Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn nacl

Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn Nacl Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn Nacl Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn Nacl Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn Nacl Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn Nacl

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN MẠNH QUỲNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ SẸO CHỊU MẶN (NaCl) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Đặc tính sinh thái 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.1.5 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.2 MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN 1.2.1 Các kiểu đất mặn 1.2.2 Tác hại mặn 1.2.3 Các phản ứng thích nghi thực vật môi trường mặn 1.3 MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VÀ CHỌN DỊNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY IN VITRO 12 1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG 13 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .17 2.1 Nguyên liệu .17 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 17 2.1.2 Hóa chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp phân tích hoá sinh 18 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Phương pháp phân tích sinh lí 21 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử .23 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 24 2.2.5 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu .24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Đặc điểm nơng học dịng lúa chọn lọc hệ R2, R3 có nguồn gốc từ mơ sẹo qua xử lí chịu mặn .25 3.1.1.Đặc điểm nơng học dịng lúa chọn lọc hệ R2 25 3.1.2.Đặc điểm nông học dòng chọn lọc hệ R3 .29 3.1.3 Nhận xét số đặc điểm nơng học dịng chọn lọc 31 3.2 Phân tích hóa sinh dịng chọn lọc 31 3.2.1 Đánh giá khả chịu mặn giai đoạn hạt nảy mầm .32 3.2.1.1 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hàm lượng đường khử giai đoạn hạt nảy mầm 32 3.2.1.2 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 35 3.2.1.3 Mối tương quan hoạt độ  - amylase hàm lượng đường khử 37 3.2.1.4 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm 38 3.2.1.5 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 40 3.2.1.6 Tương quan hoạt độ protease hàm lượng protein tan 42 3.2.1.7 Nhận xét khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm 43 3.3 Đánh giá khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn mạ 43 3.3.1 Đánh giá khả chịu hạn thông qua xác định hàm lượng proline .43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2 Đánh giá khả chịu mặn dòng chọn lọc qua gây hạn nhân tạo xử lí NaCl 0,1M 46 3.3.3 Xác định số chịu mặn tương đối mức độ mạ .47 3.3.4 Nhận xét khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn mạ .48 3.4 Đánh giá thay đổi ADN hệ gen số dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn .49 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 49 3.4.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD 51 3.4.2.1 Số phân đoạn ADN xuất đa hình phân đoạn ADN nhân 51 3.4.2.2 Sự khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử 59 3.4.3 Nhận xét thay đổi ADN hệ gen dòng lúa chọn lọc giống gốc 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Hạt dòng chọn lọc hệ R1 giống gốc 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng lúa chọn lọc hệ R2 27 Bảng 3.2 Đặc điểm nơng học dịng chọn lọc từ giống CR203 30 Bảng 3.3 Hàm lượng protein, đường khử hạt dòng chọn lọc giống gốc 32 Bảng 3.4 Hàm lượng đường khử dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm xử lí dùng dịch NaCl 0,1M 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 35 Bảng 3.6 Tương quan hoạt độ  - amylase hàm lượng đường khử giai đoạn hạt nảy mầm 37 Bảng 3.7 Hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm dòng chọn lọc xử lí NaCl 0,1M 38 