Phát triển thuật toán cho phân lập tế bào dựa trên kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao

UNIVERSITE NATIONALE DU VIETNAM, HANOI INSTITUT DE LA FRANCOPHONIE POUR L’INNOVATION (Renommé de l’Institut Francophone International, IFI) _ FLORIAL JEAN BAPTISTE DÉVELOPPEMENT D'ALGORITHMES POUR L'ISOLEMENT CELLULAIRE BASÉ SUR LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE À HAUT DÉBIT PHÁT TRIỂN THUẬT TOÁN CHO PHÂN LẬP TẾ BÀO DỰA TRÊN KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG THƠNG LƯỢNG CAO MEMOIRE DE FIN D’ETUDES DU MASTER INFORMATIQUE HANOI – 2018 UNIVERSITE NATIONALE DU VIETNAM, HANOI INSTITUT DE LA FRANCOPHONIE POUR L’INNOVATION (Renommé de l’Institut Francophone International, IFI) FLORIAL JEAN BAPTISTE DÉVELOPPEMENT D'ALGORITHMES POUR L'ISOLEMENT CELLULAIRE BASÉ SUR LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE À HAUT DÉBIT PHÁT TRIỂN THUẬT TOÁN CHO PHÂN LẬP TẾ BÀO DỰA TRÊN KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG THÔNG LƯỢNG CAO Spécialité : Systèmes Intelligents et Multimédia Code : Programme pilote MEMOIRE DE FIN D’ETUDES DU MASTER INFORMATIQUE Sous la direction de: (Post Doc ZMBH, Dr Constantinou Iordania) HANOI – 2018 ATTESTATION SUR L’HONNEUR J’atteste sur l’honneur que ce mémoire a été réalisé par moi-même et que les données et les résultats qui y sont présentés sont exacts et n’ont jamais été publiés ailleurs La source des informations citées dans ce mémoire a été bien précisée LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Các thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Signature de l’étudiant FLORIAL JEAN BAPTISTE Préface : Ce mémoire de mtrise a été rédigé dans le cadre du stage de fin d’étude réalisé au : Centre de biologie moléculaire de l'Université de Heidelberg (ZMBH) dans la période allant de DECEMBRE 2017 - JUIN 2018, sous la supervision du Prof Dr Michael Knop Ce travail de recherche sera utile aux chercheurs s’intéressant aux des domaines suivants : - Développements de plugin pour Micro-manger Interface graphique pour Contrôler un microscope conventionnelle fluorescente et un système de laser UV Destruction de levure fluorescence l’aide d’un système de laser Comptage et segmentation cellulaire Acquisition d’image fluorescente partir de plusieurs canaux En ce moment plusieurs approches existent et permettent chacune d’apporter un élément de solution aux domaines précités En effet, notre approche est différente du fait que nous abordons une automatisation de ces concepts, nous faisons la combinaison de ces recherches en une seule application pour montrer une meilleure et autre utilisation de l’acquisition d’image et de la segmentation cellulaire pour la destruction de cellule fluorescente Dans ce travail, nous ne comptons pas rester la segmentation, nous comptons ainsi montrer l’utilité de la classification cellulaire dans la destruction de cellule fluorescente La destruction des cellules se fait en se basant sur sa couleur d’émission (exemple : VFP verte fluorescence protéine) Nous présentons les commandes utilisées pour contrôler le microscope, le laser, les algorithmes créer et ceux qui existent déjà que nous avons modifié, comment nous ciblons les cellules et choisissons lesquelles détruire avec le laser Ce document est ộcrit entiốrement en franỗais Cependant, il faut souligner que plusieurs termes anglais seront utilisés car d’une part notre travail de recherche a été mené dans un environnement anglophone y compris les documents qui nous ont été fournis et dautre part, la traduction franỗaise de ces derniers enlève l’originalité du terme en question Le sujet de ce stage a été acquis dans le cadre d'un projet global, le terme qui définit en toute simplicité l’objectif de ce stage est « Le développement d'algorithmes pour l'isolation cellulaire au laser basé sur la microscopie fluorescence haut débit » Au moment de la rédaction de ce rapport, les exigences par rapport au plan de stage ne sont pas au niveau désireux et le travail continu, nous comptons avoir des résultats qui pourront être publiés dépendamment des résultats des expériences qui seront effectuées en environnement réel du laboratoire Résumé L'analyse fonctionnelle des échantillons biologiques des fins de diagnostic ou de recherche nécessite souvent l'isolement de petites populations de cellules issues de mélanges hétérogènes Dans cette optique, ce travail se situe dans le cadre d’un projet qui vise l’isolation cellulaire sélective haut débit basée sur la microfluidique imprimée et la microscopie fluorescence D’un côté, une équipe travaille sur le développement de dispositifs microfluidiques pour l'imagerie De l’autre côté, nous procédons au développement et l'automatisation d'une installation de microscopie fluorescence