Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới panaxsp thu ở phong thổ lai châu

Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành BỘ GIÁO DỤC VIỆN KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -o0o - ĐỖ MINH THÀNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA LOẠI SÂM MỚI PANAXSP THU Ở PHONG THỔ LAI CHÂU Ngành: Sinh học thực nghiệm Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ Giáo viên hƣớng dẫn: TS Phan Kế Long Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành MỞ ĐẦU Nhân sâm dùng y học phương Đông hàng ngàn năm Người Trung Quốc sử dụng nhân sâm từ hàng ngàn năm trước thứ dược liệu vơ chân q có vua chúa quan lớn có loại thảo dược Tác dụng nhân sâm đề cập trước tác Shi You (khoảng năm 48-33 TCN) hay Shanghan Lun (khoảng năm 200 SCN) Chi Nhân sâm (Panax L.) chi nhỏ họ Ngũ gia bì (Araliaceae) gồm 15 lồi [14], tất có giá trị làm thuốc, số lồi thuộc chi Panax L (Araliaceae) sử dụng làm giá trị cao Nhân sâm (Panax ginseng), Tam thất (Panax notoginseng) Ở Việt Nam, có số lồi thuộc chi Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus), Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) [11] Các loài Panax bipinnatifidus thường phân bổ chủ yếu Trung Quốc, Ấn Độ Nepal Các lồi tình trạng nguy cấp, vốn gặp tự nhiên lại bị săn tìm riết để thu hái nên bị đe dọa tuyệt chủng Ở Việt Nam sâm Ngọc Linh xác định thuốc quý có chứa nhiều thành phần saponin, hàm lượng acid amin, chất khoáng vi lượng củ, rễ hẳn loại sâm khác [16] Do vùng phân bố hạn chế việc khai thác mức khiến sâm Ngọc Linh rơi vào nhóm đe dọa loài bị coi tuyệt chủng tự nhiên tồn số vườn trồng khu bảo tồn số vườn trồng khu bảo tồn tỉnh Quảng Nam Kon Tum, việc nghiên cứu bảo tồn loài sâm cấp bách Cho đến sâm Ngọc Linh coi loài đặc hữu hẹp, phân bố núi Ngọc Linh thuộc địa phân hai tỉnh Quảng Nam Kon Tum với độ cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 1500m so với mặt biển [11], nhiên Zhu cộng [58] ghi nhận Panax vietnamensis có phân bố Vân Nam, Trung Quốc nên chúng tơi đặt khả lồi phân bố tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam Năm 2012, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam phê duyệt đề tài thuộc hướng KHCN ưu tiên cấp Viện KHCNVN “Nghiên cứu phân loại, phân bố thành phần hóa học Sâm mọc Lai Châu” mã số VAST 04.07/12-13 Tiến sĩ Phan Kế Long làm chủ nhiệm với mục đích xác định tên khoa học phân bố loài sâm mọc tự nhiên Lai Châu thành phần hóa học chủ yếu Vì chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích di truyền để định loại mẫu sâm dựa sở so sánh trình tự ITS – rDNA, vùng gen mang nhiều biến dị có khả bộc lộ quan hệ lồi có nguồn gốc tiến hóa gần gũi [56] Trên có sở dự án trên, chúng tơi tiến hành Luận văn thực sở phân tích số mẫu vật thu đợt điều tra khảo sát huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu dự án với với tiêu đề: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền loại sâm Panax sp huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sâm Panax sp (Araliaceae) huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu dựa sở so sánh trình tự ITS – rDNA, vùng gen mang nhiều biến dị có khả bộc lộ quan hệ lồi có nguồn gốc tiến hóa gần gũi Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu Sâm Panax sp từ huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu - Tách DNA tổng số mẫu, nhân vùng gen ITS – rDNA - Giải trình tự gen ITS – rDNA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành - Phân tích số liệu: so sánh, phân tích trình tự DNA mẫu thu so sánh với Panax vietnamsis Quảng Nam, loài chi Panax CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nghiên cứu chi sâm Panax Sâm Ngọc Linh 1.1.1 Giới thiệu chi sâm Panax Chi Nhân sâm (Panax L.) chi nhỏ họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn chi Sâm (Panax L.) giới biết chắn có 11 lồi loài (thứ -var.) Sự phân bố chi Panax L giới cho thấy chúng xuất Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đơng Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ Tây-Nam Canada (có lồi P quinquefolius P trifoliatus) [12, 42, 43] Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên Nhật Bản) có lồi P ginseng P japonica Trung tâm phân bố chi Panax L từ vùng Tây- Nam Trung Quốc lan toả xuống phía Bắc Việt Nam Thực chất khu vực gồm tỉnh biên giới kề Vân Nam (Trung Quốc) Lào Cai (Việt Nam), có tới lồi loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, loài trồng P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) P