Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nested rt pcr trong chẩn đoán nhiễm rubella trước sinh

TÀ I L IỆ U TH A M K H Ả O ỉ Hoàng văn Ngọc Nghiên cứa thực trạng bệnh thalassemia số yếu tố liên quan trẻ em dân tộc Tày Dao huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Y học 2007 Nguyễn Công Khanh Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh p Thalassemia người Việt Nam Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Đại học Y Hà Nội 1985 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phư ng Mai, Nguyễn Tân Sinh, Dư ng Bá Trực, Bùi Văn Viện, Nguyễn Thanh Liêm, ứn g dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán trước sau sinh bệnh alpha Thalassemia Bệnh viên Nhi TW.Tạp chí Nhi khoa, tập 3, số 3,4 tháng 10/2010, tr.337­342 Chui DH, Way JS Hydrops fetal is caused by aỉpha­thalassemia: an emerging health care problem Blood.1998, 91, pp.2213­2222 Di ss roth A t al Hemoglobin synthesis in somatic cell hybrid: independent segregation of the human alpha and beta globin gene Science 191,1976, p.1262 Potrakul s t al Incidence of a Thalassemia in Bangkok J.Med Assoc, Thailan 1970,53, pp.250 Told D.Lai MCS, Braga C.A, ISoo N.H Alpha thalassemia in Chinese cord blood studies Br J.Haematoi 1969, 16, pp.551­556 Embury S.H t a t Organization o f the a globin gen in the chines a thalassemia syndromes J.Clin.Inv sX 1979,63 NGHIÊN c ứ u ỨNG D NG KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG CHÂN ĐOÁN NHIỄM RUBELLA TRƯỚC SINH BS Đặng Tiến Trường*; s v Lê H òa Yên* s v N guyễn V ìấ H iếu* B S Nguyễn Thị Hà* Ht âng dẫn; PGS TS Nguyễn D uy Bắc* TÓM TẲT Sốt phátban Rubella đo virut Rubella gây nên, bệnh thường nhẹ, biến chứng Tại Việt Nam, chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phịng nhiễm Rubella; nhiều thai phụ nhiễm Rubella phài đ nh thai nghén mà khơng rõ thai nhi có nhiễm Rubella khơng? Việt Nam chưa có phương pháp chẩn đốn trước sinh CRĨ đạt tiêu chí xác, sớm, rè, đòi hỏi phương tiện đơn giản V vậy, tiến hành đề tài với mục tiêu: ­ Hồn thiện quy trìnhphát nhiễm virut Rub lla kỹ thuật nestedRT-PCR - Áp dạng kỹ thuật n st d RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rub lla trước sình nh m đối tượng cổ nguy c cao Đổi tượng phương pháp nghiên cún: 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella 60 mẫu tác nhân khác gây triệu chứng phát ban 41 thai phụ chẩn đoán nhiễm virut Rubella kỹ thuật huyết học Phương pháp nghiên cứu: ­ Tách chiết ARN ADN ­ Tối ưu hóa phản ứng Nested RT­PCR: tối ưu hóa thành phần chu tr nh nhiệt phản ứng Sau nhân ADN đích, điện sản phầm ADN agarose gel 2% phân tích kểt ­ Đánh giá độ xác kỹ thuật: xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật, chẩn đoán 60 mẫu ARN virut Rubella 60 mẫu khơng nhiễm phải virut Rubella, tính độ nhạy độ đặc hiệu + Xác định ngưỡng phát kỹ thuật: tiến hành chẩn đoán ưên mẫu ARN pha loăng + Giải tr nh tự sản phẩn phản ứng nested RT­PCR để xác định sản phẩm gen virut Rubella ­ Áp dụng kỹ thuật nested RT­PCR chẩn đoán trước