Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 Tổng hợp Naphtol as-thế Photphat làm chất nhuộm Photphataza bạch cầu người Trần Thị Hoa1,*, Trần Thị Thanh Tâm1, Nguyễn Đình Duy3, Lưu Văn Bơi1, Trần Văn Tính2 Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 19 Lê Thánh Tông, Hà Nội, Việt Nam Trung tâm Huyết học - Truyền máu, Bệnh viện 19-8 Trường chuyên Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 04 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 12 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 28 tháng năm 2017 Tóm tắt: Naphtol AS-BI photphat ứng dụng làm chất nhuộm hóa học tế bào để phân loại dòng bệnh bạch cầu kinh phân biệt tế bào Lympho T bệnh bạch cầu cấp Để bổ sung nguồn chất cóđộ nhạy độ đặc hiệu cao với giá thành hợp lý, tiến hành tổng hợp dãy 3[(N-aryl)cacbamoyl]-naphtalen-2-yl dihidroxyphotphat (Naphtol AS-X photphat) phản ứng dẫn xuất Naphtol AS-X với POCl3, sau tiến hành thủy phân Kết sử dụng hợp chất Naphtol AS-thế photphat (naphtol AS-X photphat) tổng hợp làm chất nhuộm photphataza đặc hiệu bạch cầu cho thấy tất chất dương tính với tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit bạch cầu ưa bazơ Từ khóa: Naphthol AS-BI phosphate, Alkaline phosphatase, acute leukemia Mở đầuu đứng thứ bệnh ung thư mắc nữ giới [2] Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo tiêu chuẩn FAB dựa kết ba phương pháp: miễn dịch, di truyền nhuộm hóa học tế bào [3] Nhuộm hóa học tế bào kỹ thuật dễ thao tác, khơng địi hỏi máy móc thiết bị đắt tiền giá thành rẻ nên ứng dụng nhiều bệnh viện, sở nghiên cứu Nhuộm hóa học tế bào gồm nhiều kỹ thuật, nhuộm photphataza bạch cầu dùng để phân biệt bệnh bạch cầu kinh dịng tủy bạch cầu cấp dịng tế bào tóc (hairy cell) Cơ chất sử dụng Naphtol AS-BI photphat có độ nhạy độ đặc hiệu cao phải nhập ngoại với giá thành đắt Ngoài ra, việc vận chuyển chất gặp khó khăn phải bảo quản phải - Bệnh bạch cầu nhóm bệnh lý ác tính hệ thống tạo máu [1] Số người mắc bệnh có xu hướng ngày tăng với đặc điểm có tăng sinh bất thường khơng thể kiểm soát tế bào bạch cầu chưa trưởng thành lấn át tế bào bình thường tủy xương máu ngoại vi Theo thống kê tổ chức Sức khỏe Mỹ năm 2016, tỉ lệ mắc bệnh ung thư bạch cầu tương đối cao chiếm 4% đứng thứ bệnh ung thư mắc nam giới, chiếm 3% _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-1664723800 Email: tranthihoa_t58@hus.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4494 30 T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 20oC [4] Vì vậy, tổng hợp dãy Naphtol AS-X photphat làm chất nhuộm photphataza dùng chẩn đoán, điều trị bệnh bạch cầu người thay hóa chất nhập ngoại đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn cần thiết 31 Soi tiêu kính hiển vi hai mắt Nikon với độ phóng đại 1.000 lần có gắn máy chụp ảnh, viện 19-8 Phương pháp nghiên cứu: tổng hợp hữu nhuộm hóa học tế bào 2.2 Thực nghiệm Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu 2.1 Hóa chất thiết bị Hóa chất: Các Naphtol AS-D photphat 95%, Naphtol AS-OL photphat 95%, Naphtol AS-CA photphat 98%, Naphtol AS-BS photphat 99,3%, Naphtol AS-BO photphat 99,42%, Naphtol ASLC photphat 99,41%, Na2PO4 99%, loại P, KH2PO4, loại P, sản phẩm Sigma