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 41 Bảng 3.9 Tương quan hoạt độ protease hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm 43 Bảng 3.10 Hàm lượng proline dòng lúa chọn lọc xử lí NaCl 0,1M giai đoạn mạ 44 Bảng 3.11 Một số tiêu chịu ảnh hưởng mặn giai đoạn mạ 46 Bảng 3.12 Chỉ số chịu mặn tương đối dòng chọn lọc giai đoạn mạ 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.13 Độ tinh hàm lượng ADN dòng lúa chọn lọc 50 Bảng 3.14 Tổng số phân đoạn ADN nhân từ hệ gen dòng lúa chọn lọc phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 51 Bảng 3.15 Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên 52 Bảng 3.16 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18 Hình 3.1 Hàm lượng đường khử dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm xử lí dùng dịch NaCl 0,1M 34 Hình 3.2 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 36 Hình 3.3 Hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm dòng chọn lọc xử lí NaCl 0,1M 39 Hình 3.4 Ảnh hưởng NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 42 Hình 3.5 Hàm lượng proline dịng lúa chọn lọc xử lí NaCl 0,1M giai đoạn mạ 45 Hình 3.6 Khả chịu mặn dịng lúa chọn lọc 48 Hình 3.7 Kết điện di ADN tổng số tách từ dịng lúa chọn lọc 50 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M1 53 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 54 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M3 54 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 55 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M6 55 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 56 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 57 Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 57 Hình 3.16 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M11 58 Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 58 Hình 18 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dòng chọn lọc giống gốc 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo nguồn lương thực chủ yếu nửa dân số giới Ở Việt Nam, lúa nông nghiệp có vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Theo số liệu thống kê năm 2008, nước ta có 7,4 triệu đất trồng lúa, sản lượng thóc đạt 38,6 triệu tấn, bình qn suất đạt 6,2- 6,3 tấn/ha Việt Nam hai nước xuất gạo hàng đầu giới [50] Cây lúa (Oryza sativa L.) loại trồng mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh [9] Nhiều yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên trình sinh trưởng phát triển lúa nhiệt độ cực đoan, ánh sáng bất lợi, lượng mưa không phù hợp [7], [8] Đối với lúa nước, vùng ven biển nguyên nhân quan trọng làm giảm suất mặn Đứng trước diễn biến ngày nghiêm trọng biến đổi khí hậu, Việt Nam số nước chịu ảnh hưởng nước biển dâng, đặc biệt vùng đồng sông Hồng đồng sông Cửu Long Theo đánh giá ngân hàng giới, nước biển dâng 1m, Việt Nam có 10% dân số chịu ảnh hưởng trực tiếp làm tổn thất khoảng 10% GDP [16] Theo “Nghiên cứu điển hình phục vụ báo cáo phát triển người 2007-2008” UNDP, đồng sơng Cửu Long có 1,77 triệu đất nhiễm mặn (chiếm 45% diện tích) Một số địa phương khác Nam Định Thanh Hoá diện tích nhiễm mặn 7600 [16] Lúa nước loại chịu mặn [3] Vì vậy, nghiên cứu khả chịu mặn tăng cường khả chịu NaCl giống lúa nhằm nâng cao ổn định sản lượng lúa điều kiện nhiễm mặn địi hỏi thực tiễn sản suất nơng nghiệp Trong năm gần đây, công nghệ sinh học phát triển đóng góp nhiều ứng dụng quan trọng công tác chọn tạo giống Bằng kỹ thuật chọn dịng biến dị soma kỹ thuật gen tạo trồng có khả chống chịu cao [13] Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật mở Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hướng công tác cải tạo giống trồng góp phần làm phong phú thêm nguồn vật liệu khởi đầu công tác chọn giống [1], [12], [14], [15], [17] Từ nguồn nguyên liệu thực vật tạo nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô đến tạo thành dịng, giống địi