sinh * Học viện Quân y 560 Kết nghiên cứu: ­ Tối ưu hóa phản ứng nested RT­PCR: tơi ưu hóa thành phần chu tr nh nhiệt cùa phản ứng nested RT­PCR ­ Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật: kỹ thuật xác định đương tính vói 60 mẫu virut Rubella âm tính vói 60 mẫu khác Độ nhạy kỹ thuật 100%; độ đặc hiệu kỹ thuật 100%, khơng có phản ứng chéo với loại virat khác gây ưiệu chứng phát ban Rubella ­ Xác định ngưỡng phát kỹ thuật nested RT­PCR 10*6ng/fjl ­ Kểt quà giải tr nh tự, Blast ngân hàng gen cho thấy, tr nh tự gen virut Rubella Trong 41 mẫu dịch ổi tiến hành xé£ nghiệm, 15/41 mẫu cho kết đương tính, 26/41 mẫu âm tính Kết tương đồng với kết quà real time­PCR phù hợp vói kết xét nghiệm IgM máu cuống rốn thai nhi đ nh thai nghén Kết luận kiến nghị: ­ Đã tối ưu hóa quy tr nh kỹ thuật nested RT­PCR chẩn đoán nhiễm virat Rubella trước sinh với độ xác cao Kết q chẩn đốn trước sinh tương đồng với kết real time PCR xét nghiệm IgM máu cuống rốn đ nh chỉ thai nghén ­ Kỹ thuật nested RT­PCR đơn giàn, giá thành thấp, xác, nên triển khai áp dụng rộng rãi bệnh viện sở xét nghiệm, giúp giảm số trẻ mác CRS, giảm gánh nặng cho gia đ nh xã hội *Từ khóa: Virut Rubella; Nested RT­PCR Application o f n st d R T-PC R t chniqu m diagnosis o f pr natal rub lla vừĩis Summ ary Rubella typhus caused by Rubella virus, the disease is usually mild, less complications However, pregnant women infected with Rubella in the first trimester, 80 ­ 100 of fectus infected congenital Rubella infection ­ CRI and over 65% of cases of congenital rubella syndrome ­ CRS CRS has the following expression: mental retardation, congenita deafness, cataracts, cardiovascular system defects In Vietnam, there is not a national immunization program of Rubella prevention Now, there is no method for prenatal diagnosis of CRI with precise, early, cheap and simple So, we conducted subject to the following objectives: establish of nested RT­PCR techniques for detection of rubella virus; application of nested RT­PCR technique in the diagnosis of prenatal rubella virus infection in high­risk subjects Materials and method: ­ 60 samples infected with Rubella virus, technical diagnosed fay real time PCR and vims isolation 60 samples contaminated with bacteria and other viruses cause symptoms such as Rubella rash ­ 41 women infected with rubella virus by serological techniques Method: Extraction of RNA and DNA ­ Optimization of nested RT­PCR reactions ­ DNA products was electrophoresis on agarose gel 2% and analyze the results DNA products of the reaction of the nested RT­PCR is theoretically 143 bp ­ Evaluation of accuracy: using nested RT­PCR technique in the diagnosis of 60 RNA Rubella samples and 60 samples contain other virus, x tabulation to calculate sensitivity and specificity of technique; dilution series of RNA Rubella virus from 100 ng/ịil to 10­8ng/jxl, for determine the detection threshold DNA product was sequenced to comfum isolation from rubella virus ­ Application of nested RT­PCR technique