callebaut P, P Debouck and M Pensaert, (1982) Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea Veterinary microbiology (4) pp 295-306 Carvajal Ana, Ignacio Lanza, Rafael Diego, Pedro Rubio and Pedro Cámenes, (1995) Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (1) pp 60-64 Chang Sun-Hwa, Jong-Lye Bae, Tae-Jin Kang, Ju Kim, Gook-Hyun Chung, ChaeWoong Lim, Hubert Laude, Moon-Sik Yang and Yong-Suk Jang, (2002) Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus Molecules and cells 14 (2) pp 295-299 58 10 Chang Y C., C F Kao, C Y Chang, C R Jeng, P S Tsai, V F Pang, H Y Chiou, J Y Peng, I C Cheng and H W Chang, (2017) Evaluation and Comparison of the Pathogenicity and Host Immune Responses Induced by a G2b Taiwan Porcine Epidemic Diarrhea Virus (Strain Pintung 52) and Its Highly CellCulture Passaged Strain in Conventional 5-Week-Old Pigs Viruses (5) 11 Chen Qi, Ganwu Li, Judith Stasko, Joseph T Thomas, Wendy R Stensland, Angela E Pillatzki, Phillip C Gauger, Kent J Schwartz, Darin Madson and Kyoung-Jin Yoon, (2014) Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States Journal of clinical microbiology 52 (1) pp 234-243 12 Choe Se-Eun, Kee-Hwan Park, Seong-In Lim, Nguyen Ba Hien, Pham Ngoc Thach, Byung-Hyun An, Song Hee Han, In-Soo Cho and Dong-Jun An, (2016) Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus strain from Vietnam, HUA14PED96, with a large genomic deletion Genome Announc (1): e00002-00016 13 Cubero M J., S Bernard, L Leon, P Berthon and A Contreras, (1992) Pathogenicity and antigen detection of the Nouzilly strain of transmissible gastroenteritis coronavirus, in 1-week-old piglets Journal of Comparative Pathology 106 (1) pp 61-72 14 De Arriba ML, A Carvajal, J Pozo and P Rubio, (2002) Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses and protection in conventional pigs exposed to virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus veterinary immunology and immunopathology 85 (1-2) pp 85-97 15 Debouck P and M Pensaert, (1980) Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus, CV 777 American journal of veterinary research 41 (2) pp 219-223 16 Deng Feng, Gang Ye, Qianqian Liu, Muhammad Navid, Xiaoli Zhong, Youwen Li, Chunyun Wan, Shaobo Xiao, Qigai He and Zhen Fu, (2016) Identification and comparison of receptor binding characteristics of the spike protein of two porcine epidemic diarrhea virus strains Viruses (3) pp 55 17 Diep N V., M Sueyoshi, U Izzati, N Fuke, A P P Teh, N T Lan and R Yamaguchi, (2018) Appearance of US-like porcine epidemic diarrhoea virus 59 (PEDV) strains before US outbreaks and genetic heterogeneity of PEDVs collected in Northern Vietnam during 2012-2015 Transbound Emerg Dis 65 (1) e83-e93 18 Doyle LP and LM Hutchings, (1946) A transmissible gastroenteritis in pigs Journal of the American Veterinary Medical Association 108 pp 257-259 19 Furuuchi Susumu, Yukio Shimizu and Tetsuo Kumagai, (1979) Multiplication of low and high cell culture passaged strains of transmissible gastroenteritis virus in organs of newborn piglets Veterinary Microbiology (3) pp 169-178 20 Gerber Priscilla F., Chao-Ting Xiao, Kelly Lager, Kimberly Crawford, Vikas Kulshreshtha, Dianjun Cao, Xiang-Jin Meng and Tanja Opriessnig, (2016) Increased frequency of porcine epidemic diarrhea virus shedding and lesions in suckling pigs compared to nursery pigs and protective immunity in nursery pigs after homologous re-challenge Vet Res 47 (1) pp 118-118 21 Goede Dane, Michael P Murtaugh, Joel Nerem, Paul Yeske, Kurt Rossow and Robert Morrison, (2015) Previous infection of sows with a “mild” strain of porcine epidemic diarrhea virus confers protection against infection with a “severe” strain Veterinary microbiology 176 (1-2) pp 161-164 22 Hall T.A., (1999) BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser 41 pp 95-98 23 Have P, V Moving, V Svansson, Åse Uttenthal and B Bloch, (1992) Coronavirus infection in mink (Mustela vision) Serological evidence of