TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN H-NMR 13 C-NMR DEPT : Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) : Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) H -1H-COSY: 1H -1H- Correlated Spectroscopy ( Phổ tương tác proton) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhõn qua nhiều liên kết) IR : Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) ESI-MS : Electron Spray Ionisation - Mass Spectroscopy (Phổ khối bụi electron) SKLM : Sắc ký lớp mỏng DMSO : DiMethylSulfoxide TMS : Tetramethylsilan s : singulet s (br) : singulet tù d : dublet dd : dublet dublet dt : dublet triplet m: : multiplet t : triplet td : triplet dublet J (Hz) : Hằng số tương tác tớnh Hz δ (ppm) : Độ dịch chuyển hoá học tớnh ppm DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Số liệu phân đoạn thu chất tinh khiết .13 Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR chất A2 (500 MHz, CDCl 3) 16 Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR chất A4 (500 MHz, DMSO) 19 Bảng 3.1: Kết định lượng alcaloid toàn phần rễ Lỏ ngún .23 Bảng 3.2: Kết SKLM hệ dung môi Toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3] .26 Bảng 3.3: Kết phõn lập alcaloid sắc ký cột 28 MỞ ĐẦU Nguồn cỏ đất nước ta vô phong phú đa dạng Nú đó, trực tiếp gián tiếp góp phần giải nhu cầu đời sống ăn, mặc, ở, thuốc chữa bệnh, v.v Cùng với việc tìm hiểu để sử dụng mặt có lợi cỏ, từ lâu người ta quan tâm đến mặt trái vấn đề này, tác hại độc người động vật Lĩnh vực nghiên cứu độc, có liên quan đến giám định hố pháp vụ ngộ độc bị đầu độc cỏ Nhưng quan trọng mối liên hệ độc thuốc Người ta sử dụng nhiều độc để làm thuốc cà độc dược, mã tiền, đầu hoạt tính có tác dụng chữa bệnh dựng đỳng liều lượng bệnh đú cõy độc trở thành thuốc Ngược lại, số thuốc dùng khơng định gây độc cho người bệnh Sự nhầm lẫn thường xảy dẫn tới vụ ngộ độc đáng tiếc không nước sử dụng rộng rãi cỏ để làm thuốc nước ta, mà nhiều nơi giới Cõy Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) chứa hàm lượng alcaloid có độc tính mạnh [5] Hàng năm nước ta xảy nhiều vụ ngộ độc cõy Lỏ ngún sử dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát Theo thống kê Viện Pháp y Quốc gia, từ năm 2000 - 2004 số người tử vong ngộ độc cõy Lỏ ngún giám định húa pháp tỉnh miền Bắc 82 người Để đáp ứng yêu cầu giám định y pháp phục vụ công tác cấp cứu nạn nhân ngộ độc cõy Lỏ ngún trung tâm chống độc cần phải có chất chuẩn, phục vụ cho phương pháp phân tích Trong luận văn chúng tơi xin đóng góp phần vào việc chiết tách, tinh chế, xác định cấu trúc số hợp chất alcaloid rễ Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) Việt Nam Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương độc 1.1.1 Khái niệm độc Cây độc mà người hay động vật ăn phải, có lượng nhỏ, gây bệnh rối loạn thể, nặng chết [5] Số lượng độc trái đất khơng phải ít, đến người ta biết hàng nghìn lồi Số lồi thường tập trung vào nhóm hạt kín ngành Nấm Đặc biệt lớp Ngọc lan (cây hai mầm) có tỷ lệ độc cao lớp Hành (cây mầm) Các họ thực vật có nhiều độc họ Thầu dầu, họ Trúc đào, họ Cà, họ Đậu, họ Mã tiền v.v… Số loài độc vùng nhiệt đới nhiều cỏc vùng ôn đới hàn đới [5] Nước ta có thảm thực vật phong phú, có hàng trăm lồi độc nhiều loài nấm độc [5] Cỏc độc chia làm hai nhúm, nhúm cõy cú độc tính ổn định kéo dài suốt q trình sinh trưởng phát triển chúng (như ngón, trúc đào, cà độc dược…) nhúm cõy mà tính độc xuất giai đoạn định (như củ khoai tây, chất độc solanin