capable de l'isolement des cellulaires sélectifs basés sur les lasers UV Nous voyons l’utilisation d’un microscope fluorescence conventionnelle équipée de deux lasers qui peuvent être utilisés pour l’isolement cellulaire Quand nous parlons d’isolement, nous faisons référence l’élimination de cellule sélective Traditionnellement, nous procédons au développement d’algorithmes qui vont nous permettre de contrôler et interconnecter les dispositifs lasers UV (UGA-42 Firefly) et le microscope fluorescence l’aide d’un ordinateur Ensuite, l’exploitation d’algorithmes de segmentation des cellules imagée pour faire la sélection automatique des cellules a isolé Tout ceci pour être intégré sous forme de plugin la plateforme micro-manager pour être disponible au chercheur pour la validation du système dans le contexte de la biologie moléculaire Mots clés : Micro-Manager, Plugin, Microscope, RappOpto UGA-42-Firefly, segmentation cellulaire Acquisition d’image, isolation cellulaire Abstract Functional analysis of biological samples for diagnostic or research purposes often requires the isolation of small cell populations from heterogeneous mixtures In this perspective, this work is part of a project that aims at selective high flow cellular isolation based on printed microfluidics and fluorescence microscopy On one side a team works for the development of microfluidic devices for imaging, we proceed to the development and automation of a fluorescence microscopy facility capable of selective cellular isolation based on UV lasers We see the use of a conventional fluorescence microscope equipped with two lasers that can be used for cell isolation When we say isolation we are talking about the elimination of selective cells, traditionally we proceed to the development of algorithms that will allow us to control and interconnect UV laser devices (UGA-42 Firefly) and the fluorescence microscope using a computer, then the exploitation of algorithms of segmentation of cells imagined to make the automatic selection of cells isolated All this to be integrated as software to the micro-manager platform to be available to the researcher for system validation in the context of molecular biology Key words: Micro-Manager, Plugin, Microscope, RappOpto UGA-42-Firefly, cell segmentation Image Acquisition, Cell Killing Contenus Préface : Résumé REMERCIEMENTS INTRODUCTION Chapitre 1- Structures réalisant le stage 10 1.1- L’institution d’accueil 10 1.2- L’environnement de travail 12 1.3- Contrainte de stage: 13 1.4- Matériels 13 1.5- Objectif de stage 14 1.6- Technique de travail 15 Chapitre Micro-manager: 17 2.1- Micro-manger et ImageJ : 17 2.2- L'état de l'art [1] 20 Chapitre 3- Segmentation d'image cellulaire 26 3.1- CellX ++ : Segmentation cellulaire pour C ++ [17] 26 3.2- Clustering (Regroupement) 30 3.3- Algorithme de recherche de Pixel maxima (ImageJ Méthodes) 34 Chapitre : Solution, Contraintes et Technique utilisés 36 4.1- Solution 36 4.2- Les Contrainte notre solution 38 4.3- Méthodes / Techniques utilisés 39 4.3.1- Microscopie a fluorescente 39 4.3.2- cellules de levure : 41 4.3.2.1- Protocol pour la Culture de levure de fission 44 Chapitre : Conception et réalisation de l’application 45 5.1- Conception 45 5.1.2 -Analyse des besoins : 45 5.1.2.1- Exigences fonctionnelles : 45 5.1.2.2- Exigences non fonctionnelles 46 5.2- Implémentation 47 5.2.1- Architecture de la solution 47 5.2.2- Diagramme de package 48 5.2.3- Organigramme représentant le processus d’isolation des levures 49 5.2.4- Diagramme de classe 51 5.2.5- Acquisition des Images 52 5.2.6- Classification d’image cellulaire : 54 5.2.7- Segmentations d’images 54 5.3- Présentations du GUI et ces fonctionnalités principales: 57 Chapitre : Expérimentation, Résultats 61 6.1- Image acquisition : 61 6.2- Segmentation 61 6.3- Isolation cellulaire 62 Conclusion 64 GLOSSAIRE 66 Bibliographie 67 Webographie 68 Table des figures Figure 1: Structure hiérarchiques non détaillée des institutions {4} 11 Figure 2: L’environnement de travail 12 Figure 3: Matériels de travail 14 Figure 4: Le cycle itératif {2} 15 Figure : interface Graphique de Micro-manager et ImageJ [1] 18 Figure 6: Schéma fonctionnel de l'architecture logicielle de Micro-manager [1] 19 Figure 7: HCS Site Génération plugin [1] .20 Figure : Interface graphique du projecteur plugin [1] .21 Figure : Interface graphique du MDA [1] 23 Figure 10: Étapes de l'algorithme MPCS [17] 27 Figure 11 : Exemple d'utilisation de CellX ++ [17] .28 Figure 12 : Performances de segmentation de CellX ++ 29 Figure 13 : Regroupement K-moyens (K- means clustering) processus [14] .30 Figure 14 : Résumé de l'approche proposée [13] 31 Figure 15 : Résultats de la segmentation l'aide de l'algorithme k-means [13] 32 Figure 