Tạpchí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tâ ̣p 34, Số (2018) Biến đổi A10398G gen ND3 ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phạm Thị Bích1, Nguyễn Ngọc Tú1, Nguyễn Thị Khuyên1, Đỗ Minh Hà1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1,* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Khoa Giải phẫu bệnh -Tế bào, Bệnh viện K, 43 Quán Sứ, Hoàn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 20 tháng năm 2018 Chỉnh sửa ngày 10 tháng 11 năm 2018; Chấp nhận đăng ngày 25 tháng 12 năm 2018 Tóm tắt: Biến đổi A10398G gen ND3 ty thể dẫn đến thay axitamin Threonine thành Alanine protein NADH dehydrogenase xác định có liên quan đến ung thư vú, ung thư phổi Tuy nhiên, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) liệu tần suất mối liên quan biến đổi A10398G với đặc điểm bệnh học bệnh chưa xác định Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành sàng lọc biến đổi A 10398G 86 bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam đánh giá mối liên quan giữa biến đổi với đặc điểm bệnh học bê ̣nh Sử dụng kỹ thuật PCR -RFLP giải trình tự ADN , biế n đổi A 10398G xác định với tỷ lệ 50/86 (chiếm 58,1%) bệnh nhân Trong , mơ u tần suất biến đổi 47/86 mẫu (chiếm 54,5%), mô lân cận u 49/86 mẫu (chiếm 56,9%) Biến đổi A10398G liên quan đến mức đô ̣ xâm lấ n của khố i u (giai đoạn T) (p0,05) Từ khóa:Biến đổi A10398G, gen ND3ty thể, UTĐTT, PCR -RFLP, giải trình tự ADN Mở đầu thế giới Tại Việt Nam, số ca bệnh UTĐTT chẩn đoán đứng thứ với tỷ lệ khoảng 7% tổng số ca ung thư [2].Trong các yế u tớ liên quan đến ung thư rối loạn ADN ty thể yếu tố nguy [3] Hơn nữa, hệ gen ty thể dễ bị biến đổi ADN nhân khơng có đoạn intron , khơng có protein histon phân bố gần các phức hệ hô hấ p của tế bào , nơi mà gốc tự tạo trình phosphoryl hóa oxy hóa [4] UTĐTT đứng thứ ba mức độ phổ biến nguyên nhân gây tử vong cao thứ tư ung thư toàn cầu [1] Tỷ lệ mắc tử vong UTĐTT khác đáng kể gi ữa vùng _ Tác giả chịu trách nhiệm: ĐT: 84-0912691460 Email: thaith@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4125 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 34, Số (2018) 1-6 Trên gen ND3 ty thể, số vị trí biến đổi G10176A, C10269T, C10272T, T10363C A10398Gđã xác định số loại ung thư [5] Trong số vị trí biến đổi nêu biến đổi A10398G nghiên cứu nhiều Ở ung thư vú, biến đổi A10398G khảo sát phụ nữ thuộc nhóm người khác người Mỹ gốc Phi, Mỹ da trắng, Mỹ gốc Âu [6, 7] nhóm phụ nữ người Việt Nam [8] Kết nghiên cho thấy mối liên quan biến đổi A10398G với ung thư vú khác chủng tộc người khác Ở ung thư phổi, biến đổi A10398G xác định dạng dị tế bào chất Đặc biệt, bệnh nhân có mức độ dị tế bào chất thấp dấu hiệu tiên lượng xấu bệnh [9] Đối với UTĐTT, liệu liên quan đến biến đổi A10398G thiếu Việt Nam giới Vì vậy, nghiên cứu tần suất biến đổi A10398G UTĐTT mối liên quan biến đổi với bệnh cần thiết Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp PCR-RFLPđể xác định biến đổi A10398G gen ND3, kết hợp phương pháp giải trình tự để khẳng định kết Thống kê tỷ lệ biến đổi đánh giá mối liên quan giữa biến đổi với đặc điểm bệnh học bê ̣nh UTĐTT nhóm bệnh nhân người Việt Nam Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu 86 cặp mẫu mô gồm mô u mô lân cận u 86 bệnh nhân UTĐTT cùng với thông tin bệnh nhân cung cấp từ Khoa Giải phẫu bê ̣nh - Tế bào, Bệnh viện K Hà Nội Mẫu lân cận u lấy cách khối u tối thiểu 