xuất thời gian củ khoai tây nảy mầm tập trung mầm) [5] Các chất thường gặp cỏc cõy độc phong phú đa dạng, chủ yếu alcaloid, glycozit, acid hữu cơ, lacton, nhiều chất khác chưa nghiên cứu [5] Sự phân bố chất độc phận không nhau, chúng tích luỹ phần định như: tập trung hạt (thầu dầu, mã tiền), (thuốc phiện, hồi núi), (trúc đào, cà độc dược…), rễ (ô đầu, chỳt chớt…), nhựa mủ (nhựa sui, nhựa xương rồng…) Cá biệt cũn có tương phản điển hình cây, củ đậu: người ta dùng củ đậu để ăn, hạt có chất độc, gây chết người ăn phải lượng nhỏ [5] Trong trình phơi sấy chế biến cỏ làm thay đổi số tính chất chúng, vỡ cú chứa chất độc dễ bay Ngược lại, cỏc cõy độc chứa alcaloid, độc tính khơng thay đổi phơi sấy Cỏc cõy độc chứa glycozit ủ làm thức ăn cho gia súc thỡ cỏc trình lên men phát triển dẫn tới phá huỷ hoàn toàn glycozit độc Trong số cây, chất độc lại hình thành trình phơi sấy, chế biến hay ủ làm thức ăn [5] 1.1.2 Hợp chất alcaloid độc Alcaloid hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vũng, cú phản ứng kiềm, thường gặp thực vật đơi động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh cho phản ứng hoá học với số thuốc thử gọi thuốc thử chung alcaloid [12] Trong cõy, cỏc alcaloid thường dạng muối acid malic, limonic, oxalic, sucxinic, … Chúng dễ tan nước, dễ hấp thụ qua máy tiờu hoỏ người động vật Khi dạng tự do, chỳng khú tan nước lại dễ tan dung môi hữu ethanol, ether, chloroform [5] Các alcaloid tác dụng với số acid acid silicotungstic, acid photphomolipdic tanin, dễ dàng bị tủa, trở thành chất khó tan nước Lợi dụng tính chất người ta dùng acid tanic nước sắc cỏc cõy cú chứa tanin để giải độc bị ngộ độc alcaloid [5] Hàm lượng alcaloid dễ dàng thay đổi Ngày nay, với phương pháp đại người ta phát vết chúng nhiều loài, quy ước núi cõy cú alcaloid hàm lượng chúng lớn phần vạn Tỷ lệ alcaloid nhiều chiếm từ phần vạn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô Đặc biệt, vỏ canhkina tới 10 phần trăm [5] Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số cõy cú chứa alcaloid hai mầm Theo thống kê đến thỡ cõy thuộc thảo bụi có nhiều alcaloid gỗ Cây năm thường chứa nhiều alcaloid lưu niên [7] 1.2 Cõy Lỏ ngún 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố Hình 1: Gelsemium elegans Benth Cõy Lỏ ngún mọc Việt Nam có tên khoa học Gelsemium elegans Benth., thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae) [6], cịn có tên gọi là: Co ngón, Thuốc r út ruột, Hồ mạn trường, Đại trà đắng, Hồ mạn đằng, Hoàng đằng, Cầu [5], Đoạn trường thảo, Ngón vàng, Khau nguụn [11] Cõy Lỏ ngún loại mọc leo, dài - m Thân cành hình trụ [11], khơng có lơng , trờn thân có khía dọc Lá mọc đối, hình trứng thn dài, hỡnh mỏc, mộp nguyờn, mặt nhẵn bóng [1] Hoa mọc hình xim đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa màu vàng có hoa trắng [4] Quả nang, màu nâu Hạt nhỏ, cú rỡa mỏng bao quanh, mộp khớa rỏch Mựa hoa vào tháng 10 - 12, mùa vào tháng - [11] Cõy Lỏ ngún phân bố chủ yếu Nam Đông Nam châu Á như: Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Lào, Srilanca, Malaysia, Trung Quốc, Việt Nam [15] Ở Việt Nam mọc hoang phổ biến vùng núi cao như: Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hồ Bình, Quảng Ninh, Quảng nam, tỉnh Tõy Nguyờn…[2, 11] Ngoài loài Gelsemium elegans Benth., giới cũn cú loài cõy Lỏ ngún mọc Bắc Mĩ [11] có tên khoa học là: Gelsemium sempervirens (Linne) [21] Gelsemium rankinii [20] 1.2.2 Độc tính tác dụng Cõy Lỏ ngún cú độc tính