Aldrich; muối điazo: Fast red violet LB salt sản phẩm Acros; THF 99% POCl3 99%, sản phẩm Merk; Pyridin 99% , HCl 36,7%, sản phẩm Trung Quốc; Các hóa chất tinh chế lại cần thiết Dụng cụ thiết bị: Phổ hồng ngoại (IR) đo máy FTIR Affinity khoảng 400- 4000 cm-1 khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiênĐHQGHN; mẫu ép viên với KBr; Phổ khối lượng (MS) đo máy LCMSD-Trap-SL hãng Agilent Technologies (Mỹ), Viện Hóa học -Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam; Phổ cộng hưởng từ proton đo máy ADVANCE Spectrometer (Bruker 500Mv), tần số 500MHz, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN; Cân phân tích Sartorius độ xác 10-4 gram, Bệnh viện 19-8; Máy đo điểm nóng chảy Omega SMP40, phịng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN; Ủ nhiệt tiêu nhuộm máy điều nhiệt CW-20GS ( 0-5000C) nhiệt độ 370C Hàn Quốc, độ xác ± 0.10C, bệnh viện 19-8; 2.2.1 Tổng hợp dãy chất Naphtol AS-X photphat Quy trình tổng hợp Naphtol AS-D photphat: Hòa tan 1,00 gam Naphtol AS-D ( 3,426 mmol) 10 ml dung môi pyridin khan ( làm khan NaOH) sau làm lạnh hỗn hợp phản ứng đến 0oC Nhỏ từ từ giọt 0,481 ml dung dịch POCl3 (5,139 mmol), khuấy 24h, giữ nhiệt độ 0oC Cho 15ml nước đá vào hỗn hợp, điều chỉnh pH dung dịch pH=8 dung dịch NaOH 1M khuấy khoảng 15 phút để phản ứng thủy phân xảy hoàn toàn, thu dung dịch chứa dinatri 3-[(N-aryl) cacbamoyl]naphthalen-2-yl photphat Acid hóa hỗn hợp dung dịch HCl 0,1M xuất kết tủa ( pH=2) Lọc thu kết tủa Phần dịch lọc pha loãng lượng nước đá theo tỷ lệ 1:1, khuấy mạnh, thu thêm kết tủa Gộp phần kết tủa với rửa dung dịch HCl loãng thu chất naphthol AS-X photphat thô dạng rắn màu nâu Tinh chế chất cách hịa tan naphthol AS-X photphat thơ vào NaOH 1M, thêm dung môi tetrahydrofuran (THF) theo tỷ lệ THF: nước = 1:5, sau làm lạnh dung hỗn hợp 2-4oC axit hóa HCl 0,1M đến pH=4 Lọc thu chất naphthol AS-X photphat tinh khiết Hiệu suất sản phẩm 0,5414 gam (44%) Tương tự tiến hành tổng hợp dẫn xuất naphtol AS-X photphat khác Kết tổng hợp, số số hóa lý dự kiện phổ chất tổng hợp thể bảng 2.2.2 Nhuộm hóa học tế bào kỹ thuật nhuộm photphataza Các chất tổng hợp sử dụng làm chất cho kỹ thuật nhuộm photphataza 32 T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 Quy trình nhuộm hóa học tế bào tiến hành bước theo tài liệu [5] Bước 1: Cố định tiêu dung dịch cố định, rửa kỹ nước cất, để khô; Bước 2: Nhúng tiêu dung dịch nhuộm 30 phút nhiệt độ 370C Dung dịch nhuộm pha chế (tính cho tiêu nhuộm) sau: Dung dịch chất: 100 µl Dung dịch muối điazo: Dung dịch đệm: Tổng thể tích: 100 µl 2.000 µl 2.200 µl - Độ 4: Nhiều hạt phủ kín nguyên sinh chất nhân, hạt to Điểm nhuộm tính theo cơng thức: ∑Y (điểm) = Y0 x + Y1 x + Y2 x + Y3 x + Y4 x Thực nhuộm kỹ thuật photphataza sử dụng chất tổng hợp để khảo sát thời gian nhuộm tối ưu pH nhuộm tối ưu Các dung dịch đệm sử dụng: PO43- 0,0124M, pH = 7,4 PO43- 0,0667M – NaF, pH = 7,9 PO43- 0,0667M, pH = 8,0 PO43- 0,0667M, pH = 6,8 PO43- 0,0124M, pH = 5,4 Photphat axit, pH = 5,2 Photphat kiềm, pH = 10,4 Tris, pH = 9,5 Veronal axetat, pH = 9,799 Bước 3: Nhuộm nhân dung dịch Hemtoxylin phút nhiệt độ 370C, rửa tiêu bản, để khơ đọc tiêu kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần Kết nhuộm đánh giá bằng phương pháp phân độ tính điểm theo quy trình 91 hãng Sigma: - Độ 0: Khơng có hạt bắt màu thuốc nhuộm - Độ 1: Ít hạt màu đỏ nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, chiếm ≤1/3 bào tương tế bào - Độ 2: Nhiều hạt màu đỏ nguyên sinh chất, hạt trung bình, chiếm 1/3 đến 3/4 bào tương tế bào - Độ 3: Nhiều hạt màu đỏ nguyên sinh chất, hạt to, chiếm hết bào tương tế bào che phủ phần nhân tế bào Kết khảo sát thể bảng 3-5 Thảo luận kết 3.1 Tổng hợp chất Naphthol AS-X photphat Quy trình tổng hợp Naphtol AS-X photphat thực qua giai đoạn theo [6]: a Tổng hợp 3-[( N-aryl) cacbamoyl] naphtalen-2-yl photphodiclorat: O O X X NH + OH NH pyridin POCl 0°C, 24h O Cl P O Cl b Tổng hợp dinatri-3-[( N-aryl) cacbamoyl] naphtalen-2-yl photphat O O X NH O Cl P O Cl (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) X NH H2O, 0°C NaOH 1M O NaO P O ONa T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 33 c Tổng hợp 3-[(N-aryl) cacbamoyl] naphtalen-2-yl dihidroxyphotphat O O X NH HCl 0.1M, °C NH O O NaO P HO O P O OH ONa Theo quy trình thí nghiệm tổng hợp chất với hiệu suất khoảng 4050% có chất Naphtol ASBO photphat chất (bảng 1) Độ tinh khiết chất kiểm tra phổ IR MS (bảng 2) Bảng Kết tổng hợp dẫn xuất naphtol AS-X photphat Kí hiệu I II III IV V VI Nhóm -X o- CH3 o- OCH3 m-, o- OCH3; p- Cl m- NO2 m- Cl;o- OCH3 N- naphtyl Tên chất Naphtol AS-D photphat Naphtol AS-OL photphat Naphtol AS-LC photphat Naphtol AS-BS photphat Naphtol AS-CA photphat Naphtol AS-BO photphat Bảng Hiệu suất, số số hóa lý, phổ IR MS chất tổng hợp Kí hiệu M (g/mol) H (%) Tnc0C I 357,30 44 100-103 II 373,30 36 190-192 III 437,77 24 155-157 IV 388,27 58 83-85 V 407,74 53 154-156 VI 393,33 56 141-143 IR (KBr; ν, cm-1) 3394,7 (N-H); 1651,1 (C=O) 1232,5; 1166,9; 1062,8 (P-O/ CO);3020,1 (Csp2- H) 3350,4 (N-H); 1641,4 (C=O) 1261,4; 1168,9; 1053,1 (P-O/ CO);3035,9; 3061,0 (Csp2- H) 3346,5 (N-H); 1625,9 (C=O) 1240,2; 1178,5; 1068,5 (P-O/ CO);3016,6; 3076,4 (Csp2- H) 3329,1 (N-H); 1678,0 (C=O); 1253,7; 1111,0; 1056,9 (P-O/ CO);3070,6 (Csp2- H) 3367,7 (N-H); 1647,2 (C=O); 1255,6; 1168,8; 1068,5 (P-O/ CO);3064,8 (Csp2- H) 3574,1 (N-H); 1662,6 (C=O); 1247,9; 1166,9; 1087,8 (P-O/ CO);3068,7 (Csp2- H) Trên phổ IR có hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị N-H amit bậc 3350 cm-1; dao động hóa trị C=O amit 1650 cm-1; dao động biến dạng liên kết N-H 1530 ESI-MS, m/z [Itd] (%) [M-H]- = 356,3 [M-H]- = 371,9 [M+H]+= 373,9 [M-H]- =435,8 [M+H]+= 437,9 [M-H]- =386,9 [M+H]+= 388,9 [M-H]- =405,9 [M+H]+ = 407,9 [M-H]- =391,9 [M+H]+ = 394,0 cm-1 bị chồng chập lẫn vào vùng dao động hóa trị liên kết C=C vịng thơm; dao động hóa trị Csp2–H xuất 3050 cm-1 34 T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 Phổ MS hợp chất Naphtol AS-X photphat cho nhiều phân mảnh cấu trúc bền phân tử Các pic tương ứng với ion phân tử [M-H]- [M+H]+ phù hợp với phân tử khối hợp chất tổng hợp Kết xác định phổ IR MS cho thấy chất có độ tinh khiết cần thiết để tiến hành thí nghiệm nhuộn tế bào 3.2 Nhuộm kỹ thuật photphataza 3' O 10 5' NH1' HO 8' O P O Các chất tổng hợp đem nhuộm hóa học tế bào kỹ thuật nhuộm photphataza thấy tất chất tổng hợp cho