infection with a coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus Veterinary microbiology 31 (1) pp 1-10 24 Hofmann Martin and Robert Wyler, (1988) Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture Journal of clinical microbiolog y 26 (11) pp 2235-2239 25 Hofmann Martin and Robert Wyler, (1989) Quantitation, biological and physicochemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) Veterinary microbiology 20 (2) pp 131-142 26 Hou Y and Q Wang, (2019) Emerging Highly Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus: Molecular Mechanisms of Attenuation and Rational Design of Live Attenuated Vaccines Int J Mol Sci 20 (21) pp 5478 60 27 Huang Yao-Wei, Allan W Dickerman, Pablo Piñeyro, Long Li, Li Fang, Ross Kiehne, Tanja Opriessnig and Xiang-Jin Meng, (2013) Origin, evolution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States MBio (5) e00737-00713 28 Kemeny LJ, (1976) Antibody response in pigs inoculated with transmissible gastroenteritis virus and cross reactions among ten isolates Canadian Journal of Comparative Medicine 40 (2) pp 209 29 Kemeny LJ, VL Wiltsey and JL Riley, (1975) Upper respiratory infection of lactating sows with transmissible gastroenteritis virus following contact exposure to infected piglets The Cornell Veterinarian 65 (3) pp 352-362 30 Kim B and C Chae, (2002a) Experimental Infection of Piglets with Transmissible Gastroenteritis Virus: a Comparison of Three Strains (Korean, Purdue and Miller) Journal of Comparative Pathology 126 (1) pp 30-37 31 Kim Okjin and Chanhee Chae, (2002b) Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs Canadian journal of veterinary research 66 (2) pp 112 32 Kim Seong-Hee, Jung-Min Lee, Jongsun Jung, In-Joong Kim, Bang-Hun Hyun, Hyun-Il Kim, Choi-Kyu Park, Jae-Ku Oem, Yeon-Hee Kim and Myoung-Heon Lee, (2015) Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Korea from 1998 to 2013 Archives of virology 160 (4) pp 1055-1064 33 Kim Yonghyan, Venkatramana Krishna, Montserrat Torremorell, Sagar Goyal and Maxim Cheeran, (2018) Stability of Porcine Epidemic Diarrhea Virus on Fomite Materials at Different Temperatures Veterinary sciences (1) pp 21 34 Krempl Christine, Beate Schultze, Hubert Laude and Georg Herrler, (1997) Point mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus Journal of Virology 71 (4) pp 3285-3287 35 Kumar S., G Stecher and K Tamura, (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol Evol 33 (7) pp 1870-1874 61 36 Kusanagi Ko-ichi, Hiroyoshi Kuwahara, Tetsuo Katoh, Tetsuo Nunoya, Yoshihisa Ishikawa, Togo Samejima and Masanori Tajama, (1992) Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate Journal of Veterinary Medical Science 54 (2) pp 313-318 37 Kweon Chang-hee, Byung-joon Kwon, Tae-sung Jung, Young-jin Kee, Dong-ho Hur, Eui-kyung Hwang, Jae-chin Rhee and Soo-hwan An, (1993) Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea Korean Journal of Veterinary Research 33 (2) pp 249-254 38 Laude Hubert, Jacqueline Gelfi, Laurence Lavenant and Bernard Charley, (1992) Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus Journal of virology 66 (2) pp 743-749 39 Laude Hubert, Denis Rasschaert, Bernard Delmas, Murielle Godet, Jacqueline Gelfi and Bernard Charley, (1990) Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus Veterinary microbiology 23 (1-4) pp 147-154 40 Lee S., Y Kim and C Lee, (2015) Isolation and characterization of a Korean porcine epidemic diarrhea virus strain KNU-141112 Virus Res 208 215-224 41 Lee S., K Y Son, Y H Noh, S C Lee, H W Choi, I J Yoon and C Lee, (2017) Genetic characteristics, pathogenicity, and immunogenicity associated with cell adaptation of a virulent genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus Vet Microbiol 207 pp 248-258 42 Leidenberger S., C Schroder, L Zani, A Auste, M Pinette, A Ambagala, V Nikolin, H de Smit, M Beer and S Blome, (2017) Virulence of current German PEDV strains in suckling pigs and investigation of protective effects of maternally derived antibodies Sci Rep (1) pp 10825 43 Li Y., G Wang, J Wang, K Man and Q Yang, (2017) Cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus strain Zhejiang08 provides effective immune protection attributed to dendritic cell stimulation Vaccine 35 (50) pp 7033-7041 44 Ma Ruili, Yanming Zhang, Haiquan Liu and Pengbo Ning, (2014) Proteome profile of swine testicular cells infected with porcine transmissible gastroenteritis coronavirus PloS one (10): e110647 62 45 Madson D M., P H Arruda, D R Magstadt, E R Burrough, H Hoang, D Sun, L P Bower, M Bhandari, P C Gauger, G W Stevenson, B L Wilberts, C Wang, J Zhang and K J Yoon, (2016) Characterization of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Isolate US/Iowa/18984/2013 Infection in 1-Day-Old CesareanDerived Colostrum-Deprived Piglets Vet Pathol 53 (1) pp 44-52 46 Martelli P, A Lavazza, AD Nigrelli, G Merialdi, LG Alborali and MB Pensaert, (2008) Epidemic of diarrhoea caused by porcine epidemic diarrhoea virus in Italy Veterinary Record 162 (10) pp 307-310 47 Miller L C., K K Crawford, K M Lager, S G Kellner and S L Brockmeier, (2016) Evaluation of two real-time polymerase chain reaction assays for Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) to assess PEDV transmission in growing pigs J Vet Diagn Invest 28 (1) pp 20-29 48 Nguyen Tien Dung, Elisabeth Bottreau, Serge Bernard, Isabelle Lantier and Jean Marie Aynaud, (1986) Neutralizing secretory IgA and IgG not inhibit attachment of transmissible gastroenteritis virus Journal of general virology 67 (5) pp 939-943 49 Nguyen V P and B G Hogue, (1997) Protein interactions during coronavirus assembly J Virol 71 (12) pp 9278-9284 50 Oh Jongsuk, Kyung-Won Lee, Hwan-Won Choi and Changhee Lee, (2014) Immunogenicity and protective efficacy of recombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein Archives of virology 159 (11) pp 2977-2987 51 Pan Yongfei, Xiaoyan Tian, Wei Li, Qingfeng Zhou, Dongdong Wang, Yingzuo Bi, Feng Chen and Yanhua Song, (2012) Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China Virology journal (1) pp 195 52 Park Seong-Jun, Hyoung-Joon Moon, Yuzi Luo, Hye-Kwon Kim, Eun-Mi Kim, Jeong-Sun Yang, Dae-Sub Song, Bo-Kyu Kang, Chul-Seung Lee and Bong-Kyun Park, (2008) Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild-and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses Virus genes 36 (1) pp 95-104 53 Peng J Y., C Y Chang, C F Kao, Y C Chang, C S Hsueh, C R Jeng, I C Cheng, V F Pang, P S Tsai and H W Chang, (2018) Different intestinal tropism of the G2b Taiwan porcine epidemic diarrhea virus-Pintung 52 strain in conventional 7-day-old piglets Vet J 237 69-75 63 54 Pensaert MB and P De Bouck, (1978) A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine Archives of virology 58 (3) pp 243-247 55 Pineyro P E., M I Lozada, L V Alarcon, R Sanguinetti, J A Cappuccio, E M Perez, F Vannucci, A Armocida, D M Madson, C J Perfumo and M A Quiroga, (2018) First retrospective studies with etiological confirmation of porcine transmissible gastroenteritis virus infection in Argentina BMC Vet Res 14 (1) pp 292 56 Puranaveja Suphasawatt, Pariwat Poolperm, Preeda Lertwatcharasarakul, Sawang Kesdaengsakonwut, Alongkot Boonsoongnern, Kitcha Urairong, Pravina Kitikoon, Porjit Choojai, Roongtham Kedkovid and Komkrich Teankum, (2009) Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus, Thailand Emerging infectious diseases 15 (7) pp 1112 57 Rao Xiayu, Xuelin Huang, Zhicheng Zhou and Xin Lin, (2013) An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis Biostat Bioinforma Biomath (3) pp 71-85 58 Saif Linda J, (1993) Coronavirus immunogens Veterinary microbiology 37 (3-4) pp 285-297 59 Saif Linda J and EH Bohl, (1983) Passive immunity to transmissible gastroenteritis virus: intramammary viral inoculation of sows Annals of the New York Academy of Sciences 409 pp 708-723 60 Sato Tetsuo, Natsumi Takeyama, Atsushi Katsumata, Kotaro