mạnh, Chất độc alcaloid có tồn Độc rễ non, đến thường hoa, thân quả; thân già độc thân non Nguời ta cho cần ăn kèm theo chén rượu làm chết người sau vài Chính nhân dân ta thường không dùng cõy Lỏ ngún để làm thuốc [5, 6, 11] Triệu chứng ngộ độc cõy Lỏ ngún khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt, cắn chặt, sùi bọt mép, thân nhiệt hạ, huyết áp hạ, cuối cúng chết ngừng hô hấp [11] Trong dân gian người ta thường dùng mỡ lợn, dầu lạc để uống, dùng dịch chiết rau má rau muống để làm hồi tỉnh lại [1] Theo Võ Văn Chi, cõy Lỏ ngún có vị đắng, cay, tớnh núng, độc; có tác dụng nhiệt, tiêu thũng, bạt độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa Lá tươi giã nhỏ đắp nấu nước rửa để trị bệnh như: eczema, nấm chân, thõn; đũn ngó tổn thương, đụng giập; trĩ, tràng nhạc; đinh nhọt, viêm mủ da; phong hủi [1] Trong y học cổ truyền Nhật Bản, người ta sử dụng cõy Lỏ ngún để trị bệnh lở loét, viêm da, ung nhọt [16] Ở Trung Quốc Bắc Mĩ bên cạnh sử dụng tương tự người ta sử dụng rễ để chữa bệnh động kinh giảm đau [6] Gần có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu tác dụng dược lý như: giảm đau, chống viêm, chống ung thư từ cõy Lỏ ngún [3, 16, 18] 1.2.3 Các hợp chất alkaloid Những năm gần đõy, nhà khoa học giới nghiờn cứu nhiều cõy độc Gelsemium elegans Benth., thu hái Bắc Mĩ, Thái Lan, Trung Quốc Nhiều alcaloid có nhõn indol (1) phõn lập xác định cấu trúc, chủ yếu alcaloid thuộc phõn nhúm oxindol indolenin [3, 19] N H (1) Chúng ta chia alcaloid có nhõn indol cõy Lá ngún thành phõn nhúm [19] - Nhúm 1: Các alcaloid loại sarpagin - Nhúm 2: Các alcaloid loại koumin - Nhúm 3: Các alcaloid loại humantenin - Nhúm 4: Các alcaloid loại gelsemin - Nhóm 5: Các alcaloid loại gelsedin gelselegin Trong alcaloid thuộc nhóm có nhõn indol, thuộc nhúm 3, 4, có khung oxindol [19], cũn alcaloid thuộc nhóm có khung indolenin [3] Nhúm bao gồm alcaloid: koumidin (2), 19 - (z)- akuammidin (3) [3] CH2OH COOCH3 CH2OH H C N H N N N H D H CH3 (2) koumidin (3) 19 - (z) - akuammidin Nhúm bao gồm alcaloid: koumin (4) [14], 19 - (R) hydroxydihydrokoumin (5), 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin (6) [3] 22 N H 19 22 CH OH H H H (4) koumin H H N O CH H 19 H3C H N N O (5) 19 - (R) - hydroxydihydrokoumin (6) 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin Nhúm bao gồm alcaloid: humantenirin (7), humantenin (8), 11 hydroxyhumantenin (9), 11 - metoxyhumantenin (10), rankinidin (11), N desmetoxyrankinidin (12), 11- hydroxyrankinidin (13) [3], Ngoài cũn có 11 hydroxyhuman - humantenine [15] O H H H H R3 Na Nb 20 O R2 R1 (7) R1 = OCH3 R2 = H R3 = OCH3 : humantenirin [19] (8) R1 = OCH3 R2 = H R3 = H : humantenin [19] (9) R1 = OCH3 R2 = OCH3 R3 = OH : 11 - hydroxyhumantenin (10) R1= OCH3 R2 = OCH3 R3 = OCH3 : 11 - metoxyhumantenin (11) R1 = OCH3 R2 = H R3 = H : rankinidin (12) R1 = H R2 = H R3 = H : N - desmetoxyrankinidin (13) R1 = OCH3 R2 = H R3 = OH : 11 - hydroxyrankinidin Nhúm bao gồm alcaloid: gelsemin (14), gelsevirin (15), 21 oxogelsemin (16), 21 - oxogelsevirin (17), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (18), 19 - (R) - acetyldihydrogelsevirin (19), 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (20), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin (21) [3] O O H H H N CH3 H CH3 N O N O N O R R (14) R = H : gelsemin (16) R = H : 21 - oxogelsemin (15) R = OCH3 : gelsevirin(17) R = OCH3 : 21 - oxogelsevirin O H H CH3 N O O N 19 R2 R1 (18) R1 = OCH3 R2 = OH : 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (19) R1 = OCH3 R2 = OAc : 19 - (R) - hcetyldihydrogelsevirin (20) R1 = OCH3 R2 = OH : 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (21) R1 =H R2 = OH : 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin Nhúm bao gồm alcaloid: gelselegin (22), 11 - metoxy - 19 hydroxygelselegin (23) [19, 3], gelsenicin (24), elegansamin (25), gelsedin (26), gelsemicin (27), 14 - ò - hydroxygelsedin (28), 14 - ò - hydroxygelsemicin (29) [3], 14,15 dihydroxygelsenicine (30), 14 - hydroxy - 19 - oxogelsenicin (31), 14 acetoxygelsenicin (32), 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin (33), 14 acetoxygelselegin (34) [16, 17], gelsamydin (35), 19 - hyđroxygelsamyin (36), [3] Ngồi cũn có monoterpenoid oxindol alcaloid tách từ phần lá, có liên quan đến Gelsenicin là: gelsedilam C17H18N2O4, 14 - acetoxygelsedilam C19H20N2O6, gelsefuranidin C24H25N2O5, gelseiridon C29H35N2O8 [17] O CH3OH CH3 R1 N N O R2 H OCH3 (22) R1 = H R2 = H: gelselegin (23) R1 = OCH3 R2 = OH : 11 - methoxy - 19 - hydroxygelselegin 10 H9 H12 H11 H10 H18α H3 H18β H19 proton 1H 1H 1H 1H 1H 1H 1H 1H d d dt dt dd t dd dd J (Hz) hóa học δ (ppm) J = Hz 7,57 J = 7,5 Hz 7,51 J = 1,5 Hz; J = 7,5 Hz 7,33 J = 1,5 Hz; J = Hz 7,24 J = Hz; J = 18 Hz 4,83 J = 1,5 Hz 4,81 J = Hz; J=11,5 Hz 4,74 J = 11,5 Hz; J = 18 4,57 H21α 1H dd Hz J = 4,5 Hz; J= 11,5 H21β H17α H17β H5 H16 H14α N-CH3 H15 H6α H6β H14β 1H 1H 1H 1H 1H 1H 3H 1H 1H 1H 1H d d d m m td s m m dd td Hz J = 11,5 Hz J = 11 Hz J = 11 Hz J = 3,5 Hz; J = 15 Hz J = Hz; J = 14 Hz J = Hz; J = 14,5 Hz 4,14 3,51 3,05 2,96 2,74 2,71 2,58 2,48 2,26 2,24 2,13 1,67 Phổ cộng hưởng từ chiều 13C-NMR, DEPT 90 DEPT 135 cho biết chất A4 có 20 nguyên tử carbon, có nhóm CH 3, nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc (Cq) Phổ hai chiều HSQC cho biết tương tác 1J proton với nguyên tử carbon Đặc biệt nhúm methylene (CH2) có proton tương tác với nguyên tử carbon δH 4,83 ; 4,74/δC 115,74 proton H18 - C18; δH 4,14 ; 3,51/δC 60,5 proton H21 - C12; δH 3,05 ; 2,96/δC 56,9 proton H17 - C17; δH 2,58 ; 1,67/δC 24,7 proton H14 - C14; δH 2,24 ; 2,13/δC 28,6 proton H6 - C6 Từ phổ HSQC carbon bậc (CH 3), bậc (CH2) bậc (CH) xác định Từ nguyên tử carbon xác định kết hợp với phổ HMBC (tương tác xa 3J hay 4J proton nguyên tử carbon) carbon bậc (Cq) xác định 19 Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm) : 185,5 (C2); 154,5 (C13); 143,8 (C8); 137,5 (C19); 127,9 (C11); 125,8 (C10); 123,1 (C9); 120,4 (C12); 115,7 (C18); 69,9 (C3); 60,5 (C21); 57,4 (C7); 56,9 (C17); 55,8 (C5); 44,8 (C20); 42,2 (N-CH3); 37,9 (C16); 32,4 (C15); 28,6 (C6); 24,7 (C14) Qua phõn tích phổ so sánh với số liệu công bố tài liệu [3, 13], chất A4 xác định cấu trúc koumin Koumin (Kou - Wen) tiếng Trung Quốc có nghĩa độc, phõn lập từ cõy Gelsemium elegans vào năm 1932, đến năm 1981 cấu trúc xác định phổ cộng hưởng từ phõn giải cao khẳng định lại phương pháp phổ nhiễu xạ tia X [13] Koumin có cấu trúc nhúm chất corynanthein alcaloid có cấu hình tuyệt đối C15 Chương 3: THỰC NGHIỆM Rễ Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều thành phần hoá học, đồng thời giám định hố pháp chưa có chất chuẩn alcaloid chiết tách từ cõy Lỏ ngún Nhiệm vụ luận văn là: - Định tính alcaloid định lượng alcaloid toàn phần - Chiết xuất phõn lập alcaloid rễ cõy Lá ngún 20 - Xác định cấu trúc hoá học alcaloid tinh khiết phương pháp phổ: phổ cổng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (13C-NMR, 1H-NMR, HSQC, COSY, …), Phổ khối lượng, … 3.1 Dụng cụ hố chất Chúng tơi sử dụng cỏc hoỏ chất thiết bị sau: - Dung môi hữu cơ: chloroform, methanol, ethyl acetate, ethanol, … - Axit HCl, dung dịch NH3 25%, … - Chất hấp phụ silicagel: + Loại dùng cho mỏng: silicagel 60 F254 Merck + Loại dùng cho cột: silicagel 60 (0,040 - 0,063) Merck - Đèn tử ngoại: Desaga Min UV - VIS - Máy điều nhiệt: Buchi B - 480 - Máy cất quay: Buchi R - 114 - Cân: Metter Toledo AB204 Các kết phổ gửi phân tích Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 3.2 Chuẩn bị mẫu Mẫu rễ Lá ngón thu hái Sơn La vào tháng năm 2005 Mẫu thái nhỏ, sấy khô 50 - 600C Sau nghiền nhỏ, bảo quản lọ thuỷ tinh đậy kín 3.3 Định tính alcaloid định lượng alcaloid tồn phần 3.3.1 Định tính alcaloid Lấy 10g bột rễ Lỏ ngún, cho vào bình nón dung tích 250 ml, làm ẩm ml dung dịch NH3 25% Sau thêm vào bình 100 ml chloroform, lắc đều, để yên qua đêm, lọc, lấy dịch lọc đem chiết với 50 ml dung dịch acid HCl, gạn lấy phần dịch acid 21 Cho vào hai ống nghiệm ml dịch chiết acid thêm vào ống mọt giọt thuốc thử sau: - Thuốc thử Dragendorff - Thuốc thử Mayer Quan sát tượng thấy có xuất kết tủa màu đỏ gạch ống sử dụng thuốc thử Dragendorff, kết tủa màu trắng ống sử dụng thuốc thử Mayer Số lượng hạt kết tủa nhiều Kết luận: có thành phần alcaloid rễ Lỏ ngún 3.3.2 Định lượng alcaloid toàn phần Để định lượng alcaloid toàn phần rễ Lỏ ngún chỳng sử dụng phương pháp acid - base a Xác định độ ẩm Độ ẩm bột dược liệu dùng để định lượng xác định máy Sartorius (Germany) môn Dược liệu Trường Đại học Dược - Hà Nội Kết độ ẩm rễ là: 9,72% b Tiến hành định lượng Cân xác 10g bột dược liệu xác định độ ẩm cho vào bình dung tích 250 ml, thấm ẩm NH4OH 25%, để yên 12 giờ, cho bột dược liệu vào t lọc đặt vào bình Soxhlet Chiết với dung môi CHCl3 đến kiệt alcaloid (thử thuốc thử Dragendorff) Cất thu hồi dung mơi, hồ tan cặn HCl 5%, rửa dịch acid ether lần lần 10 ml, kiềm hoá dung dịch NH 25% đến pH = 12 Sau đó, chiết CHCl3 lần lần 10 ml để lấy kiệt alcaloid toàn phần Tập trung dịch chiết rửa nước cất đến pH = 7, để bốc tự nhiên đến khơ Hồ tan cặn lượng xác 10 ml HCl 0,1 N Thêm nước cất đun sôi để nguội giọt dung dịch methyl Định lượng acid thừa dung dịch NaOH 0,1 N c Tính tốn kết 22 Khi định lượng nhiều alcaloid dược liệu người ta thường tính kết theo alcaloid Với cõy Lỏ ngún thỡ tớnh theo Koumin, ml dung dịch HCl 0,1 N tương ứng với 0,0306 g alcaloid tồn phần tính theo Koumin Vậy hàm lượng alcaloid tồn phần tính theo Koumin là: (10 – V).0,0306.100 Χ% = P - X: Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần dược liệu khơ tuyệt đối - V: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để trung hoà HCl dư - 10 - V: Số ml dung dịch acid tham gia bão hoà alcaloid - P: Khối lượng dược liệu trừ độ ẩm (g) Tiến hành định lượng lần Kết định lượng trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết định lượng alcaloid toàn phần rễ Lỏ ngún Lần thí nghiệm V (ml) X (%) Trung bình 7,50 0,85 7,40 0,87 7,35 0,89 0,87 ± 0,01 7,45 0,86 7,35 0,89 Kết luận: Kết định lượng cho thấy, hàm lượng alcaloid toàn phần rễ Lỏ ngún cao khoảng 0,87% 3.4 Chiết xuất phân lõp alcaloid từ rễ Lỏ ngún 3.4.1 Chiết xuất alcaloid toàn phần Alcaloid toàn phần rễ cõy Lỏ ngún chiết cồn, theo phương pháp ngấm kiệt nhiệt độ thường Quy trình chiết trình bày sơ đồ 3.1 Bột dược liệu Ngâm lạnh cồn - acid tactric 1% Lọc Bã Dịch chiết