hỏi trải qua q trình đánh giá, thử nghiệm đồng ruộng phòng thí nghiệm qua nhiều hệ Xuất phát từ sở trên, lựa chọn đề tài: “Đánh giá số dịng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl)” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn dòng lúa ưu việt đặc điểm nông học, chất lượng hạt khả chịu mặn - Xác định sai khác hệ gen dòng lúa chịu mặn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích đặc điểm nơng học dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu mặn (NaCl) hệ R2, R3 3.2 Đánh giá chất lượng hạt thơng qua phân tích số tiêu hoá sinh: protein, đường tan 3.3 Đánh giá khả chịu mặn (NaCl) số dòng chọn lọc hệ R3 - Đánh giá giai đoạn hạt nảy mầm thông qua xác định ảnh hưởng NaCl đến hàm lượng đường tan, hoạt độ  - amylase, hàm lượng protein tan hoạt độ protease - Đánh giá nhanh khả chịu mặn (NaCl) giống nghiên cứu giai đoạn mạ ba phương pháp gây mặn nhân tạo Xác định hàm lượng proline sau xử lý mặn mạ ba dung dịch NaCl 3.4 Xác định sai khác ADN genome số dòng lúa chịu mặn kỹ thuật RAPD Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa Cây lúa (Oryza Sativa L.) trồng có từ lâu đời, phân bố từ 30 vĩ Bắc đến 400 vĩ Nam gắn liền với lịch sử phát triển loài người Tổ tiên loài lúa lúa dại Oryza Fatua, Oryza Zaoffcinacis, Oryza Minuta [8] Khoảng năm 2800 – 2700 TCN, Trung Quốc có nghề trồng lúa [8] Vavilov (1926) cho nguồn gốc lúa trồng Ấn Độ [6] Nhiều tài liệu cho rằng, nguồn gốc lúa trồng miền nam Việt Nam Campuchia [7], [8] Có giả thuyết lại cho rằng, tổ tiên chi lúa Oryza loại hoang dại siêu lục địa Gondwana cách 130 triệu năm phát tán khắp châu lục qúa trình trơi dạt lục địa Khi phát có nhiều lồi lúa dại thuộc nhóm Euoryza châu Phi, Chang (1976) cho nguồn gốc loài lúa trồng châu Phi Sampath Rao (1951) cho nôi nghề trồng lúa chân dãy Himalaya đổ xuống vùng đồng Bengale Assam, Thái Lan vùng có nhiều loại lúa hoang dại giống lúa trồng phong phú [8] Tuy chưa thống có nhiều tài liệu , di tích khảo cổ học chứng minh nguồn gốc lúa ở vùng đầm lầy Đơng Nam Á , thuộc nhiều quốc gia khác từ vùng nhiệt đới nóng ẩm lúa lan rộng khắp nơi [7], [8], [9] Theo hệ thống phân loại học thực vật, lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp mầm (Mono Cotyledones), hoà thảo (Graminales), họ hoà thảo (Graminae), chi lúa (Oryza) loài Oryza Sativa [8] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mồi M4: Phân tích kết điện di sản phẩm RAPD cho thấy, mồi M4 cho tổng số phân đoạn ADN 26 Trong khoảng kích thước từ 0,2 kb – 0,7 kb có phân đoạn ADN, có phân đoạn ADN cho tính đa hình chiếm tỉ lệ 50% Phân đoạn đa hình xuất vị trí 0,22 kb dịng R3.CR8, 0,28 kb dòng R3.CR3 0,41 kb dòng R3.CR8 Mồi M4 với mồi M3, M10, M11 có tỉ lệ phân đoạn đa hình cao (chiếm 50%) M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 Mồi M6: Kết điện di cho thấy, tính đa hình thể rõ ràng mẫu lúa nghiên cứu Trong khoảng kích thước 0,35kb – 1,0kb có băng vạch ADN xuất tương ứng với 26 phân đoạn ADN mẫu lúa nghiên cứu Có phân đoạn ADN cho tính đa hình chiếm tỉ lệ 33,33% tổng số phân đoạn Tại kích thước 0,4kb dịng R3.CR14, khơng thấy xuất dịng khác Ở kích thước 0,62kb thấy xuất băng vạch ADN đặc trưng giống gốc CR203, dòng tạo không thấy xuất phân đoạn ADN vị trí M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Mồi M7: Kết thể ảnh điện di cho thấy tổng số phân đoạn ADN xuất mồi M7 nhiều (35 phân đoạn) Số phân đoạn ADN mẫu dao động từ – phân đoạn, số phân đoạn ADN nhiều dịng R3.CR1(8 phân đoạn), dịng R3.CR14 (4 phân đoạn ADN) Có phân đoạn đa hình xuất dịng R3.CR1 vị trí 0,3kb 1,0kb Ở dòng R3.CR8 xuất băng vạch đặc trưng vị trí 1,1kb, dịng khác khơng thấy có phân đoạn ADN M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 10,0kb 6,0kb 3,0kb 1,0kb 0, 5kb 0,25kb Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 Mồi M8: Kết phân tích sản phẩm RAPD cho thấy, có 22 phân đoạn ADN xuất nằm khoảng 0,32 – 0,7kb Số phân đoạn xuất mẫu nghiên cứu dao động từ – phân đoạn, dịng R3.CR15 cho số phân đoạn nhiều (5 phân đoạn), giống gốc CR203 với dòng R3.CR1, R3.CR3 cho số phân đoạn (3 phân đoạn) Có phân đoạn ADN cho tính đa hình, vị trí 0,4 kb dịng R3.CR8 vị trí 0,48 kb dịng R3.CR15, chiếm tỉ lệ 40% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 Mồi M10: Hình ảnh điện di thể rõ đa hình phân đoạn ADN mẫu nghiên cứu Trong khoảng kích thước từ 0,19kb – 0,8kb có phân đoạn ADN nhân bản, có băng cho tính đa hình chiếm tỉ lệ 50% Cụ thể, vị trí 0,19 kb 0,81 kb dòng R3.CR1 xuất băng ADN đặc trưng, khác biệt hồn tồn so với dịng cịn lại Dịng chọn lọc R3.CR15 xuất phân đoạn ADN kích thước 0,38 kb mà dòng giống lại khơng có Ở vị trí 0,3kb, 0,5kb, 0,7kb tất mẫu nghiên cứu xuất phân đoạn ADN M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 Mồi M11: Số phân đoạn ADN mẫu lúa nghiên cứu dao động khoảng từ – phân đoạn, mẫu ADN từ giống gốc CR203 cho nhiều phân đoạn phân đoạn Dòng R3.CR14 cho phân đoạn với phân đoạn ADN Trong phân đoạn ADN xuất có phân đoạn cho tính Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn đa hình chiếm 50% Giống gốc CR203 cho phân đoạn đa hình vị trí 0,10kb 0,15kb, phân đoạn đa hình cịn lại xuất dịng R3.CR1 vị trí 0,28kb dịng R3.CR15 vị trí 0,32kb M CR203 R3.CR3 R3.CR1 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M11 Mồi M14: Trong khoảng phân tích từ 0,3kb – 0,7kb thấy xuất 21 băng vạch ADN (số phân đoạn mồi nghiên cứu) Trong có xuất băng khác mẫu Cụ thể, vị trí 0,5 0,7kb tất dịng chọn lọc xuất phân đoạn ADN, vị trí 0,55 kb có giống gốc CR203 khơng xuất băng ADN, mẫu cịn lại có phân đoạn ADN Có phân đoạn ADN đa hình xuất dịng R3.CR1 (vị trí 0,3kb) chiếm tỉ lệ 25% so với tổng số phân đoạn ADN xuất M CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 1,0 kb 0,5 kb 0,1 kb Hình 3.17 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.2.2 Sự khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê băng điện di (xuất = 1, không xuất = 0) xử lý số liệu phân tích RAPD phần mềm NTSYSpc version 2.01 nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu lúa nghiên cứu thông qua hệ số sai khác di truyền biểu đồ hình Kết xác định hệ số sai khác di truyền thể bảng 3.16 Bảng 3.16 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc Giống CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 CR203 0,0000 0,2912 0,2785 0,3038 0,3112 0,3165 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 0,0000 0,3365 0,2912 0,3925 0,3038 0,0000 0,3798 0,4051 0,3925 0,0000 0,3292 0,2406 R3.CR14 R3.CR15 0,0000 0,2406 0,0000 Hình 18 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dòng chọn lọc giống gốc Kết phân tích cho thấy có sai khác di truyền dòng lúa chọn lọc so với gống gốc dao dộng từ 0,2406 – 0,4051 Dịng R3.CR1 có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn sai khác thấp so với giống gốc 0,2912, dịng R3.CR15 có sai khác lớn so với giống gốc 0,3165 Như dòng tạo thể mức độ sai khác so với giống gốc So sánh hệ số sai khác di truyền dịng cho thấy, khác biệt tìm thấy dịng R3.CR15 R3.CR8, hai dịng có sai khác di truyền 0,2406 Sự sai khác di truyền lớn dòng R3.CR3 với dòng R3.CR14, có sai khác 0,4051 Như vậy, mẫu lúa chọn lọc nghiên cứu có phân tách dòng tạo từ giống gốc, đồng thời dịng có sai khác định Hình 3.18 cho thấy mức độ sai khác dòng chọn lọc giống gốc Các dịng có hệ số di truyền gần xếp vào nhóm, liên hệ nhóm thể sơ đồ Sơ đồ hình cho thấy dòng chọn lọc giống gốc chia thành nhóm - Nhóm thứ gồm giống gốc CR203 dòng R3.CR1, R3.CR3 - Nhóm thứ hai bao gồm dịng cịn lại R3.CR8, R3.CR14, R3.CR15, với khoảng cách di truyền so với nhóm thứ 34% Nhóm thứ chia thành hai nhóm phụ Nhóm phụ I có dịng R3.CR1, nhóm phụ II gồm giống gốc CR203 với dịng R3.CR3, có khoảng cách di truyền so với nhóm phụ I 0,295 (29,5%) Giống gốc với dịng R3.CR3 có hệ số giống lớn 72,15% Nhóm thứ hai chia