kết dương tính đặc hiệu với tế bào dịng bạch cầu: bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit, bạch cầu ưa bazơ Sau thực thí nghiệm khảo sát dung dịch đệm tối ưu, thời gian nhuộm chất cần phát tối ưu, nghiên cứu thu kết điều kiện nhuộm tối ưu 370C, dung dịch đệm photphataza kiềm với thời gian nhuộm chất cần phát 60 phút Bảng kết nhuộm thử chất tổng hợp điều kiện tối ưu so với mẫu đối chứng chất chuẩn Naphthol AS-BI photphat sản phẩm Sigma Aldrich trình bày bảng Hình ảnh kết nhuộm mẫu máu ngoại vi người khỏe mạnh cho kết dương tính đặc hiệu dòng tế bào bạch cầu chất tổng hợp trình bày bảng 4' 11 2' 6' 7' OH Naphtol AS-BO photphat Phổ 1H-NMR Naphthol AS-BO photphat ( DMSO; δ, ppm; J, Hz): 10.97 (s, 1H, NH), 8.42 (s, 1H, H-4), 8.30 (d, 3J = 9.0, 1H, H5’), 8.07 (d, 3J = 8.0, 1H, H-5), 7.96 (d, 2H, H1, H-8’), 7.90 (dd, 2H, H-8, H-4’), 7.83 (d, 3J = 8.0, 1H, H-2’), 7.76 – 7.45 (m, 5H, H-3’, H-6’, H-7’, H-6, H-7) Trên phổ 1H-NMR Naphthol AS-BO photphat cho xuất singlet 10.966 ppm proton liển kết N-H (amit), khơng thấy xuất proton nhóm OH photphat, có lẽ proton OH dễ bị dung mơi có vết nước Bảng Bảng kết thí nghiệm khảo sát dung dịch đệm tối ưu (%) Cơ chất Hệ đệm (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) I II III IV V VI 80 (20,0%) 75 (18,75%) 82 (20,0%) 76 (19,0%) 50 (12,5%) Âm tính 114 (28,5%) 66 (16,5%) 96 (24,0%) 78 (19,5%) 80 (20,0%) 110 (27,5%) 90 (22,5%) 70 (17,5%) Âm tính 145 (36,25%) 100 (25,0%) 120 (30,0%) 56 (14,0%) 65 (16,25%) 80 (20,0%) 40 (10,0%) 100 (25%) 85 (21,25%) 109 (27,25%) 95 (23,75%) 60 (36,26%) Âm tính 133 (33,25%) 95 (23,75%) 115 (28.75%) 89 (22,25%) 88 (22,0%) 85 (21,25%) 60 (15,0%) 85 (21,25%) 75 (18,75%) 80 (20,25%) 65 (16,25%) Âm tính Âm tính Âm tính 100 (25,0%) 60 (15,0%) 76 (19,0%) Âm tính 117 (29,25%) 75 (18,75%) 75 (18,75%) Âm tính Âm tính 72 (18,0%) 60 (15,0%) 80 (20,0%) T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 35 Bảng Kết nhuộm chất naphtol AS-X tổng hợp so với sản phẩm Sigma Mẫu máu Cơ chất Naphthol AS-BI photphat - Sigma I II III IV V VI 5114 6103 5030 5041 6863 5077 5036 6844 67 16.75% 87 21.75% 95 23.75% 89 22.25% 75 18.75% 84 21.00% 99 24.75% 137 34.25% 97 24.25% 116 29.00% 103 25.75% 139r 34.75% 127 31.75% 116 29.00% 226 56.50% 150 37.50% 160 40.00% 204 51.00% 126 31.50% 212 53.00% 217 54.25% 103 25.75% 83 20.75% 113 28.25% 88 22.00% 96 24.00% 108 27.00% 116 29.00% 87 21.75% 77 19.25% 94 23.50% 86 21.50% 85 21.25% 66 16.50% 120 30.00% 201 50.25% 90 22.50% 165 41.25% 135 33.75% 150 37.50% 93 23.25% 163 40.75% 378 94.50% 286 71.50% 372 93.00% 364 91.00% 375 93.75% 338 84.50% 350 87.50% 180 45.00% 135 33.75% 186 46.50% 167 41.75% 199 49.75% 213 53.25% 163 40.75% Bảng Hình ảnh nhuộm thử mẫu bệnh phẩm chất naphtol AS-X Cơ chất tổng hợp I II III IV V VI Hình ảnh tế bào bạch cầu dương tính nhuộm photphataza Kết luận Đã tổng hợp dẫn xuất naphtol AS photphat làm chất nhuộn photphataza đặc hiệu bạch cầu người, có hợp chất mới; cải tiến việc tinh chế naphtol AS-X photphat so với quy trình tài liệu [6] cách hịa tan kết tủa hỗn hợp dung mơi nước: THF tỷ lệ 1:5 Kết thu sản phấm naphtol AS-X photphat có độ tinh khiết cao Đã tiến hành nhuộm thử nghiệm photphataza