in the diagnosis of prenatal rubella virus: diagnosis on 41 samples of amniotic fluid of pregnant women infected with rubella in the first trimester Results: Accomplishment of nested RT­PCR technique in the diagnosis of rubella virus Optimization ofRT­PCR and nested PCR There were many times of optimization of components and thermal cycle of reactions of RT­PCR and nested PCR, we obtained reactive component and condition of RT­PCR and nested PCR 561 Evaluation of accuracy: The sensitivity and specificity were 100%; no cross­reactivity with other viruses Nested RT­PCR technique can detect samples containing concentrations at lo^ng/jil, corresponding to 0.001 pg/fjl which suggests that the level of detection of nested RT­PCR technique is very low Results of sequencing, gene banks Blast show that gene sequence were rubella virus Application of nested RT­PCR technique in the diagnosis of prenatal Rubella virus: In 41 amniotic fluid samples the tests conducted 15/41 positive samples, 26/41 negative samples The result was consistent with the results of real iime­PCR and in accordance with IgM test results of fetal cord blood after abortion Nested RT­PCR is a rapid diagnostic method, with high sensitivity and specificity, able to detect RNA of rubella in many different types of samples Nested RT­PCR was more advantage than that of virus isolation methods for time, less complex requires simpler equipment Condution: ~ Fully optimized nested RT­PCR technique in diagnosis of prenatal rubella virus infection with high accuracy Prenatal diagnosis similarities to real time PCR results and cord blood IgM test after abortion ­ Nested RT­PCR technique, was simple, low cost, accurate, should be deployed widely used in hospital and laboratory facility, which helps reduce the number of children with CRS, reduce the burden on family and society Assembly * Key words: Rubella virus; Nested RT­PCR LĐẶTVẲ NĐ Sốt phát ban Rubella hay “sởi Đức” virut Rubella gây nên, đặc trưng bời sốt, ban tổn thương hạch bạch huyết [ ỉ, 9] Bệnh thường nhẹ, biển chứng Tuy nhiên, phụ nữ mang thai nhiễm Rubella gặp nhiều biến chứng như: sảy thai, thai chết lưu, dị tật thai nh i Thai phụ mang thai nhiễm Rubella, thai nhi có nguy bị nhiễm R ubella bẩm sinh (Congenital Rubella Infection ­ CRĨ) bị hội chứng Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella Syndrome ­ CRS) Người mẹ bị nhiễm Rubella tháng đầu thai kỳ 80­ 100% thai nhi bị CRI 65% mắc CRS (Congential Rubella Syndromes ­ CRS) CRS có biểu như: Chậm phát triển trí tuệ, điéc bẩm sinh, đục thủy tinh thể, dị tật hệ thống tim m ạch Những đị tật gây nhiều vấn đề sức khỏe xã hội cần phải giải Theo thông báo Tổ chức Y tế The giới, tồn cầu có khoảng 800.000 người mắc Rubella năm tỷ ỉệ mắc CRS hàng năm 6­ 2,2/1000 trẻ sổng Thực íế, số lớn nhiều [3, 5, 9] Tại Việt Nam, chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phịng nhiễm Rubella; năm 2011, dịch Rubella có xu hưởng lan rộng, số lượng ca phải dinh thai nghén đo thai phụ nhiễm Rubella