pseudoginseng (khơng tìm thấy hoang dại, giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya kết lai tự nhiên loài gần gũi đó) Đây coi trung tâm phân bố chi Sâm (Panax L.) giới Ở Bắc Mỹ có lồi (P notoginseng; P quinquefolius P trifoliatus) Giới hạn cuối phía Nam chi Panax L loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) Miền Trung Việt Nam, 14015’ vĩ độ Bắc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Hình 1.1: Nhân sâm Việt Nam – Panax vietnamensis 1.1.2 Hiện trạng loài Sâm Việt Nam Ở Việt nam thời điểm nay, chi Panax có chắn lồi, có loài nhập trồng Tam thất (P.notoginseng) Nhân sâm (P.ginseng) [12] Ba loài mọc tự nhiên đối tượng bảo tồn Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P stipuleanatus Tsai et Feng) đặc biệt Sâm Ngọc Linh (P vietnamensis Ha et Grushv.) loài đặc hữu hẹp miền trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum), Huyện Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), vùng núi Ngọc Linh, độ cao 1500m Tuy nhiên loài trở nên cực ngồi tự nhiên, tình trạng khai thác kiệt quệ nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp Hiện tại, sâm Ngọc Linh đưa vào danh lục đỏ IUCN (2003) danh sách loài hạn chế khai thác sử dụng mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31.03.2006 quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quí hiếm) Hiện sâm Ngọc Linh tập trung điểm bảo tồn Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng 10 hecta 1.1.3 Tầm quan trọng giá trị Sâm 1.1.3.1 Tầm quan trọng giá trị Sâm Thế giới Về mặt kinh tế, doanh thu hàng năm từ sâm vào khoảng 98 triệu USD tăng trưởng mức 26%/năm [57] Tập đoàn Sâm Hàn Quốc (KGC) có kinh nghiệm sản xuất hồng sâm 100 năm, tính riêng năm 2004 doanh thu từ sản phẩm nhân sâm mang cho tập đồn khoảng 305 tỷ Won ($290 triệu USD), 70% mỹ phẩm Cùng năm đó, xuất sản phẩm từ nhân sâm đạt 55 triệu USD, thị trường chủ yếu Hồng Kông Trung Quốc đại lục (27 triệu USD) [35] Virginia Tây Virginia nơi xuất sâm lớn Mỹ, chiếm khoảng 18% tổng số 27200 kg sản lượng sâm hàng năm tồn quốc Trong năm (2004-2006) ngành nơng nghiệp Mỹ chứng nhận việc xuất hàng năm tương ứng đạt 1800 kg, 2270 kg 1633 kg đem lại gần triệu USD [35] 1.1.3.2 Tầm quan trọng giá trị Sâm Việt Nam Tất lồi thuộc chi Panax có giá trị làm thuốc, số loài chi trở thành thuốc tiếng, không phạm vi y học cổ truyền phương Đông mà toàn giới Nhân sâm (Panax ginseng); Giả nhân sâm (P pseudoginseng); Tây dương sâm (P quiquefolius); Tam thất (P notoginseng) [5,17] sâm Ngọc Linh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành (P vietnamensis Ha et Grushv.) Ở Việt Nam, từ năm kháng chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán cách mạng hoạt động nằm vùng Quảng Nam đồng bào cho thuốc thứ thần dược để phòng thân đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn bệnh thông thường đau bụng, cầm máu vết thương Theo quan điểm hoá phân loại dược lý học, cơng trình nghiên cứu nhà khoa học giới chia 12 loài thuộc chi Panax thành nhóm chính: - Nhóm gồm lồi có giá trị, phát triển trồng trọt gồm: Nhân sâm (Panax ginseng), sâm Mỹ (P quinquefolius) Tam thất (P notoginseng), có phận mặt đất rễ củ dạng cà rốt phát triển chứa saponin có khung thuộc nhóm dammaran - Nhóm gồm lồi mọc hoang P japonicus, P zingiberensis, P stipuleanatus với phận thân rễ đất phát triển theo hướng nắm ngang, chứa saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean Tuy nhiên, hàm lượng saponin sâm Ngọc Linh so với lồi Panax trồng trọt thuộc nhóm lại cao nhiều Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc biệt với nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản cho thấy sâm Ngọc Linh có 52 hợp chất saponin, có 24 saponin xác định có cấu trúc hồn tồn mới, lần cơng bố Khi so sánh với nhóm sâm trồng có giá trị giới Nhân sâm (Panax ginseng), Sâm Mỹ (P quinquefolius) Tam thất (P notoginseng) thành phần saponin sâm Ngọc Linh giống với lồi nói trên, hàm lượng lại cao nhiều Điều khẳng định Sâm ngọc linh lồi độc đáo thành phần hố học [7] 1.2 Sâm Ngọc Linh 1.2.1 Đặc điểm phân loại Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Sâm Ngọc Linh loại thân thảo, sống nhiều năm, cao đến 1m Thân rễ mập có đường kính 3,5cm, khơng có rễ phụ dầy dự trữ, đơi số phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm Đốt thân rễ tồn 1-4 thân Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có mặt trịn có rãnh nhỏ theo chiều dọc Lá mọc vòng, thường có (ít 3, 5, 6) Lá kép chân vịt