đặc hiệu tế bào bạch cầu người dẫn xuất naphtol AS-X photphat tổng hợp Kết cho thấy có chất tổng hợp có độ nhạy tính đặc hiệu tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit bạch cầu ưa bazơ tương đương với chất tương ứng nhập ngoại Tài liệu tham khảo [1] Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh, Phan Văn Chi, Nguyễn Thị Bích Nhi, “Bước đầu tìm hiểu số biến đổi protein bệnh nhân lơxêmi cấp dòng lympho khoa Huyết học Truyền máu bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Y học Việt Nam,T.373 (2), 267-270, (2010) [2] Rebecca L Siegel, Kimberly D Miller and Ahmedin Jemal, “Cancer Statistics”, CA cancer J Clin 2016, vol 66, pp 7–30, (2016) [3] Bennett JM., Catovsky D., Daniel MT., “Proposals for the classification of the acute leukaemias French-American-British (FAB) cooperative group”, Br J Haematol, Vol.33 (4), 451–458, (1976) [4] Trần Văn Tính, Tổng hợp chất, chế tạo kít nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người, Luận án Tiến sĩ hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN, (2012) 36 T.T Hoa nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 30-36 [5] Trần Văn Tính, Bùi Thanh Hương, Nguyễn Đắc Thảo, Nghiên cứu chế tạo kit nhuộm hóa học tế bào để chẩn đốn dịng tế bào bệnh ung thư máu, Bệnh viện 19-8, Bộ công an, (2015) [6] Vaughan A., Guilbault GG., and Hackney D., Fluorometric Methods for Analysis of Acid and Alkaline Photphataza, Analytical chemistry, Vol.43( 6), 721-724, (1971) Synthesis of Naphthol as-substituted Phosphateusing as Substrates for Phosphatase Inhuman Leukemia Staining Tran Thi Hoa1, Tran Thi Thanh Tam1, Nguyen Dinh Duy3, Luu Van Boi1, Tran Van Tinh2 Faculty of Chemistry, VNU University of Science, 19 Le Thanh Tong, Hanoi, Vietnam Blood transfusion- Hematology Center, 19-8 Hospital HUS High School for Gifted Students, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Abstract: Naphthol AS-BI phosphate is used as substrate to classify leukocyte cell lines and differentiate T lymphocytes in acute leukemia In order to expand the source of high sensitivity and specificity substrates with a reasonable price, in this study were synthesized 3-[(N-aryl)carbamoyl]naphthalen-2-yl dihydroxyphosphate derivatives ( naphthol AS-X phosphates) by reaction of naphthol AS-X with POCl3 then hydrolyzed The results of specific phosphotase cells staining using synthesized naphthol AS-X phosphate derivatives showed that all of the substrates are positive with neutrophil, eosinophil and basephil Keywords: Naphthol AS-BI phosphate, Alkaline phosphatase, acute leukemia ... Tên chất Naphtol AS- D photphat Naphtol AS- OL photphat Naphtol AS- LC photphat Naphtol AS- BS photphat Naphtol AS- CA photphat Naphtol AS- BO photphat Bảng Hiệu suất, số số hóa lý, phổ IR MS chất tổng. .. ảnh nhuộm thử mẫu bệnh phẩm chất naphtol AS- X Cơ chất tổng hợp I II III IV V VI Hình ảnh tế bào bạch cầu dương tính nhuộm photphataza Kết luận Đã tổng hợp dẫn xuất naphtol AS photphat làm chất. .. phấm naphtol AS- X photphat có độ tinh khiết cao Đã tiến hành nhuộm thử nghiệm photphataza đặc hiệu tế bào bạch cầu người dẫn xuất naphtol AS- X photphat tổng hợp Kết cho thấy có chất tổng hợp có