thành hai nhóm phụ Nhóm phụ III gồm dịng R3.CR8 R3.CR15 có hệ số giống lớn đạt 75,94% sai khác với dịng R3.CR14 (nhóm phụ IV) 32,92% Những phân tích cho thấy dịng lúa chọn lọc thể đa dạng di truyền rõ rệt so với giống gốc CR203 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.3 Nhận xét thay đổi ADN hệ gen dòng lúa chọn lọc giống gốc - Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu lúa thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy 10 mồi cho đa hình phân đoạn ADN nhân - Trong phạm vi vùng phân tích (0,1 – 2,5kb) có 61 phân đoạn ADN nhân bản, có 26 phân đoạn cho tính đa hình (42,62%) Tổng số phân đoạn ADN thu cảu mẫu lúa phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 280 Số lượng phân đoạn ADN nhân với mồi dao động từ 21 – 35, cao mồi M1, M7 (35 phân đoạn), thấp mồi M14 với 21 phân đoạn ADN - Hệ số sai khác di truyền dịng lúa chọn lọc phát sinh từ mơ sẹo qua xử lí mặn giống CR203 hệ R3 so với giống gốc từ 0,2406 – 0,4051 So sánh hệ số sai khác di truyền dòng cho thấy, khác biệt lớn dòng R3.CR3 với dòng R3.CR14 đạt 40,51 % - Các dòng lúa chọn lọc có thay đổi mức độ phân tử gen so với giống gốc CR203 Khoảng cách di truyền dòng chọn lọc với giống gốc 27,85% – 31,65% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đánh giá đặc điểm nơng học dịng chọn lọc giống gốc hệ R2 R3 cho thấy dịng chọn lọc có nhiều đặc điểm bật so với giống gốc (chiều cao cây, chiều dài bơng, kích thước hạt, số hạt chắc/bơng, số dảnh/khóm, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng ), đặc biệt trội dịng có nguồn gốc từ giống CR203 Các dòng chọn lọc ổn định nhanh chóng thích nghi với điều kiện canh tác qua hệ R2, R3 Hàm lượng đường khử, protein tan dịng chọn lọc từ giống CR203 có xu hướng tăng cao so với giống gốc, cụ thể hàm lượng protein tăng 0,97% – 11,19%, hàm lượng đường khử tăng từ 5,49% – 17,67% so với đối chứng Ở giai đoạn hạt nảy mầm, hoạt độ α – amylase, hoạt độ protease, hàm lượng đường tan hàm lượng protein tan có xu hướng tăng từ đến ngày tuổi, bắt đầu giảm ngày tuổi Sự biến động hoạt độ α -amylase, hoạt độ protease, hàm lượng đường tan hàm lượng protein tan biểu khác giống Ở giai đoạn non lá, dòng lúa chọn lọc phản ứng khác mặn Khả chịu mặn đối tượng nghiên cứu giai đoạn mạ xếp theo thứ tự sau: R3.CR1 > R3.CR3 > R3.CR15 > R3.CR8 > R3.CR14 > CR203 Khi tiến hành gây mặn nhân tạo giai đoạn non lá, lúa tăng tổng hợp axit amin proline Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu lúa thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy 10 mồi cho đa hình phân đoạn ADN nhân Hệ số sai khác di truyền dòng lúa chọn lọc phát sinh từ mơ sẹo qua xử lí mặn giống CR203 hệ R3 so với giống gốc từ 0,2406 – 0,4051 So sánh hệ số sai khác di truyền dòng cho thấy, khác biệt lớn dòng R3.CR3 với dòng R3.CR14 đạt 40,51 % Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đề nghị Tiếp tục phân tích, theo dõi dịng chọn lọc hệ sau qui mô lớn để đưa vào khảo nghiệm, bồi dưỡng thành giống lúa chịu mặn Tiếp tục nghiên cứu, phân lập gen liên quan tới khả chịu mặn lúa tăng cường khả chịu mặn lúa kĩ thuật chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Điệp, Lê Thị Muội (1995), Nghiên cứu khả chịu lạnh chịu khô mô sẹo lúa giống có nguồn gốc sinh thái khác nhau” Tạp chí Sinh học, 17 (1), 25 – 29 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2009), Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại môi trường lúa, NXB Nông nghiệp Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, 54 – 55 Nguyễn Việt Cường, Phạm Đức Tuấn (2007), Ứng dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền xây dựng vườn giống Cóc Hành Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, số 19/2007, 69 – 75 Trần Duy Dương, Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Hoàng Tuyết Minh (1999), Sử dụng phương pháp RAPD nghiên cứu đa hình số dịng lúa phục vụ cho cơng tác chọn