tăng lên nhanh mặc đ i chưa xác định thai nhi có nhiễm Rubella hay khơng? Theo Hồng Thị Thanh Thủy (2012), tháng đầu năm 2011, tính riêng Bệnh viện Phụ sản TW có tới 914 ca phải đ nh t iai nghén thai phụ nhiễm Rubella; đó, 285 thai phụ xin đ nh thai nghén khơng có định [1] Hiện nay, Việt N am chưa có phương pháp chẩn đốn trước sinh CRI đạt tiêu ch í xác, sớm rẻ đòi hỏi phương tiện đơn giản Chẩn đoán huyết học lấy máu cuống rốn muộn, độ xác hạn chê Chẳn đốn real time PCR cần phương tiện hóa chất đắt tiền, nên giá thành cao Trong vụ địch vừa qua, số ca phải đ nh thai nghén nhiều, chưa có kết xét nghiệm xác định có bị CRI hay không? Đ ể giải quyểt vấn đề trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Nested RT ­ PCR chẩn đoán nhiễm vi rút Rubella trước sinh” với mục tiêu: Hồn thiện quy trình ph t nhiễm virut Ruh ỉỉa k ỹ thuật n st d RT-PCR ­ Ắ p n g k ỹ thu ậ t n st d R T-P C R chẩn đoản nhiễm virut Rub ữa trước sinh n hổm đ i tư ng cồ nguy c cao 562 n ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N c ứ u 2.1 Đổi tượng nghiên cứu ­ Tối ưu hóa phản ứng nested RT­PCR: 01 mẫu virut Rubella phân lập từ mẫu bệnh nhiễm vinit Rubella Khoa Viruĩ, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp ­ Đánh giá độ xác kỹ thuật nested RT­ PCR: 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella, chẩn đoán kỹ thuật real time PCR phân lập virut 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm loại vi khuẩn yirut khác, gây triệu chứng phát ban Rubella ­ Áp dụng kỹ thuật nested RT­PCR chẩn đoán trước sinh ­ 41 thai phụ chẩn đoán nhiễm virut Rubella kỹ thuật huyết học 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết ARN Tách chiết ARN virut Rubella kit QIAamp@Viral RNA Mini kit, hãng QIAGEN, theo qui X ' tr nh nhà sản xuât; ARN tách chiêt lưu trữ ­80 c sử dụng Tách chiết ADN kít QIAamp® DNA M ini kit ADN sau tách chiết lưu trữ ­20°c sử dụng 2.2.2 Phản ứng khuếch đại gen nested RT-PCR ­ Phản ứng RT­PCR: ARN chuyển thành cADN nhân AD N đích nhờ phản ứng RT­PCR Kit Qiagen onestep Thể tích phản ứng gồm: 5x QIAGEN OneStep RT­PCR Buffer 10 ịil; hỗnhợp đNTP: Ịil; Q solution: 10 ụ\; enzym mix ịil; Primer R u lF ụ\; Primer R u lR |il; mẫu ARN: jil; H 2O vừa đủ 50 |il Chu tr nh nhiệt gồm giai đoạn sau: chuyển đổi ARN thành cADN 0°c 30 phút, sau biến tính °c ỉ phút; thực 30 chu kỳ gồm giai đoạn: duỗi xoắn °c 30 giây, bám mồi Ố0°c 30 giây, kéo dài ° c 45 giây Cuối giai đoạn kéo dài °c 10 phút ­ Phản ứng nested PCR: Thành phần phản ứng gồm: Buffer 10 X |il; hỗn địch dNTP 0,8 ịil; Primer Ru2F pi; Primer Ru2R Ịil; KAPA Tag Polymerase 0,2 Jil; fxl sản phẩm phản ứng RT­PCR; H20 vừa đủ 50 |U Chu tr nh nhiệt gồm giai đoạn: biến tính ° c 15 phút; thực 30 chu kỳ gồm giai đoạn:, duỗi xoắn °c 30 giây, bám mồi 61 °c 30 giây, kéo dài °c 45 giây Cuối giai đoạn kéo dài °c 10 phút Sau nhân ADN đích, điện di sản phẩm ADN agarose gel 2% phân tích kết Sản phẩm ADN phản ứng nested RT­PCR theo lý thuyết 143 bp Bảng Tr nh tự primer phục vụ nhân ADN virut Rubella Ký hiệu