5cm, diện cắt xác định khơng cịn tế bào ung thư Những thông tin bệnh nhân độ tuổi, giới tính, vị trí, kích thước u, độ biệt hóa giai đoạn bệnh giúp phản ánh nguy cơ, mức độ tiến triển ung thư bệnh viện cung cấp để đánh giá mối liên quan với biến đổi A10398G gen ND3 Trong đó, độ biệt hóa giai đoạn bệnh (theo phân loại TNM - Tumor- lymph Node- Metastases) phân chia theo tiêu chuẩn tổ chức ung thư Hoa Kỳ [10], độ tuổi xếp thành nhóm 50 50 tuổi (vì theo thống kê tổ chức ung thư Hoa kỳ 90% số ca mắc UTĐTT xác định sau 50 tuổi [11], vị trí ung thư chia thành hai nhóm ung thư đại tràng trực tràng theo cấu tạo giải phẫu Kích thước khối u chia thành nhóm: kích thước nhỏ 3cm; từ đến 3,5cm lớn 3,5cm 2.2 Phương pháp Tách chiết ADN tổng số: ADN tổ ng số từ mẫu mô bệnh nhân UTĐTT tách chiết kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) Kit tách chiết đảm bảo việc tách ADN ty thể Các bước tiến hành theo quy trình nhà sản xuất ADN sau tách chiế t đươ ̣c xác định nồng độ độ máy quang phổ Nano drop 2000c (Thermo, Mỹ) bảo quản ở -200C Khuếch đại đoạn gen ND3 PCR: đoạn gen ND3 có chứa vị trí 10398 khuếch đại PCR với cặp mồi đặc hiệu (cặp mồi 10398) với trình tự: 5’-CTG CCA CTA ATA GTT ATG TC - 3’ (mồi xuôi) 5’-GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA - 3’ (mồi ngược) Cặp mồi 10398 thiết kế phần mềm Primer-BLAST NCBI Phản ứng PCR gồm thành phần : 6,25 µl OneTaq Hot Start 2x Master Mix (Neb, Mỹ); 0,2 µM mồi gờ m mờ i xi và mồi ngược , 12,5-31 ng ADN khn, sau bổ sung H2O đến 12,5 µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm biến tính 940C 30 giây, gắn mồi 540C 30 giây kéo dài mạch 680C 30 giây, thực phản ứng PCR với 34 chu kỳ Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide Quan sát chụp ảnh gel hệ thố ng máy Gel Doc TM XR (Biorad) Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP): Sản phẩm PCR nhân lên từ đoạn gen ND3 có chứa vị trí 10398 dùng để phân tích RFLP với enzyme cắ t giới ̣n DdeI có vị trí nhận biết: 5’-C↓TNAG-3’ Thành phần P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 34, Số (2018) 1-6 phản ứng cắt: 2àl Fast Digestđ buffer 10X, 10àl sn phm PCR, 1àl Fast Digestđ enzyme v b sung H2O n 30àl Sản phẩm sau cắt điện di gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide Quan sát chụp ảnh gel hệ thố ng máy Gel DocTM XR (Biorad) Phân tích vị trí nhận biết enzyme cho thấy: trường hợp mẫu khơng có biến đổi vị trí 10398 (10398A) sản phẩm PCR sau cắt enzyme DdeI cho băng có kích thước 196 bp 50 bp Trong trường hợp mẫu có biến đổi (10398G) sản phẩn sau cắt enzyme cho băng có kích thước 158 bp, 50 bp 38 bp Giải trình tự đoạn gen chứa biến đổi: Giải trình tự ADN để khẳng định kết PCR RFLP Đoạn ADN cần giải trình tự sau tinh gửi đến công ty 1st BASE để giải trình tự Phần mềm Bioedit dùng để phân tích kết giải trình tự, so sánh kết giải trình tự thu với trình tự ADN ty thể tham chiếu NCBI mã số NC_012920.1 chương trình BLAST nucleotide NCBI [12] để xác định biến đổi Phân tích thống kê: Kiểm định Khi bình phương (Chi square test - χ2) hoă ̣c kiể m đinh ̣ xác Fisher(Fisher’s Exact test) với mức ý nghĩa α = 0,05 dùng để so sánh phân tích mối liên quan biến đổi A10398G với đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thư Giếng mẫu dạng khơng có biến đổi (10398A) sản phẩm PCR sau cắt enzyme cho băng có kích thước tương ứng 196 50 bp, giếng có băng kích thước tương ứng 158 bp 50 bp nên mẫu