16 : Application de la méthode du trou de remplissage 33 Figure 17 : Imagej/Fiji Find Maxima [18] 35 Figure 18 : Interprétation graphique et structurelle de la Solution 36 Figure 19 : Schéma d'un microscope fluorescence [9] .39 Figure 20 : Représentation d’une Levure {1} 42 Figure 21 : émission de différents fluorochromes {6} 43 Figure 22: Architecture physique et logicielle de notre solution {5} 47 Figure 23 : Diagramme de packages « org.micromanager.rapp » .48 Figure 24 : organigramme de notre fonctionnalité principale (Run Sequence) 49 Figure 25: Diagramme UML des classes impliquées dans tous les paquets 51 Figure 26 : Images capturées sous différents canaux 52 Figure 27 : Configuration des canaux (en haut), et d’images acquisition (en bas) .53 Figure 28 : fonction Mathématique du floue gaussienne {8} .54 Figure 29 : Image capturer sous différents canaux 55 Figure 30 : Image capturer sous différents canaux 56 Figure 31 : Paramètre des fonctions pour déplacer le spot du laser 57 Figure 32: GUI 1, Le contenu du menu de configuration .58 Figure 33 : GUI “Point and Shoot” .59 Figure 34 : GUI GUI “Séquence Acquisition “ 60 Figure 35:Segmentation avec Find Maxima 61 Figure 36: Segmentation non précise 61 Figure 37 : Résultat de l'isolation 62 Figure 38 : Résultat de l'isolation .63 REMERCIEMENTS Je profite avant tout développement sur cette expérience professionnelle de commencé ce rapport de stage par des remerciements, Dieu et ceux qui m’ont beaucoup appris au cours de ce stage, mon encadrante qui est la responsable du projet celle qui m’a donnée l’opportunité d’avoir ce stage Dr Constantinou Iordania Au Prof Dr Mickel Knop le leader du laboratoire pour sa confiance et sa gentillesse de faire de ce stage un moment très profitable Tous ceux qui m’ont accompagné tout au long de cette expérience professionnelle avec beaucoup de patience et de pédagogie Je remercie l’ensemble des employés et membres du Knoplab, spécialement Dr Frederik Görlitz pour son orientation qui m’a rendu les taches beaucoup plus facile A Konrad Herbst et Daniel Kirrmaier pour leurs conseils, et de m’avoir introduit la biologie cellulaire et l’utilisation des matériels et quelques techniques de recherche du laboratoire Je remercie le personnel de l’IFI pour leur accompagnement dans les démarches administratives avant et après stage, tous les professeurs de L’IFI pour leur enseignement Merci tous l’équipe de L’IFI qui étaient convainque de me donner une chance en particulier Mr Ho Tung Vinh lors de l’interview d’entrer L’IFI Enfin, je remercie mes Parents en particulier mon Père qui m’a toujours soutenue financièrement et moralement Je remercie grandement L’AUF pour avoir financé cette formation que je n’aurais pas eu les moyens d’accéder sans eux 54 5.2.6- Classification d’image cellulaire : Notre système d’imagerie par fluorescence nous permet de classifier les images en fonction des levures a imagé Rappelez-vous qu’on utilise types de levure GFP, RFP, BFP Nous classifions les images en fonction de quelle types de lumière a été utilisée pour avoir cette image BrightField_Images (Images éclairer avec une source de lumière blanche) Figure 26 (a1) RFP_Images (Images fond noir, éclairé avec une source de lumière Vert) Figure 26 (a3) GFP_Images (Images fond noir, éclairé avec une source de lumière Blue) Figure 26 (a2) BFP_Images (Images fond noir, éclairé avec une source de lumière Rouge) En se basant sur cette classification, nous pouvons choisir quels types de levure éliminer du champ de vision Pour éliminer les levures fluorescence verte, il suffit de segmenter l’image GFP_Images pour avoir la position de toutes les levures GFP, ensuite les exposer au laser 5.2.7- Segmentations d’images Pour la segmentation notre implémentation se base sur l’algorithme « find maxima » cette algorithme fonctionne très bien sur une image fluorescence Comme on a vu dans l’état dès l’art (ch.2.4) cet algorithme marque les levures en fonction de leur brillance, L'image obtenue des canaux contient beaucoup de brut, alors pour les enlever on filtre les images avant de lancer l’algorithme, ce filtre moyen supprime les pixels chauds qui nous donneront des maxima de fausses intensités D’où l’application d’un flou gaussien (également connu sous le nom de lissage gaussien) est le résultat du flou d'une image par une fonction gaussienne (du nom du mathématicien est scientifique Carl Friedrich Gauss) C'est un effet largement utilisé dans les logiciels graphiques, une technique de traitement d'image pour éliminer les imperfections, généralement pour réduire le bruit de l'image et réduire les détails L'effet visuel de cette technique de flou est un flou lisse ressemblant celui de voir l'image travers un écran translucide, distinctement de l'effet