giống”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc, Hà Nội, 1452-1457 Bùi Huy Đáp (1989), Cây lúa Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình lúa NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Trương Đích (2000), Kỹ thuật trồng giống lúa nước, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Sư phạm Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 86-127 12 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học ,Hà Nội 13 Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1996), Xác định nhanh khả chịu hạn lúa giai đoạn mạ phương pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, 3, – 14 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 15 Nguyễn Thanh Tường, Nguyễn Bảo Vệ, Võ Công Thành (2005), Khả chịu mặn đa dạng di truyền protein dự trữ số giống lúa trồng ven biển đồng sơng Cửu Long, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 3, 49 – 57 16 UNDP ,“Nghiên cứu điển hình phục vụ báo cáo phát triển người 2007-2008”, Hà Nội 17 Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dịng chịu muối lúa cơng nghệ nuôi cấy tế bào thực vật”, Kỷ yếu Viện CNSH, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 19 – 27 Tài liệu tiếng Anh 18 Abe T, Futsuhara Y (1986), Efcient plant regeneration by somatic embryogenesis from roots callus tissue of rice” ( Oryza satival L.), J Plant physiol, 121, 111- 118 19 Akins S W., Kunanu Vatchaidach R., Godwin I D (1995) „‟Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters‟‟, Aust J Bot 4, 201 – 209 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn 20 Bates L.S (1973), Rapid determination of free protein for water-stress studies”, Plant and Soil, 39, 205 – 207 21 Chandler S F., Vasil I.K (1984), “Selection and characterrization of NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum”, Plant Sci Lett, 37, 157 – 164 22 Chen JZ, Ye JY, Zhang HY, Jiang XJ, Zhang YX, Liu ZL, Freshwater toxic cyanobacteria induced DNA damage in apple (Malus pumila), rape (Brassica napus) and rice (Oryza sativa) J Hazard Mater 2011 Jun 15;190(1-3):240-4 Epub 2011 Mar 17 23 Chuboon S, Wongsawad C (2009), Molecular identification of larval trematode in intermediate hosts from Chiang Mai, Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health 40(6):1216 – 1220 24 Dang Minh Tam, Nguyen Thi Lang (2003), “In vitro selecsion for salt tolerance in rice”, Omorice, 68 – 73 25 Do Quang Binh, Laszlo E Heszky, Ibolya Simo – Kiss, “In vitro studies on salt tolerance in rice”, Cahiers Option M éditerranéennes, Vol 26 Foolad M R., Siva A., and Rodrigues L R.(1995), Application of polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis In: Tissue and organ cuture, Fundamental mothod, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 281 – 298 27 Greenway H (1995), Differential solute regulation in leaf blades of vatiuos ages in salt sensitive wheat and a salt tolerance lopopyrun elongatum (Host) a love amphip loid, Plant Physioll, 108, 1715 – 1724 28 Hu J, Zhang Y, Qian W, He C (2007) Avirulence gene and insertion element-based RFLP as well as RAPD markers reveal high levels of genomic polymorphism in the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv oryzae Syst Appl Microbiol 30(8):587 – 600 Epub 2007 Oct 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn 29 Ingram K I, Bueno F D, Namuco O S, Yambao E B, Beyrouty C A (1994), Rice root straists for drought resistance and their genetic variation, in: rice roots: nutrient and water use, kirt g.j.d (eds), IRRI, Philippines, 67 – 77 30 Kucherenko L A (1984), Conditions for plant regeration in tissue culture”, Agri biol (USSR), 4, 70 – 72 31 M Chen, Q-J Chen, X-G Niu, H-Q Lin, C-.Xu, X-C Wang, G-Y Wang, J.Chen (2007), “Expreeion of OsNHX1 gene in maize confers salt tolerace and promotes plant growth in the field”, Plant soil environ, 53, China, 490 – 498 32 M Y Salem, Z Mukhtar, A.A