dạng có biến đổi (10398G) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen ND3và sản phẩm cắt enzyme DdeItương ứng(gel agarose 2,0%, nhuộm ethidium bromide) Giếng M: Thang chuẩn ADN 50 bp, giếng 1, 3: sản phẩm PCR, giếng 2, 4: sản phẩm cắt enzyme tương ứng mẫu nghiên cứu , giếng 5: đối chứng dương sản phẩm cắt enzyme đoạn ADN chứa vị trí 10398 dạng 10398A G (đã khẳng định giải trình tự) trộn lại với nhau, giế ng 6: đối chứng âm Kết thảo luận ADN tổng số 86 cặp mẫu mô UTĐTT dùng làm khuôn để nhân đoạn ADN chứa vị trí 10398 thuộc genND3 ty thể kỹ thuật PCR Sau sản phẩm PCR cắt enzyme DdeI Kết PCR-RFLP minh họa Hình Hình cho thấy, sản phẩm PCR giếng số 1, cho băng sáng, rõ nét, khơng có băng phụ với kích thước tương ứng 246 bp theo tính tốn lý thuyết thiết kế mồi chứng tỏ cặp mồi thiết kế đặc hiệu, điều kiện phản ứng PCR phù hợp Ở giếng số 2, sản phẩm PCR cắt enzyme DdeI Hình Trình tự đoạn ADN gen ND3 có chứa dạng 10398A 10398G Để khẳng định xác kết PCRRFLP, chúng tơi giải trình tự đoạn gen ND3 có chứa vị trí 10398 hai mẫu nghiên cứu có dạng 10398A 10398G (đã xác định phương pháp PCR-RFLP) thấy kết P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 34, Sớ (2018) 1-6 giải trình tự gen hồn tồn phù hợp với kết PCR-RFLP (Hình 2) Tổng hợp kết sàng lọc biến đổi A10398G phương pháp PCR-RFLP, xác định 50/86 (chiếm 58,1%) bệnh nhân có biến đổi A10398G mơ u mơ lân cận u Trong đó, mơ u tần suất biến đổi 47/86 mẫu (chiếm 54,5%), mơ lân cận u 49/86 mẫu (chiếm 56,9%) (Hình 3) Khơng có khác biệt tần suất biến đổi A10398G mô u mô lân cận u (p>0,05) Hình Phân bố A10398G vị trí mô bệnh nhân UTĐTT Bảng Tần suất mố i liên quan biến đổi A10398G với các đặc điể m bê ̣nh ho ̣ccủa bê ̣nh UTĐTT Tầ n suấ t A10398G (%) n Số Đặc điểm p lượng 10398A 10398G Tuổi Giới tính Vị trí ung thư Độ biệt hóa Kích thước u (cm) Giai đoạn N Giai đoạn T Giai đoạn bệnh =50 66 45,5 (30) 54,5 (36) Nam 41 39,0 (16) 61,0 (25) Nữ 45 44,4 (20) 55,6 (25) Đại tràng 45 33,3 (15) 66,7 (30) Trực tràng Rõ 41 10 51,2 40,0 (21) (4) 48,8 60 (20) (6) Vừa 39 43,6 (17) 56,4 (22) Kém 50,0 (3) 50,0 (3) =3; 3,5 42 45,2 (19) 54,8 (23) No 51 49,0 (25) 51,0 (26) N1và N2 32 37,0 (10) 63,0 (22) T1 0,0 (0) 100 (9) T2 35 45,7 (16) 54,3 (19) T3 T4 40 47,5 (19) 52,5 (21) I 30 43,3 (13) 56,7 (17) II 21 52,4 (11) 47,6 (10) III IV 33 33,3 (11) 66,7 (22) 0,07 ** 0,61 ** 0,09 ** 1,00* 0,11** 0,11 ** 0,03* 0,37** Ghi chú:*: Giá trị p nhận từ kiểm ̣nh Fisher , **: Giá trị p nhận từ kiểm ̣nh Khi bình phương (χ2) P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 34, Số (2018) 1-6 Theo công bố trước đây, tỷ lệ biến đổi A10398G loại ung thư khác khác Trên bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam xác định tỷ lệ biến đổi A10398G tính chung hai mơ 58,1%, tỷ lệ nhóm bệnh nhân ung thư vú người Ba Lan 23% [13], bệnh nhân ung thư phổi với mức độ biến đổi từ 0,31-97,04% [[8]] Như thấy tần suất biến đổi liên quan đến loại ung thư Mối liên quan biến đổi A10398G với đặc điểm bệnh học bệnh UTĐTT xác định kiể m định Khi bì nh phương (χ2) kiểm định xác Fisher , kết trình bày Bảng Kết kiểm định thố ng kê (Bảng 1) cho thấy tần suất biến đổi A1039G không liên quan với đặc điểm độ tuổi, giới tính bệnh nhân, vị trí, độ biệt hóa, kích thước , giai đoạn TNM khớ i u (p>0,05) liên quan với mức độ phát triển khối u (giai đoạn T) (p0,05), liên quan đến mức độ lan sâu vào thành ruột khối u (giai đoạn T) (p