có (ít 6, 7) chét, dài 7- 12cm (ít 15 cm) Lá chét hình trứng ngược hình mũi mác, dài 8- 14 cm, rộng 3- cm, đầu thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5- cm, góc hình nêm, mép có cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít 8- 11) cặp dọc theo gân gân bên mặt chét có nhiều lơng cứng dạng gai dài đến mm, mặt Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5- lần chiều dài cuống lá, thường mang tán đơn độc tậ cùng, đơi có thêm 1- tán phụ hoa đơn độc Tán hoa đường kính 2,5- cm, có 50- 120 hoa Hoa mầu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3- mm Bầu ơ, vịi (chiếm 80%) đơi có ơ, vịi (chiếm 20%) Quả chín màu đỏ, thường có chấm đen đỉnh Quả hạt hình thân, hạt hình cầu dẹt dài 7- 10 mm rộng 4- mm (Hình 1.2) [1] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh Mọc tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C, sâm Ngọc Linh sống lâu, chí 100 năm, sinh trưởng chậm Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu thân rễ, củ ngồi dùng rễ Vào đầu tháng hàng năm, sâm xuất chồi sau mùa ngủ đơng, thân khí sinh lớn dần lên thành sâm trưởng thành có tán hoa Từ tháng đến tháng 6, nở hoa kết Tháng bắt đầu có chín kéo dài đến tháng Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, rụng, để lại vết sẹo đầu củ sâm bắt đầu giai đoạn ngủ đơng hết tháng 12 Chính vào vết sẹo đầu củ mùa đông đến mà người ta nhận biết sâm tuổi, phải năm tuổi tức củ có sẹo (sau năm đầu sâm rụng lá) khai thác, khuyến cáo năm tuổi Mùa đông mùa thu hoạch tốt phần thân rễ sâm [62] 1.2.2 Đặc điểm phân bố Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Cây sâm phát độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh khoảng 1.500m), đạt mật độ cao khoảng từ 1.700-2.000m tán rừng già, có hai tỉnh Kon Tum Quảng Nam có sâm Sâm mọc tập trung chân núi Ngọc Linh, núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ đá granit dày 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp rừng nguyên sinh rộng, nên gọi sâm Ngọc Linh, nghiên cứu thực địa cho thấy sâm mọc núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng có loại sâm [62] 1.2.3 Thành phần hóa học Từ 1974 đến 1990 Nguyễn Thời Nhâm cộng ghiên cứu nhân sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefollium) [1] Kết tóm tắt sau: Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) phát Panax vietnamensis (PV) 15 vết saponin có giá trị Rf mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin Panax ginseng Chi tiết PV có hàm lượng cao chất saponin kiểu damarane (7,58%), saponin thuộc diol triol có tỷ lệ 3,32% lượng nhỏ saponin axit oleanolic Do đặc điểm này, Tanaka xếp nhân sâm Việt Nam vào nhóm B- (Trước có nhân sâm triều Tiên nhân sâm Hoa Kỳ xếp vào nhóm này) [1] Điều trái lại với qui luật chung thông thường hân sâm cho thân rễ phát triển thường chứa lượng saponin axit oleanolic lượng nhóm saponin damarane 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 19 Asif MJ, Charles H (2005), “DNA extraction from processed wood a case study for the identification of endangered timber species (Gonystylus bancanus)”, Plant Molecular Biology Reporter 23, pp.185192 20 Ahlquist, Jon E., (1999), A commentary on 30 years of collaboration The Auk, vol 116, (3) 21 Andrianoelina O, Akotondraoelina H, Ramamonjisoa L, Maley J, Danthu P, Bouvet JM (2004), Genetic diversity of Dalbergia monticola (Fabaceae) an endangered tree species in the fragmented oriental forest of Madagascar Biodiversity and Conservation 15 (4): 1109 – 1128 22 Avise CJ (1992), Molecular population structure and the biogeographic history of regional fauna: a case history with lessons for conservation biology Oikos 63: 62-76 23 Avise CJ (1993), Molecular Markers Natural History And Evolution Publ House Chapman and Hall 82 24 Avise CJ (1995), Mitochondrial DNA polymorphism and a connection between genetics and demography of relevance to conservation Conservation Biology 9: 686-690 25 Alex C Wiedenhoeft & Regis B Miller (2002), “Brief comments on the Nomenclature of Softwood Axial Resin Canals and their associated Cells” USDA Forest Service, Forest Products Laboratory, USA 26 Ascensão L, Marques N, Pais MS (1995), “Glandular trichomes on vegetative and reproductive organs of Leonotis leonurus (Lamiaceae)” Annals of Botany 75: 619-626 27 Baldwin BG (1993), Molecular phylogenetics of Calycadenia (Compositae) based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA: chromosomal and morphological evolution reexamined American Journal Botany 80: 222238 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 28 Baldwin BG Sanderson MJ, Porter JM., et al (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny” Annals of the Missouri Botanic Garden 82: 247-277 29 Corbin KW, Ferguson A, Wilson AC, Brush AH, Ahlquist JE (1974) Genetic polymorphism in New Guinea starlings of the genus Aplonis Condor 76: 307-18 30 Densmore LD, Dessauer HC (1984), Low levels of protein divergece detected between Gavialis and Tomistoma: Evidence for crocodilian monophyly Biochemistry and Physiology 77: 715-720 31 Donoghue M J., Sanderson M J.