Cheema and B M Atta (2005), “Induced mutation and in vitro techniques as a method to induce salt tolerance in basmati rice”, Int J Environ Sci Tech, Vol 2, No 2, 141 – 145 33 Miguke Kaneko, Hironosi Itoh, Miyako Ueguchi – Janaka, Motoyuki Ashikasi and Makoto Masuoka (2002), “The α – amylase induction in endosperm during rice seed germination is caused by gibberellin synthesized in epithelium‟, Plant Physiology, Vol 128, 1264 – 1270 34 Monna L., Miyao A., takakazu L., Fukuora S (1994), Detremination of APD maker in rice and their conversion into sequence tagged sites (STSs and STS - Specific primer”, Research 1, 139 – 148 35 Mundy J., Chua H N (1998), “Abcisis acid and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, 2279 – 2286 36 Ngezahayo F, Dong Y, Liu B Somaclonal variation at the nucleotide sequence level in rice (Oryza sativa L.) as revealed by RAPD and ISSR markers, and by pairwise sequence analysis.J Appl Genet 2007;48(4):329336 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 http://www.lrc-tnu.edu.vn 37 Robert W H (1991), Research priorities for Rice Biotechnology”, Rice Biotechnology, Khush G S., Toenniesen G.H.(eds), Bio Agr IRRI, 6, 1938 38 Rs Dubey and M Rani (1990), „Influence of NaCl salinity on the behaviour of protease, aminopeptidase and carboxypeptidase in rice seeding in relation Saa tolerance”, Australian Journal of plant physiology 39 Sandhu SS, Bastos CR, Azini LE, Tulmann Neto A, Colombo C (2002) RAPD analysis of herbicide-resistant Brasilian rice lines produced via mutagenesis Genet Mol Res 1(4):359-370 40 Skirvin S M., Norton M (1994), “ Sources and frequency of somaclonal variation”, Host Sci, 29, 1232 – 1237 41 Tran Ngoc Thach, R C Plant (1999), “In vitro study on salt tolerance in rice”, Omorice 42 William J G K., Kubelik A E., Levark K J., Rafalski J A., Tingey S V (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitray primer are useful as gennetic markers”, Nucleic Acids Res, 18, 6531 – 6525 43 Wong C, Ko S, Woo S (1983), Regeneration of rice plantlets on NaCl stress medium by anther culture”, Bot Bull Acad Sin, 24, 59 – 64 44 Wu YJ, Chen Y, Wang J, Zhu CX, Xu BL (2006) RAPD analysis of jasmine rice-specific genomic structure Genome 49(6):716-719 45 Wyn Jones R G, Storey R (1978), Salt stress and comparative physiology in the Gramineae, Aust J Plant Physiol, 5, 817 – 829 46 Xiong Lizhong, Honghong Hu, (2004), “Transcription factor gene OsNACx from rice and use thereof for improving plant tolerance to drought and salt”, Patent Application Publication Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Zhao, X (2009), “Effect of salt stress on grown and osmotic regulation in Thellungiella and Arabidopsis caluss”, Plant cell tissue and organ culture, 98 Tài liệu mạng internet 48 http://www.vaas.org.vn/Images/caylua/01/02_giatridinhduong.htm 49 http://vi.wikipedia.org/wiki/L%C3%BAa 50 http://vukehoach.mard.gov.vn/chienluoc.aspx?id=37 51 http://www.vaas.org.vn/Images/caylua/08/15_giongcr203.htm 52.http://www.agroviet.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=12421&Pag e=1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... phát từ sở trên, lựa chọn đề tài: ? ?Đánh giá số dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu mặn (NaCl) ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn dòng lúa ưu việt đặc điểm nông học, chất lượng hạt khả chịu mặn. .. hệ gen dòng lúa chịu mặn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích đặc điểm nơng học dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu mặn (NaCl) hệ R2, R3 3.2 Đánh giá chất lượng hạt thơng qua phân tích số tiêu... cứu hạt dòng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ mơ sẹo qua xử lí chịu mặn giống lúa CR203, IR64, OM 4498, VND 95-20 (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Hạt dòng chọn lọc hệ R1 giống gốc STT Dòng chọn lọc Nguồn gốc R1.CR1,