cồn - acid Cất quay thu hồi cồn Cao đặc 23 Nước cất Lọc loại tạp Dịch chiết nước - acid Chiết Ethyl acetate Dịch chiết Ethyl acetate (tạp) Dịch chiết nước - acid (loại tạp) Dung dịch NH3 25% Lọc Kết tủa Dịch chiết nước pH = 11-12 Hoà tan cồn- acid Kờt tủa lại Chiết CHCl3 Dịch chiết CHCl3 NH3 Rửa H2O nhiều lần Cất quay thu hồi CHCl3 Cặn chiết alcaloid A8 Alcaloid toàn phần Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất alcaloid rễ Lỏ ngún 3.4.2 Phân tích cặn chiết alcaloid sắc ký lớp mỏng Để khảo sát thành phần khả tỏch cỏc alcaloid tìm kiếm hệ dung mơi thích hợp cho q trình tách, chúng tơi dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng nhằm tiết kiệm lượng mẫu dung môi a Chuẩn bị mỏng 24 Sử dụng mỏng có chiều dài 10 cm, chiều rộng tuỳ thuộc vào số lượng chất đưa lên mỏng Hai mép mỏng phải làm phẳng tránh hiệu ứng bờ b Đưa chất lên mỏng Dựng thìa kim loại lấy lượng nhỏ cặn chiết cho vào ống nghiệm, hoà tan mẫu dung mơi thích hợp Dùng capila (loại chấm mỏng) có đường kính 0,3 mm để hút chấm chất lên mỏng Chấm chất cho có vế trịn gọn, cỏch mộp mỏng 0.5 cm cỏch chõn mỏng chừng cm Lượng chất đưa lên mỏng phải đủ để vết mỏng, không nhiều để trỏnh cỏc vết trựng lờn Nếu chất có nồng độ thấp dung mơi chấm chất nhiều lần điểm, chấm lần chờ cho dung môi bay hết lại tiếp tục chấm tiếp lần khác c Triển khai Để bình chạy sắc ký mỏng có miệng rộng, nắp nhỏm, đỏy phẳng bão hoà hệ dung môi lựa chọn Bản mỏng sau chấm chất để ngồi khơng khí khoảng phút cho dung mơi bay hết, sau đặt vào bình cho chân mỏng phía có chất mỏng nghiêng với thành bình 150 Chờ cho tuyến dung môi chạy lờn cỏch mộp trờn mỏng chừng cm lấy ra, để ngồi khơng khí cho bay hết dung mơi d Hiện sắc kí đồ Để sắc đồ, dựng đốn tử ngoại bước sóng 254 nm 365nm để soi mỏng chạy sắc ký, đáng dấu vết Sau phun mỏng thuốc thử Dragendorff Tính Rf cho chất tách hệ dung mơi định Q trình áp dụng suốt thời gian làm thực nghiệm với sắc ký lớp mỏng Dựa vào kết thu nhận thông tin sau: 25 - Số lượng vết hỗn hợp cặn chiết - Khả tỏch cỏc chất hệ dung môi - Đánh giá sơ hàm lượng chất hỗn hợp Kết khảo sát sắc ký lớp mỏng trước chạy cột với hệ dung môi bốn thành phần: toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3], cặn chiết alcaloid tách làm vết có phản ứng màu phun thuốc thử Dragendorff, giá trị R f vết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết SKLM hệ dung môi toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3] Vết Rf Độ đậm A1 0.85 +++ Ghi chú: A2 0.75 +++ A3 0.66 +++ A4 0.62 ++++ A5 0.37 ++ A6 0.21 ++ ++++ : vàng đậm ++ : vàng +++ + : vàng nhạt : vàng đậm A7 0.12 + A8 0.06 +++ Tương tự, khảo sát khả tách chất khỏi cặn chiết alcaloid toàn phần với hỗn hợp dung môi chloroform: methanol tỷ lệ khác 3.4.3 Phân lập alcaloid sắc ký cột Dựa vào kết sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform: methanol với nhiều tỷ lệ khác để tiến hành sắc ký cột cặn chiết alcaloid Khi tiến hành sắc ký cột, nhồi vào đáy cột bơng, tiếp đến lớp cát mỏng nhằm tránh hạt silicagel bị đẩy ngồi tác dụng áp suất mạnh, sau đổ silicagel khơ lên Làm phẳng bề mặt silicagel cách vỗ nhẹ thành cột Đưa hệ dung môi chọn vào cột, lúc đầu dùng công tơ hút từ từ dung môi vào cột, tránh xáo trộn bề mặt, sau đổ đầy dung mơi vào cột, mở khố cho dung mơi chảy đến dung mơi vừa đủ thấm cột Có thể dựng dũng khớ để đuổi bọt khí cho nhanh Tiếp tục làm thấy cột 26 suốt có nghĩa khơng cịn bọt khí nằm xen kẽ lớp silicagel cột Giai đoạn