(1992), “The suitability of molecular and morphological evidence in reconstructing plant phylogeny” Molecular systematics of plants New York, Chapman and Hall, pp 340- 368 32 Doug Piirto (1998), “Wood identification” Society of wood science and technololy, Washington 33 Doyle J J., Doyle J (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue” Phytochemical Bulletin 19, pp.1115 34 Eriksen B.(1993), “Floral anatomy and morphology in the Polygalaceae” Plant Systematics and Evolution 186, pp.17-32 28 35 Etherington, T and M Palermo (2006) "Products and Markets." Nonwood News 13: 1-91 36 Forest F., Manning J C.(2006), “Evidence for inclusion of South African endemic Nylandtia in Muraltia (Polygalaceae)” Systematic Botany 31, pp.525-532 37 Gurcharan singn plant systematics an integrated approach Sciencepublish, ers, inc: 144-150 38 I.Kertesz, W.E loomis&cs (2003), Chemical analysis of plant tissne, plant physiology American society of plant biologists, 383-386 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 39 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants” Proc Natl Acad Sci U.S.A 102(23), 8369-8374 40 Lecomte, H (Rédacteur) (1923), Flore Generale de I’ Indo-Chin, Vol 2, pp 479-496 41 Lee HL, Jansen RK, Timothy W, Kim CKJ (2007), Gene Relocations within Chloroplast Genomes of Jasminum and Menodora (Oleaceae) Are Due to Multiple, Overlapping Inversions Molecular Biology and Evolution 24 (5): 1161-1180 42 Linné, C (1735), Systema naturae, Leyden 43 Linné, C (1753), Species Plantarum, Stockholm 44 Miyamoto MM, Goodman M (1986), Biomolecular systematics of euthetian mammals: phylogenetic patterns and classification Systematics Zool 35: 230-240 45 Miyamoto MM, Koop BF, Slightom JL, Goodman M, Tennant (1988), Molecular systematics of higher primates: genealogical relationships and classification Proc Natl Acad Sci USA 85: 7627-763 46 Miyamoto MM, Koop BF, Slightom JL, Goodman M (1987), Phylogenetics relations of humans and African apes from DNA sequences in the vr@obin region Science 238: 369-373 47 Mort ME, Levsen N, Randle RP, Jaarseld EV, Palmer A, (2005), Phylogenetics and diversification of Cotyledon (Crassulaceae) inferred from nuclear and chloroplast DNA sequences data American Journal of Botany 92 (7): 1170-1176 48 Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco – Ortega J, Santons – guerra A (2001), Phylogenetics relationships and evolution of Crassulaceae inferred from matK sequence data American Journal of Botany 88: 7691 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 49 Michael J Plawa&cs, The plant cell/Microbe coincubation assay for the analysis of plant – activated promutagens, Mutation Research/Fudamertal and Molcular mechanisms of mutagenesis, 207219 50 Nicholas KB, Nicholas HBJ (1997) “GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation” EMBNEW.NEWS 4:14 51 Ronquist, F and Huelsenbeck, J.P MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models Bioinformatics (2003) 19, 1572-1574 52 Swofford, D.L PAUP* Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods) Version Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, (2003) 53 Thompson, J.D., Higgins, D.G and Gibson, T.J CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throught sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrice choice Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680 54 Tamura K, Dudley J, Nei M % Kumar S (2007), “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) sofware version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 10.1093/molbev/msm092 55 Tamura K, Peterson D, Peterson N, (2008)“MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods, pp.27312739 56 Wen, L and Zimmer, E.A (1996) Phylogeny and Biogeography of Panax (Araliaceae): Inference from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA Mol Phylogen Evol , 6, 166 – 177 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 57 Yun, T K., Y S Lee, et al (2002) "Active anticarcinogenic compounds in Panax ginseng CA Meyer." International Journal of Cancer: 305-305 58 Zhu, S., H Fushimi, Cai, S.Q., Chen, H.B and Komasu, K (2003) A New Variety of Genus Panax from Southern Yunan, China and Its Nucleotide Sequences of 18S Ribosomal RNA Gene and matK Gene J Jpn Bot., 78, 86-94 Tài liệu internet 59 DNeasy Plant Mini Kit http://www.qiagen.com/products/genomicdnastabilizationpurification/dnea syplantsystem/dneasyplantminikit.aspx 60 QIAquick Gel Extraction Kit http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaqu ickgelextractionkit.aspx#Tabs=t0 61 http://en.wikipedia.org/wiki/Maximum_parsimony_(phylogenetics) 62 http://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Phụ lục MỘT SỐ HÌNH ẢNH HÌNH THÁI VÀ MƠI TRƯỜNG SỐNG CỦA SÂM LAI CHÂU Hình Rừng mây mù đường đỉnh núi cao 1600 m, nơi sống Sâm lai châu 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Hình Rừng ngun sinh rậm thường xanh bị tác động đai núi trung bình (mây mù) rộng phát triển đá phiến sét, giàu mùn, ẩm, ánh sáng, nơi tìm thấy Sâm lai châu Hình Nơi sống sâm Lai Châu cịn non (có lá) tán rừng ẩm, giàu mùn, ánh sáng Hình Cụm hoa với hoa 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành A Hình Peak Lai Châu – paITS - F 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Hình Peak Lai Châu – paITS – R 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành B Hình Peak Ngọc Linh – paITS – F 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành Hình Peak Ngọc Linh – paITS – R Sau trì nh tƣ̣ các nucleotit của các loài nghiên cƣ́u >Panax vietnamensis clone LC1 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT GAACTGCGTGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAGAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CACATCGCGTCGCCCCCCAACTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGTGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTATTCTCATGTCG TGCGG >Panax vietnamensis clone LC2 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CGCATCGCGTCGCCCCCCAGCTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCCGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành >Panax vietnamensis clone LC3 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CGCATCGCGTCGCCCCCCAGCTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG >Panax vietnamensis clone LC4 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CGCATCGCGTCGCCCCCCAGCTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAACTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG >Panax vietnamensis clone LC5 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CGCATCGCGTCGCCCCCCAGCTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG >Panax vietnamensis clone NL AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAACT GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CGCATCGCGTCGCCCCCCAACTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG GGCCGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG >Panax vietnamensis clone NL AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCT GCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGG GTGCGCAAGCTCCCCAAGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGG CTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAAATCAAATT GAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAGAACAC AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA CACATCGCGTCGCCCCCCAACTCATCACTCCCTCACGGGAGTCGAGGCGGAGG 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành GGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCT TGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCG TGCGG 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... Nam 05 mẫu sâm thu huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu (sâm Lai Châu) Ký hiệu địa điểm thu thập 07 mẫu nghiên cứu trình bày bảng Hình 2.1 Thân rễ Sâm Lai Châu Bảng 2.1 Danh sách địa điểm thu thập 07... di truyền loại sâm Panax sp huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sâm Panax sp (Araliaceae) huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu dựa sở so sánh trình tự ITS – rDNA, vùng... có sở dự án trên, chúng tơi tiến hành Luận văn thực sở phân tích số mẫu vật thu đợt điều tra khảo sát huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu dự án với với tiêu đề: ? ?Nghiên cứu đặc điểm di truyền loại sâm