bokeh produit par une lentille floue ou l'ombre d'un objet sous un éclairage habituel Le lissage gaussien est également utilisé en tant qu'étape de prétraitement dans l’algorithme recherche de maxima afin d'améliorer les structures d'images différentes échelles Définition de la fonction gaussienne a deux dimensions: comme : Figure 28 : fonction Mathématique du floue gaussienne {8} 55 x, y sont les coordonnées pixel de l’image où l'origine est placée au centre, (C’està-dire x = et y = correspond au pixel central de l’image.), σ (Sigma) est l'écart-type de la distribution gaussienne Pour des écarts-types plus importants, des pixels plus gros sont nécessaires pour effectuer avec précision le lissage gaussien Apres l’application du floue de Gaussien, l’algorithme est appliqué pour trouver le point le plus lumineux dans l'image floué et ensuite le pixel avec l'intensité maximale est renvoyé Function Dans ImageJ : // Instanciation du flou Gaussien GaussianBlur blur = new GaussianBlur(); // L'image est d'abord floue blur.blurGaussian(blurImage, 10, 10, 0.01); Trouvez l'endroit le plus lumineux dans L'image floué Point pt = ImageUtils.findMaxPixel(blurImage); Résultats (a1) (b1) Figure 29 : Image capturer sous différents canaux L’image 29 (a1) a été segmenté les levures détecter est numérotés, mais nous pouvons observer des point numéroté dans le vide ce qui résulte que le laser va frapper dans des positions erronées L’image 29 (b1) aucune levure n'a été détecté donc la fonction de segmentation va retourner une valeur nulle, ce qui bloquera automatique le lancement de la fonction d’élimination cellulaire 56 (a1) (b1) Figure 30 : Image capturer sous différents canaux Nous avons aussi testé les algorithmes sous un champ de vision qui contient beaucoup plus de levure, dans l’image 30 (a1) on a pu détecter toutes les levures mais on peut aussi voir que la segmentation est dépassée L'un des inconvénients des champs avec beaucoup de levure c’est qu’il faut ajuster l’avance l’intensité du laser pour ne pas exposer les levures voisines non concerné Dans l’image 30 (b2) les fluorophores émettent une faible quantité de fluorescence on voit que l’algorithme fonctionne mais le taux d’erreur est très élevé 5.2.8- Destruction de levure Une fois l’image segmentée les coordonnés pixels avec les intensités maximales sont renvoyés une fonction qui transforme ces points en fonction d'une cartographie de calibrage non linéaire Cette transformation nous permet d’éclairer le laser la bonne position, illuminer un point la position x, y résulte exposer la levure a cette position au laser À noter celons nos expérimentations quelques millisecondes suffit une levure exposée au laser pour perdre sa fluorescence et plus mourir La fonction « «setEposure » détermine le temps que le spot du dispositif de ciblage passera d’une position une autre Pour l’instance on ne peut nos expérimentations ne nous permettent pas de donner des chiffres exacts pour exposer une levure au laser, mais nous ont eu fait des tests avec des valeurs comprissent entre [0.1, 1.5] secondes et on peut dire qu’à partir de 800 millisecondes dépendamment de l’intensité du laser, les levures sont assez bien exposées pour être détruit 57 Figure 31 : Paramètre des fonctions pour déplacer le spot du laser La fonction displaySpot permet de positionner le point lumineux du laser a une position (P), cette position est obtenu en transformant une position d’un pixel (x, y) par rapport au Mappage de la calibration du dispositif 5.2.8.1- Calibration du dispositif de control La calibration est une comparaison entre une mesure connue (pixel cordonne) et la mesure l'aide de notre dispositif de ciblage En outre pour nous assurer que le spot (point lumineux du laser) correspond la position exacte des cordonnes pixel retourné lors de la segmentation, on doit mener une procédure de calibrage automatique vộrifie la prộcision de lUGA-42 et dộtermine la traỗabilitộ de la mesure 5.3- Présentations du GUI et ces fonctionnalités principales: Nous avons voulu créer une interface graphique attrayante et facile utiliser conỗus avec la technique Swing de java Nous avons réfléchi la qualité de l’IHM, cette démarche est primordiale pour fournir l’utilisateur un moyen efficace et utilisable d’interagir avec le système Notre interface comporte deux parties principales (le menu et l’espace des contenus), ceux qui garantissent une simplicité d’utilisation, des couleurs harmonieuses pour une ergonomie qui rend l’utilisateur plus l’aise, tout a été calculé les messages d’erreur, nous voulons noter tout de même que ce programme et toujours en développement donc ici nous avons une interface assez fonctionnelle mais qui manque d'autres fonctionnalités La figure ci-dessous représente le