Xác định giới tính gà bằng kỹ thuật PCR

TAP CHÍ KHOA HOC DHQGHN KHTN & CN T XX So 2PT 2004 X Á C Đ ỊN H G IỚ I T ÍN H G À B A N G K Ỹ T H U Ậ T P C R P h a n T u â n N g h ĩa , N g u y ễ n M ộng H ù n g , N g u y ế n T h ị V ân A n h , N g u y ế n Q u ố c T ru n g , N g u y ễ n T h ị T h ả o , N gu y ễ n T u ấ n A n h , Vũ P h n g Ly K hoa Sin h học, Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N M đ ầ u Gà nói riêng hay gia cầm nói chung nhóm vật ni đóng vai trị q u an trọng bậc việc cung cấp th ịt cho người Xác định sớm giới tính gia cầm có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu phôi học ứng dụng sản x u ất dê chủ động diều khiên tỷ lộ đực /cái theo hướng mong muốn Đê xác định sớm giới tín h gia cầm có sơ phương pháp khác áp dụng phân tích hình th lỗ h u y ệt hay phán biệt kiểu nhân Tuy vậy, phương pháp vừa nêu có hạn c h ế chỗ m ất nhiều thòi gian chi’ áp dụng dược cho sơ’ đơi tượng Chính vậy, n h ũng năm gần phương pháp sinh học phân tử dựa trê n sai khác m ức ADN cá th ể đực dược áp dụng [2.3,4,6,7,8,9,11] Mặc dầu vậy, áp dụng m ột sơ’ qui trình kỹ th u ật cơng bơ' [3,9] để xác định giới tính gà khơng th u k ết thực tin cậy Hơn thê nữa, Việt Nam việc áp dụng kỹ th u ậ t sinh học phân tử để xác dịnh giới tính gia cầm chưa dược quan tâm Nghiên cứu nhằm bước th iết lập qui trìn h xác định giói tính gia cầm từ giai đoạn phơi đến trưởng thành kỹ th u ậ t PCR cỏ độ nhạy độ tin cậy cao, góp phần hỗ trợ cho công tác nghiên cửu phôi sinh học củng p h át triển chản nuôi ỏ nước N gu y ê n liệ u v p h n g p h p n g h iê n u 2.1 N guyên liệu Nguyên liệu sử dụng để tách ADN m áu lấy từ gồ (G alus dom esticus), chim cút {Turnix tanki), bồ câu (Colum ba livià), vịt (Anas platyrhincha) phơi gà M ẫu phơi Phịng Cơng nghệ t ế bào động vật, thuộc T rung tâm S inh học phán tử Công nghệ tế bào cung cấp Các cập mồi dược m ua từ hãng Integrated DNA Technology (IDT, Mỹ), th an g chuẩn ADN klH in d ĩĩỉ kb hãng F erm entas (Lithoania) Các hố ch ấ t cịn lại đểu đ ạt mức tinh khiết cho nghiên cứu sinh học phân tử 2.2 P hư ơng p h p ADN máu gà hay gia cầm khác phôi gà tách kit GFX hãng Pharm acia (Thuỵ Điển) Ngồi ADN cịn tách theo phương pháp củ a Albarino Romanowski [1] có cải tiến ADN định lượng cách đo dộ hấp th ụ bước sóng 260 nm (AMn) kiểm tra băng điện di gel agarose P hản ứng chuỗi polym erase (PCR) thực m ột th ể tích 25^1 có chứa 1070 ng ADN khn, mồi xuôi mồi ngược nồng độ 0,5 nM, 2,5 đơn vị Taq ADN 156 X.R ill nil JJII'I hull ;j.I h.m ;■ k\ [hu.'H l’( k 157 polym erase v dNTP 0.4 mM C hẽ độ nhiệt bao gồm bước khởi dộng nóng ỏ 94°c phút, biến tín h ADN khn 94"C 30 giây, gắn mồi 65"C 15 giây, kéo dài chuỗi 72"C 25 giây, với 35 chu kv lặp lại giũ phán ứng 72"C phút, s n phấm dược phàn tích điện di gel agarose nhuộm băng bang ethidium bromide K ết q u n g h iê n cử u 3.1 T ách A D N từ m u p h ô i gà Để tách ADN từ m áu gà sử dụng kit tinh ADN từ máu ký hiệu CrFX h ãn g P harm acia, lượng máu sử dụng 2j.ll Riêng với phơi phải có thêm bước nghiền tế bào trước lấy m ẫu tách ADN, Lượng ADN thu từ khoảng 2-6 ng K ết kiểm tra độ điện di gel agarosel% dược trìn h bày ỏ hình Có dễ dàng nhận thấy rà n g ch ế phẩm ADN mẫu máu gà (A), chim cút (B; hai cột đầu) hay bồ cảu (B: hai cột tiếp theo) thuộc hai giới đực dều cho băng ngun vẹn có kích thước lớn khõng lần ARN ng tỏ chế phấin thu có độ cao Bẽn cạnh việc tách ADN kit GFX, liến hàn h tách ADN từ m áu gà theo phương pháp Albarino Romanowski []] Đây phương pháp áp dụng cho tách ADN lừ m áu người không dùng chất chống dông Tuv vậy, áp dụng phưrlng pháp đè' tách ADN từ m áu gà thấy rằ n g m áu gà dơng r ấ t nhanh chúng tỏi bô sung thêm vào m áu the tích tương điíơng dung dịch mi sinh lý (NaCl 0.9%) sứ dụng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (ti lệ 25:24:1 vê th ế tích) thay cho việc sử dụng chiết hai bước phenol chloroform: isoamyl alcohol qui trình gốc Kết phân tích cho thấy lượng ADN thu tương tự sử dụng kit, nhiên để tách ADN theo phương pháp này, lượng m ẫu cần lấy ban đổu từ 20 ị.il trỏ lên Kết diện di chế phẩm ADN thu đươe hình 1D cho thấy ADN thu từ máu gi1! trông gà m cho m ột bâng, kích thưốc lớn, không lẫn ARN Dể tách ADN từ phôi, chúng Lôi nghiền m ẫu ủ 37°c phút Sau ly tâm để thu tế bào tiếp tục tách chiết với qui trìn h tương tự nhu với m ẫu máu Ngồi , qui trìn h tách ADN từ phơi cẩn có thâm bưỏc xứ lỹ bảng ARNase dê loại ARN C hế phẩm thu dược có chất lượng khơng sai khác với ch ế phàm lách bằn g kit A Hình 1: Điện di agarose chè phãm ADN m áu g ia c ắm ph ôi gà A: ADN cùa mâu gà B: ADN cùa m áu c h im cú t (2 cột đẩu tiê n ) v bố câu (2 cột cuối cùng) C: ADN củạ phõi, D: ADN máu sà tách băng phương pháp không dùng kit M: thang chuân kb (A, B C) hay HindiII (D), P: Phơi