nhồi cột kết thúc Sau nhồi cột xong, cần giữ lượng dung môi nằm cách bề mặt silicagel cm Quá trình áp dụng suốt thời gian làm thực nghiệm với sắc ký cột 5,12 g cặn chiết alcaloid hồ dung mơi chloroform vừa đủ cho tan hết, cho g silicagel vào lắc đều, cuối cất quay loại dung mơi khơ, lượng chất cặn chiết đớnh trờn bề mặt silicagel Chuyển hỗn hợp qua tờ giấy sau đổ vào cột nhẹ nhàng để tránh xáo trộn trến bề mặt cột, cho lớp thuỷ tinh lên để tránh khuếch tán ngược Rửa giải cột hệ dung môi chloroform: methanol (98: 2) Mỗi phân đoạn lấy 30 ml Nhằm đẩy nhanh chất khỏi cột tăng dần độ phân cực dung môi rửa giải từ tỷ lệ chloroform: methanol 98: đến 8: Theo dõi kết tỏch trờn cột sắc ký lớp mỏng, sắc đồ cách soi đèn tử ngoại bước sóng 254 nm 365 nm sử dụng thuốc thử Dragendorff Căn vào kết sắc ký lớp mỏng dồn chung phân đoạn nhỏ cú cựng thành phần làm thành phân đoạn lớn Kết phõn lập cặn chiết alcaloid sắc ký cột cách khái quát bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết phõn lập alcaloid sắc ký cột STT phân STT phân Hệ dung môi rửa cột Lượng tách Hàm lượng đoạn lớn I đoạn nhỏ - 16 chloroform: methanol 98 : (mg) 120, (%) 2,310 II III 17 - 27 28 - 59 98 : 98 : 246,5 301,5 4,74 5,798 IV V VI 60 - 66 67 - 74 75 - 94 98 : 98 : 96 : 106,9 192,5 240,7 2,055 3,701 4,629 27 VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX 95 - 108 109 - 130 131 - 153 154 - 165 166 - 175 176 - 186 187 - 196 197 - 206 207 - 219 220 - 233 234 - 246 247 - 260 261 - 268 96 : 96 : 9:1 9:1 9:1 9:1 85 : 15 85 : 15 85 : 15 85 : 15 8:2 8:2 8:2 605,5 39,4 28,0 35,5 180,7 27,1 14,2 70,5 40,6 35,0 36,5 115,8 150,0 11,644 0,758 0,538 0,683 3,475 0,521 0,273 1,356 0,780 0,673 0,702 2,227 2,896 Dựa vào kiểm tra sắc ký lớp mỏng, thấy phõn đoạn II IV phõn đoạn Hai chất thu từ hai phõn đoạn alcaloid ký hiệu A1, A2 A1 chất dầu có màu nõu đỏ, A2 chất bột không màu Phõn đoạn VII thu chất rắn tương đối sạch, phương pháp kết tinh lại thu alcaloid tinh khiết, ký hiệu A4 A4 tinh thể hình khối, khơng màu Các chất tinh khiết ký hiờụ A2, A4 ghi phổ để xác định cấu trúc hoá học, bao gồm phương pháp phổ sau: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: Khi khảo sát thành phần alcaloid rễ cõy Lá ngún Gelsemium elegans Benth.) thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae) Việt Nam, rút số kết luận sau: Bằng Sắc ký lớp mỏng lựa chọn hệ dung mơi thích hợp, phát vết alcaloid rễ cõy Lá ngún, vết A4 A8 đậm Sử dụng phương pháp acid - base định lượng thành phần alcaloid rễ cõy Lá ngún là: 0,87 % Đã chiết xuất alcaloid toàn phần từ rễ cõy Lá ngún Phõn lập alcaloid tinh khiết A2 A4 29 Bằng phương pháp phõn tích phổ đại: phổ hồng ngoại; phổ cộng hưởng từ hạt nhõn chiều (13C-NMR, 1H-NMR, DEPT); phổ cộng hưởng từ hạt nhõn hai chiều (COSY, HSQC, HMBC); phổ khối lượng, nhận dạng A2 gelsevirin, A4 koumin Bước đầu tạo chất chuẩn so sánh phục vụ tốt cho việc giám định hoá pháp vụ ngộ độc bị đầu độc cõy Lá ngón Việt Nam ĐỀ NGHỊ: Trên đõy kết nghiên cứu bước đầu cõy Lá ngún Việt Nam Đề tài cũn nhiều vấn đề cần nghiên cứu sõu thành phần húa học, đặc biệt chiết xuất phõn lập alcaloid, thử độc tớnh, cấp cứu, giải độc tác dụng sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO A.TIẾNG VIỆT Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 644 - 645 Võ Văn Chuyờn, Vừ Văn Chi, Lê Khả Kế (1971), Cây cỏ thường thấy Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 288 - 289 Lại Thị Kim Dung (2004), Nghiên cứu