menu de configuration et son contenu 58 Figure 32: GUI 1, Le contenu du menu de configuration Le menu de configuration nous donne accès plusieurs contrôles différents, dans cet espace nous pouvons modifier le temps d’exposition du laser Le bouton « Open Light » devrait allumer et éteindre la lumière, dans notre cas le contrôle n’est pas encore parfait, le bouton déconnecte le dispositif de ciblage de micromanger, une situation irrégulière que nous devrons corriger Appuyez sur le bouton "Show Center spot" pour éclairer le centre de la portée du dispositif de ciblage Ce point central doit être visible dans le champ de vision de la caméra - si ce n'est pas le cas, l'alignement physique de la caméra et/ou du dispositif de ciblage devra être ajusté Le bouton « Start Calibrait » Lance une procédure de calibrage automatisée, dans laquelle les coordonnées internes de l’UGA-42 sont mises en correspondance avec les coordonnées des pixels avec les coordonnées des pixels de l'appareil photo Ce calibrage permet au plugin de convertir les clics de souris ou les (ROI) région d’intérêt dessinés sur l'image de la caméra en direct en événements de ciblage photographique dirigé avec précision Enfin tout en bas nous avons les menus de configurations de canaux qui permettent de définir les canaux par défaut Ces menus déroulants sont très importants au moment de la séquence, rappelez-vous ce que nous avions dit concernant les levures fluorescent « si elles restent trop longtemps sous une lumière d’excitation elles vont perdent leurs 59 fluorophores, donc vont devenir non fluorescentes » Au moment de l’imagerie il est important que les levures soient excitées par de la lumière fluorescence mais cette lumière ne peut rester active au moment de la segmentation ou la destruction des levures Ici nous configurons par défaut des canaux non-fluorescence pour qu'une foi en phase d’acquisition terminer ces canaux prendra le relais pour empêcher un blanchissement des levures fluorescent Figure 33 : GUI “Point and Shoot” Le menu « point and shoot point » et tirer, peut être utilisé pour tester le dispositif de ciblages avec ou sans segmentation Un processus manuel peut être opéré en appuyant sur le bouton « point and shoot » qui va activer la combinaison shift du clavier et le bouton gauche de la souris, avec cette fonctionnalité on peut cibler les levures individuellement avec la souris On peut aussi sélectionner des régions manuellement pour ensuite lancer un ciblage automatique avec les boutons « set/add Roi » et « Kill Mark Cells », noter que cela nécessite la désignation des régions d’intérêt au préalable Dans cette même interface on peut aussi lancer une procédure semi-automatique avec le bouton « Kill Detected Cells», une fois cliquer dessus, cela capture une image du « live View » Vue en direct de micro-manager ou demande choisir une image cellulaire de l’emplacement disque pour être segmenté puis envoie les coordonnés des points correspond aux levures au dispositif de ciblage pour le balayage au laser 60 Figure 34 : GUI GUI “Séquence Acquisition “ Cette interface (Figure 34) est considéré comme principal car elle regroupe l’ensemble des fonctionnalités et pourrait les combines en une sộquence dexộcution Elle est conỗue pour simplifier le processus d'acquisition d'images, de segmentation, de positionnement et pour la destruction de levure Elle regroupe l’ensemble des procédures de (figure 24), nous avons pensé une interface dynamique où en fonction des entrer l’interface change, et l’utilisation pourrait configurer de par lui-même le processus d’acquisition Cette interface est dynamique dans le sens que l’utilisateur peut lancer une séquence d’acquisition avec ou sans segmentation, d’ajouter le nombre de canaux désireux, de choisir ou pas quel canal où les levures vont être mises mort, chaque modification de l’interface un résumé affiche de ce que pourrait sembler la séquence Les préférences de java nous permettent de garder en mémoires ou de sauvegarder sur le disque les la dernière configuration de l’utilisateur 61 Chapitre : Expérimentation, Résultats 6.1- Image acquisition : Notre acquisition d’image fonctionne parfaitement, il nous reste intégrer multi-positionnement Pour les tests dans une position fixée manuellement 310 millisecondes suffisaient pour avoir une image de qualité une exposition correcte des trois canaux choisis 6.2- Segmentation (Recherche maxima) (a) Image original (Image segmenté) Figure 35:Segmentation avec Find Maxima Analyse des particules (ImageJ) Figure 36: Segmentation non précise 62 Les images (35) ci-dessus représente la meilleur segmentation avec précision qu’on a eu au cours des tests, mous navons pas conỗus doutils pour calculer la pression, tout ceux-ci ce fait manuellement