Tuchiya, Toshiaki Kodama and Ko-ichi Kusanagi, (2011) Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of virulence in vivo Virus genes 43 (1) pp 72-78 61 Shi Wen, Shuo Jia, Haiyuan Zhao, Jiyuan Yin, Xiaona Wang, Meiling Yu, Sunting Ma, Yang Wu, Ying Chen, Wenlu Fan, Yigang Xu and Yijing Li, (2017) Novel Approach for Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) Strain NJ Using Porcine Intestinal Epithelial Cells Viruses (1) pp 19 62 Shibata Isao, Masaaki Ono and Masahumi Mori, (2001) Passive protection against porcine epidemic diarrhea (PED) virus in piglets by colostrum from immunized cows Journal of Veterinary Medical Science 63 (6) pp 655-658 63 Shibata Isao, Tomoyuki Tsuda, Masahumi Mori, Masaaki Ono, Masuo Sueyoshi and Katsuyoshi Uruno, (2000) Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages Veterinary microbiology 72 (3-4) pp 173-182 64 64 Sirinarumitr Theerapol, Prem S Paul, John P Kluge and Patrick G Halbur, (1996) In situ hybridization technique for the detection of swine enteric and respiratory coronaviruses, transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine respiratory coronavirus (PRCV), in formalin-fixed paraffin-embedded tissues Journal of virological methods 56 (2) pp 149-160 65 Song DS, JS Oh, BK Kang, Jeong Sun Yang, HJ Moon, Han Sang Yoo, YS Jang and BongKyun Park, (2007) Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain Research in veterinary science 82 (1) pp 134-140 66 Stevenson Gregory W, Hai Hoang, Kent J Schwartz, Eric R Burrough, Dong Sun, Darin Madson, Vickie L Cooper, Angela Pillatzki, Philip Gauger and Beverly J Schmitt, (2013) Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences Journal of veterinary diagnostic investigation 25 (5) pp 649-654 67 Sueyoshi M, T Tsuda, K Yamazaki, K Yoshida, M Nakazawa, K Sato, T Minami, K Iwashita, M Watanabe and Y Suzuki, (1995a) An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhoea Journal of comparative pathology 113 (1) pp 59-67 68 Sueyoshi M., T Tsuda, K Yamazaki, K Yoshida, M Nakazawa, K Sato, T Minami, K Iwashita, M Watanabe, Y Suzuki et al., (1995b) An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhoea J Comp Pathol 113 (1) pp 59-67 69 Sun Dongbo, Li Feng, Hongyan Shi, Jianfei Chen, Xiaochen Cui, Hongyan Chen, Shengwang Liu, Youen Tong, Yunfeng Wang and Guangzhi Tong, (2008) Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein Veterinary microbiology 131 (1-2) pp 73-81 70 Sun Dongbo, Hongyan Shi, Donghua Guo, Jianfei Chen, Da Shi, Qinghe Zhu, Xin Zhang and Li Feng, (2015) Analysis of protein expression changes of the Vero E6 cells infected with classic PEDV strain CV777 by using quantitative proteomic technique Journal of virological methods 218 27-39 71 Sun Rui-Qin, Ru-Jian Cai, Ya-Qiang Chen, Peng-Shuai Liang, De-Kun Chen and Chang-Xu Song, (2012) Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China Emerging infectious diseases 18 (1) pp 161 65 72 Thomas J T., Q Chen, P C Gauger, L G Gimenez-Lirola, A Sinha, K M Harmon, D M Madson, E R Burrough, D R Magstadt, H M Salzbrenner, M W Welch, K J Yoon, J J Zimmerman and J Zhang, (2015) Effect of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infectious Doses on Infection Outcomes in Naive Conventional Neonatal and Weaned Pigs PLoS One 10 (10): e0139266 73 Tuboly Tamás and Éva Nagy, (2001) Construction and characterization of recombinant porcine adenovirus serotype expressing the transmissible gastroenteritis virus spike gene Journal of General Virology 82 (1) pp 183-190 74 Vui Dam Thi, Nguyen Tung, Ken Inui, Steven Slater and Dachrit Nilubol, (2014) Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Vietnam Genome Announcements (4): e00753-00714 75 Wang Chengbao, Jianfei Chen, Hongyan Shi, Huaji Qiu, Fei Xue, Changming Liu, Yuanmao Zhu, Shengwang Liu, Fernando Almazán and Luis Enjuanes, (2010) Molecular characterization of a Chinese vaccine strain of transmissible gastroenteritis virus: mutations that may