thành phần hoá học khảo sát hoạt tính chống ung thư, hoạt tính ức chế miễn dịch số thuốc Việt Nam, Luận văn tiến sĩ, Viên Khoa học Công nghệ Việt Nam Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất Trẻ, Hà Nội, 2, tr 288 289 Trần Cụng Khỏnh (1992), Cây độc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội 30 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 319 - 321 Phạm Trương Thị Thọ (2001), Giáo trình hố học hợp chất tự nhiên, Nhà xuất Giáo dục, Thành phố Quy Nhơn, tr 67 Nguyễn Thị Diễm Trang, Nguyễn Xuõn Dũng (2001), “Triển khai sắc ký cột nhanh để tách số hợp chất flavonoid từ họ compositae nhựa tràm”, Tuyển tập cơng trình khoa học, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, (11), tr.213 214 Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý hố lý, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Hoàng Văn Tố, Nguyễn Thanh Liêm, Dương Văn Mậu, Phạm Quốc Kớnh (1981), Nghiên cứu alcaloid từ Lá ngún”, Hội nghị hố học tồn quốc lần thứ nhất, tr 50 11 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2, tr 133 - 135 12 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 231 - 232 B TIẾNG ANH 13 Chu - tsim Liu* and Qi - wen Wang (1981), “Struture of koumine”, J Am Chem Soc., 103, pp 4634 - 4635 14 Luo SR., Li T., Yang JS (1993), “Determination of gelsemium alkaloid by RP HPLC”, Yao Hsueh Hsueh Pao, 28(9), pp 695 - 698 15 Lin L Z., Cordell G A., Ni C Z., Clardy J (1989), “New humantenine - type alkaloids from Gelsemium elegans”, Journal of Natural Products, 52(3), pp 88 594 16 Mariko Kitajima, Tomonori Nakamura, Noriyuki Kogure, Mo Ogawa, Yuka Mitsuno, Kageyoshi Ono, Shingo Yano, Norio Aimi, and Hiromitsu Takayama (2006), “Isolation of gelsedine - Type indole alkaloids from Gelsemium elegans 31 and evaluation of the cytotoxic activity of gelsemium alkaloid for A431 epidermoid carcinoma cells”, Journal of Natural Products, 69(4), pp 715 - 718 17 Noriyuki Kogure, Naoko Ishii, Mariko Kitajima, Sumphan Wongseripipapatana and Hiromitsu Takayama (2006), “Four novel gelsenicine - related oxindole alkaloids from the leaves of Gelsemium elegans Benth.”, Org Lett., 8(14), pp 3085 - 3088 18 Rujjanawate C., Kanijanapothi D., Panthong A (2003), “Pharmacological effect and toxicity of alkaloids from Gelsemium elegans Benth.” Joural of Ethnopharmacol, 89(1), pp 91 - 95 19 Shin - ichiro Sakai and Hiromitsu Takayama (1994), “Biomimetic chemical transformation from simple indole alkaloids to gelsemium alkaloids”, Pure & Appl Chem., 66(10/11), pp 2139 - 2142 20 Schun Y., Cordell G A., (1986), “Rankinidine, a new indole alkaloid from Gelsemium rankinii”, Journal of Natural Products, 49(5), pp 806 - 808 21 Schun Y., Cordell G A., (1985), “14 beta - hydroxygelsedine, a new oxindole alkaloid from Gelsemium sempervirens ”, Journal of Natural Products, 48(5), pp 788 - 791 32 33 ... phải có chất chuẩn, phục vụ cho phương pháp phân tích Trong luận văn chúng tơi xin đóng góp phần vào việc chiết tách, tinh chế, xác định cấu trúc số hợp chất alcaloid rễ Lỏ ngún (Gelsemium elegans. .. Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều thành phần hoá học, đồng thời giám định hố pháp chưa có chất chuẩn alcaloid chiết tách từ c? ?y Lỏ ngún Nhiệm vụ luận văn là: - Định. .. là: - Định tính alcaloid định lượng alcaloid toàn phần - Chiết xuất phõn lập alcaloid rễ c? ?y Lá ngún 20 - Xác định cấu trúc hoá học alcaloid tinh khiết phương pháp phổ: phổ cổng hưởng từ hạt nhân