en observant l’image original et l’image segmenter a l’œil nu Pour cette image l’algorithme a pu détecter toute les levures visibles de ce canal mais on remarque l’erreur dans deux régions marquées en bleu qui ne figure pas sur l’image originale Les images (36) ci-dessus représentent des résultats d’une segmentation avec l’option analyse des particules de ImageJ, nous avons remarqués plus d’erreur en utilisant celui-ci qu’à la Recherche maxima L’image droite les espace encercle avec du rouge, l’algorithme a marqués ces postions comme maxima, mais nous pouvons remarque dans l’image originale que ces position ne contiennent pas de point lumineux Ces erreurs sont du fait que dans c’est position d’autres levures qui n’étaient pas censé être marque le son, et représente une erreur de segmentation ou d’acquisition 6.3- Isolation cellulaire Pour les tests nous avons utilisés les deux lasers (355 nm pulsé, 405 nm continu onde) des intensités variables le plus souvent 50 % et ont identifié les conditions d'éclairage et temps nécessaire la destruction des cellules de levure Pour ce faire, nous avons mélangé des cellules de levure étiquetées avec une protéine de fluorescence verte avec des cellules non marquées et tenté de tuer sélectivement les cellules marquées Nous avons remarqué qu’en augmentant la puissance du laser les levures détecté était pu être isolés plus rapidement, mais les levures voisines non détectées pouvaient être exposés et détruite cause d’une intensité trop grande du laser (a) Image originale, (b) image segmenté (c) image après exposition au laser Figure 37 : Résultat de l'isolation Figure 37 (a) représente l'image capturée dans les champs division du canal GFP, l’image est segmentée en (b) puis les coordonnées sont envoyer au dispositif de ciblages 63 pour éclairage au laser avec une demi-seconde Les résultats attendus de cette expérimentation n’étaient pas satisfaisant car on voulait isoler toutes les levures, mais on peut remarques dans l’image (c) captures après exposition au laser que des levures sont toujours visibles dans ce champ de vision Nous avons mené d’autres expérimentations qui nous permettent d’expliquer ce manque 1- Les levures bouges : les levures sont des organismes vivant qui bouge, bien que le déplacement soit très faible, mais le processus d’isolation prend du temps dépendamment du temps d’exposition et la qualité des protéines des levures Donc après segmentation il arrive que le laser arrive une position que la levure a déjà quittée Solution : fixer les levures dans la plaque ceux qu’elles restent en place, travail pour les biologistes 2- Pour des levures très fluorescentes une exposition au laser plus longtemps est recommandée Solution : augmenter le temps d’exposition des levures au laser au moment de l’isolation Figure 38 : Résultat de l'isolation Nous avons effectué d’autres teste (Figure 38) en augmentant l’exposition du laser avec un champ avec moins de levure en augmentant le temps d’exposition au laser de seconde pour chaque levure Et on a aussi augmenté l’intensité du laser 70% ce qui même les levures les plus fluorescées en notre possession n’ont pu résister dans une seconde d’exposition 6.1- Temps d’exécution de notre plugin par rapport au donner d’enter : On peut juger que le plugin exécute ces taches très rapidement, l’acquisition d’image sur trois ne canaux prend que 210 millisecondes et peut prendre moins ou plus jusqu’à 610 millisecondes en fonction des types de levures La segmentation aussi s’exécute rapidement moins d’une seconde pour segmenter et marquée en créant une nouvelle image pour un champ de vision environ 500 levures Le processus d’exposition au laser dépend aussi de la qualité des protéines et le nombre de levures dans le champ de vision 64 Conclusion Les deux premiers mois j’avais des difficultés comprendre les exigences de mon encadrant, je ne cernais pas le projet dans sa totalité, cause des techniques utilisées que je ne mtrisais pas À plusieurs reprises je produisais des fonctionnalités non adaptées aux besoins, donc j’ai dû chaque fois modifier les informations en entrée chaque suite d’un processus, d’où l’intérêt du cycle itératif {2} qui est justement de se concentrer sur l’essentiel, puis de raffiner chaque « tour de boucle » Cette méthode était la bonne car la fin le travail accompli dans une tâche allait assurément respecter les besoins, mais le problème si dans un tour du cycle les fonctionnalités développées correspond pas aux spécifications, le prochain tour de la boucle on devait ré-spécifier et réadapter le code, ce qui pouvait apporter un problème de manques de temps l’avenir L’expression des besoins était effectuée par l’encadrant et difficile pour moi de comprendre et coder exactement, d’où le besoin