contribute to attenuation Virus genes 40 (3) pp 403-409 76 Wang Di, Xinna Ge, Dongjie Chen, Jie Li, Yueqi Cai, Jin Deng, Lei Zhou, Xin Guo, Jun Han and Hanchun Yang, (2018) The S Gene Is Necessary but Not Sufficient for the Virulence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Novel Variant Strain BJ2011C Journal of Virology 92 (13): e00603-00618 77 Wang Gang, Rui Liang, Ziwei Liu, Zhou Shen, Jiale Shi, Yuejun Shi, Feng Deng, Shaobo Xiao, Zhen F Fu and Guiqing Peng, (2019) The N-Terminal Domain of Spike Protein Is Not the Enteric Tropism Determinant for Transmissible Gastroenteritis Virus in Piglets Viruses 11 (4) pp 313 78 Weingartl Hana M and J Brian Derbyshire, (1994) Evidence for a putative second receptor for porcine transmissible gastroenteritis virus on the villous enterocytes of newborn pigs Journal of virology 68 (11): 7253-7259 79 Won Hokeun, Dong-Uk Lee, Guehwan Jang, Yun-Hee Noh, Seung-Chul Lee, Hwan-Won Choi, In-Joong Yoon, Han Sang Yoo and Changhee Lee, (2019) Generation and protective efficacy of a cold-adapted attenuated genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus Journal of veterinary science 20 (4) 80 Wongthida Phonphimon, Benjamas Liwnaree, Nanchaya Wanasen, Jaraspim Narkpuk and Anan Jongkaewwattana, (2017) The role of ORF3 accessory protein 66 in replication of cell-adapted porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) Archives of virology 162 (9) pp 2553-2563 81 Wu Y., W Li, Q Zhou, Q Li, Z Xu, H Shen and F Chen, (2019) Characterization and pathogenicity of Vero cell-attenuated porcine epidemic diarrhea virus CT strain Virol J 16 (1) pp 121 82 Xu Xingang, Honglei Zhang, Qi Zhang, Jie Dong, Yabing Liang, Yong Huang, Hung-Jen Liu and Dewen Tong, (2013a) Porcine epidemic diarrhea virus E protein causes endoplasmic reticulum stress and up-regulates interleukin-8 expression Virology journal 10 (1) pp 26 83 Xu Xingang, Honglei Zhang, Qi Zhang, Yong Huang, Jie Dong, Yabing Liang, Hung-Jen Liu and Dewen Tong, (2013b) Porcine epidemic diarrhea virus N protein prolongs S-phase cell cycle, induces endoplasmic reticulum stress, and upregulates interleukin-8 expression Veterinary microbiology 164 (3-4): 212-221 84 Ye Shiyi, Zhonghua Li, Fangzhou Chen, Wentao Li, Xiaozhen Guo, Han Hu and Qigai He, (2015) Porcine epidemic diarrhea virus ORF3 gene prolongs S-phase, facilitates formation of vesicles and promotes the proliferation of attenuated PEDV Virus genes 51 (3) pp 385-392 85 Zhang Dan, Xiaobo Huang, Xiaohui Zhang, Sanjie Cao, Xintian Wen, Yiping Wen, Rui Wu and Entao Liang, (2016) Construction of an oral vaccine for transmissible gastroenteritis virus based on the TGEV N gene expressed in an attenuated Salmonella typhimurium vector Journal of virological methods pp 227 6-13 86 Zhang Xinsheng, Mustafa Hasoksuz, David Spiro, Rebecca Halpin, Shiliang Wang, Sarah Stollar, Daniel Janies, Nagesh Hadya, Yuxin Tang and Elodie Ghedin, (2007) Complete genomic sequences, a key residue in the spike protein and deletions in nonstructural protein 3b of US strains of the virulent and attenuated coronaviruses, transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus Virology 358 (2) pp 424-435 87 Zuo Yuzhu, Jinghui Fan, Huixia Fan, Tanqing Li and Xiaobo Zhang, (2009) Prophylactic and therapeutic effects of egg yolk immunoglobulin against porcine transmissible gastroenteritis virus in piglets Frontiers of agriculture in China (1) pp 104-108 67 ... 31 3.3.1 Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá PEDV TGEV 31 3.3.2 Đánh giá tính nhược độc lực chủng PEDV TGEV 31 iii 3.3.3 Đánh giá đặc tính ổn định di truyền hai chủng PEDV TGEV 31 3.4... sinh học chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá? ?? Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện... lập chủng virus thực địa đồng thời đánh giá đặc tính sinh học virus để sản xuất vacxin cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Một số đặc tính sinh học chủngTGEV (transmissible