de prendre une pose en développement pour se concentrer sur la compréhension du projet donc je pourrais moins même exprimer les besoins J’ai passé quelques semaines comprendre quelques méthodes de microcopie fluorescence et des bases de culture des cellules pour être autonome et après j’ai été apte définir les taches en tant que programmeur et aller plus vite Au cours de ces mois de travail nous avons entrepris de développer un système autonome qui permettrait l'isolement sélectif rapide basée sur la microscopie fluorescence Pour aboutir nos fins nous utilisons les microscopes fluorescence de la marque Nikon {3} et le dispositif de ciblage de la compagnie RappOntoElectronics l'Uga-42 firefly {5} pour éliminer les cellules indésirables Les lasers du rap sont entrnés de manière autonome et le ciblage est basé sur les résultats du traitement automatique sur l'image Notre méthode de détection de cellule est basée sur la segmentation cellulaire, nous avons utilisé un algorithme facile implémenter, la recherche de maxima combiner avec la floue de gaussien Le choix au départ était d’utiliser un algorithme qui prend en compte beaucoup plus de caractéristique que seulement des pixels, mais aussi la forme des levures et la localisation des fluorophore Nous avons expliqué les difficultés, donc on a dû appliquer une solution qui nous donne des résultats proches des attentes mais pour le moment la précision n’est pas encore au point Ce Plugin a ộtộ conỗu pour être réutilisable Il serait intéressant de mener de nouvelles recherches sur la segmentation, ou des méthodes d'apprentissage supervisé Cela permettrait au RappPlugin d'avoir un plus large éventail d’utilisations de son domaine d'application Comme le RappPlugin est en grande partie basé sur la bibliothèque ImageJ et micro-manager, il serait bien d’exploiter en plus les fonctions de base sans a avoir afficher les autres interfaces Les directives de conception les plus importantes de notre projet étaient la modularité et l'extensibilité, en suivant ces 65 principes généraux, nous avons montré la faisabilité de ce projet L’outil existant pour contrôler les appareils utilisés pour ce projet ne prenait pas en compte l’isolation automatique, donc notre plugin devait apporter une améliorer ce manque Nous faisons une acquisition séquentiels couplé avec une segmentation d’image, puis l’isolation des levures ce que l’outil existant ne permettait pas D'un point de vue personnel, ce stage a été vraiment enrichissant Cela m'a permis de découvrir un environnement de travail, et notamment d'apprendre résumer et présenter mon travail Travaillent chaque semaine devant les chercheurs Plus important encore, j'ai interagi en anglais avec des personnes de différents domaines (Informatique, Biologie, Physique) Cette variété est, je crois, une excellente faỗon d'exploiter les connaissances dans un domaine, car chacun y contribue avec sa propre domaine d'expertise 66 GLOSSAIRE Micro-Manager : un logiciel pour le contrôle des microscopes automatisés, intégré d’une application de traitement d'image ImageJ, μManager fournit une solution d'imagerie complète open source et gratuite Plugin : est un composant logiciel qui ajoute une fonctionnalité spécifique un programme informatique existant Lorsqu'un programme prend en charge les plug-ins, il permet la personnalisation RappOpto UGA-42-Firefly : L'UGA-42 Firefly est un système de spot mobile base de galvanomètre équiper d’un système laser semi-conducteurs allant de l'UV profond l'IR conỗu pour l'ộclairage de petites taches dans le champ de vision du microscope Microscope fluorescence: La microscopie de fluorescence est un outil d’analyse très puissant qui combine les propriétés grossissantes de la microscopie optique avec la visualisation de la fluorescence Fluorochromes: La fluorescence résulte d'un processus qui se produit lorsque certaines molécules appelées fluorophores, fluorochromes ou colorants fluorescents absorbent la lumière L'absorption de la lumière par une population de ces molécules élève leur niveau d'énergie un bref état excité En se désintégrant de cet état excité, ils émettent de la lumière fluorescente microfluidique : La microfluidique est la science et la technologie des systèmes manipulant des fluides et dont au moins l'une des dimensions caractéristiques est de l'ordre du micromètre [Wikipédia] ROI : (Region of Interest) région d’intérêt RappPlugin : Le nom de du plugin développé au cours de ce stage Σ (σ): Sigma l'écart-type de la distribution gaussienne cytométrie : La cytométrie en flux (CMF) est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractérisant Microdissection : La microdissection fait référence une variété de techniques où un microscope est utilisé pour aider la dissection (Couper en morceaux) LED : abrộgộ en DEL en franỗais est un dispositif opto-ộlectronique ou diode électroluminescente capable d’émettre de la lumière lorsqu’il est parcouru par un courant électrique 67 Bibliographie [1] Arthur Edelstein, Nenad Amodaj, Karl Hoover, Ron Vale, and Nico Stuurman (2010), Computer Control of Microscopes Using MicroManager, John Wiley and Sons, Inc [2] Dennis Trautwein, (2016), Setting up Jetbrains IntelliJ IDEA to develop MicroManager 1.4 Plugins, Powered by Jekyll using the HPSTR Theme [3] Austin Blanco, Pariksheet Nanda (18:33, 18 September 2012) Comparison with other microscopy software, (PDT) [4] Mortimer Abramowitz - Michael W Davidson (2012), Introduction to Fluorescence Olympus America Inc The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310 [5]JoVE Science Education Database (2018), Les techniques générales de laboratoire Introduction la Microscopie de Fluorescence JoVE, Cambridge, MA, [6] Dimopoulos, S., Mayer, C E., Rudolf, F., and Stelling, J (2014) Accurate cell segmentation in microscopy images using membrane patterns Bioinformatics 30.18, 2644–2651 [7] Edmund Optics (2018) Fluorophores and Optical Filters for Fluorescence Microscopy, Inc., 101 East Gloucester Pike, Barrington, NJ 08007-1380 USA [8] Bradbury, S and Evennett, P., (1996), Fluorescence microscopy, Contrast Techniques in Light Microscopy, BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, United Kingdom [9] Un article de Wikipédia l'encyclopédie libre (14 May 2018), Microscopie fluorescence [10] Michael Ormerod, David Novo, (2018), A Basic Introduction to Fluorescence & Fluorochromes, denovosoftware, Chapter 3, Flow Cytometry [11] J A Hartigan and M A Wong (1979), A K-means clustering algorithm Applied Statistics, 28:100–108, [12] Joe Chalfoun, Michael Majurski, Adele Peskin, Catherine Breen, Peter Bajcsy and Mary Brady (Jun 2015), Empirical Gradient Threshold Technique for Automated Segmentation across Image Modalities and Cell Lines Journal of Microscopy [13]Nameirakpam Dhanachandra, Khumanthem Manglem and Yambem Jina Chanu (2015), Image Segmentation using K-means Clustering Algorithm and Subtractive Clustering Algorithm, Eleventh International Multi-Conference on Information Processing 68 [14] Gurbinder Kaur, Balwinder Singh (Jun-Jul 2011) Intensity based image segmentation using wavelet analysis and clustering techniques Comp Engg Department, Punjabi University, Yadwindra, College of Engineering Patiala, Punjab, 147001, India ISSN : 0976-5166 Vol No [15] Wesley Nunes Gonỗalves, Odemir Martinez Bruno (2014), Automatic System for Counting Cells with Elliptical Shape Instituto de Fısica de Sao Carlos Universidade de Sao Paulo [16] P S Karvelis and D I Fotiadis (2008), “A region based decorrelation stretching method: Application to multispectral chromosome image classification” In Image Processing, 2008 ICIP 2008 15th IEEE International Conference on, pp 1456 – 1459, oct [17] Michael Adrian Jendrusch, (21 August 2017), Machine Learning and Image Processing Algorithms for Real-Time Cell Classification, Heidelberg University [18] Tiago Ferreira • Wayne Rasband (October, 2012) ImageJ User Guide, IJ 1.46r Webographie {1} Chapitre : Le fonctionnement cellulaire et son contrôle ; https://svt07.wordpress.com/chapitre-3-le-fonctionnement-cellulaire-et-son-controle/ {2} Amaury, Le cycle itératif; technique.com/2009/02/06/le-cycle-iteratif 2008 http://www.geek-directeur- {3} Market leading inverted microscope capable of taking on the most advanced bioscience imaging protocols https://www.nikoninstruments.com/en_DE/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-TiE {4} l’institution d’accueil www.knoplab.de/about-us/ {5} UGA-42-Firefly - Point Scanning Device http://www.rapp-opto.com/UGA42_Firefly.html {6} Le microscope en fluorescence https://www.futurasciences.com/sante/definitions/medecine-microscope-fluorescence-7775/ {7} Comparison with other microscopy software https://micromanager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software {8} Gaussian Blur http://imgsimon.blogspot.com/2016/07/scilab-gaussian-blur.html ... BASÉ SUR LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE À HAUT DÉBIT PHÁT TRIỂN THUẬT TOÁN CHO PHÂN LẬP TẾ BÀO DỰA TRÊN KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG THÔNG LƯỢNG CAO Spécialité : Systèmes Intelligents et Multimédia... vision dépendamment de l’objectif de la caméra Donc visualiser une plaque de 96 puits revient position la camera dans environ 2500 champs de vision différents ceux qui peuvent prendre des heures,... les champs de vision l’intérieur du puits Noter que la caméra du microscope ne peut en aucun cas visualiser un puits en entier, vu que le puits peut contenir plus de 24 champs de vision dépendamment