Tr nh tự (5’­3 ’) Vị trí Tm°c R11I­F CAACACGCCGCACGGACAAC 8807 ± 8826 66 Rul­R CCACAAGCCGCGAGCAGTCA 8991 ± 8972 Ru2­F CTCGAGGTCCAGGTCCYGCC 8826 ± 8845 66 68 Ru2­R GAATGGCGTTGGCAAACCGG 8968 ± 8949 64 Sàn phẩm 185bp 143bp 2.3 Đánh giá độ xác kỹ thuật 2.3.1 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuậỉ Tiến hành sử dụng kỹ thuật nested RT­PCR chẩn đoán 60 mẫu ARN virut Rubella 60 mẫu khác virnt Rubeỉla (12 mẫu sởi (ARN), 20 mẫu đengue (ARN), m ẫu parvovirus B19 (ADN), mẫu Chikungunya (ARN) 16 mẫu Coxsackie A (ARN), 01 mẫu Ad no virus (ADN) Lập bảng 2x2 để tính độ nhạy độ đặc hiệu 563 2.3.2 Xác định ngư ng phát kỹ ỉhuật Tách chiết ARN từ mẫu nuôi cấy virut Rubella, đo nồng độ ARN máy Nano drop; pha ỉỗng thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/fil Tiên hành pha loãng dàn mẫu ARN virut Rubella có nồng độ 100 ng/(i (tương đương 105pg/fil) theo hệ số 10 thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ngẠil, 10 ng/|il, ngậđ, ỉõ ' ng/fjl, 10'2 ng/fil, 103 ng/fil, lo4 ng/|AỈ, 10 s ng/|il, 106 ng/|il, 10 ng/fil, 10‘8 ng/jil Tiến hành chẩn đoán kỹ thuật RT­PCR nested RT­PCR mẫu pha loãng để xác định ngưỡng phát kỳ thuật 2.3.3 Giải trình tự sản phẩn phản úng nested RT-PCR Đ ê c h ứ n g rninh sản nr h ẩ n zTtzbâ” c a jJiiUIl « hả« ứĩ»ơ iivừlvU «e«í:eH iPvTi ­Pi í^ P lỊp z u il ffep vww a wiV t>r gơ«»n ­"'IP v iỉ V UU vif’if Viiul liiii ii t ụ iVUUVÚÀ UOlỉ phâm phản ứng nested RT­PCR giải tr nh tự so sánh genbank 2.4 Á p đ ụ ng k ỹ th u ậ t ne ste d R T ­P C R tro n g ch ẫn đo án trư c sinh Kỹ thuật nested RT­PCR áp dụng chẩn đoán 41 mẫu dịch ối thai phụ xác định nhiễm virut Rubella tháng đầu thai kỳ phương pháp huyết học Kết chẩn đốn cùa kỹ thuật nested RT­PCR so sánh vói kết real time­PCR kết xét nghiệm IgM mấu cuổng rốn thai nhi sau đ nh chỉnh thai nghén 2.5 Thiết bị, hóa ch t 2.5.1 Thiết b| Dụng cụ thiết bị chuyên dụng sử dụng Trung tâm nghiên cứu Y học Quân ­ Học viện Quân y gồm: máy luân nhiệt tự động GeneAmp PCR system 9700 A BI (Applied Biosystèms, Hoa Ky), may ly tâm lạnh M ikro 22R (Hettich, Đức), máy soi chụp gelDoc (Hoa Kỳ), điện cùa Bio Rad 2.5.2 Hóa ch t Qiagen ARN mini kít, Kit Qiagen onestep, Primer hãng ĩnvitrogen tổng hợp, nước khử ion, agarose, li ang ADN chuẩn hãng Sigma cung cấp vật tư tiêu hao khác r a KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hoàn thiện kỹ thuật nested RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella 3.1.1 Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR nested PCR Sau nhiều lần tối ưu hóa thành phần phản ứng chu tr rih nhiệt phản ứng giai đoạn RT­PCR giai đoạn nested PCR, chứng thu bảng thành phần phản ưng giai đoạn RT­PCR nested PCR tr nh bày chi tiết phần phương pháp nghiến cứu Trong phần báo cáo tóm tắt này, h nh ảnh tối ứu hóa nhiệt độ gắn primer thể phân tích -P h ả n ứng RT-PCR: IBipKililllllil m fs­ỉa.­iS ­5 Hình Hình ảnh tối ưu hóa nhiệt độ gắn primer phản ứng RT-PCR M: marker 100; NC: chứng âm; 1­8 ỉà băng sản phẩm phản ố ng Ta 55 °c 57°c, 58°c, 59 c , 60°c, 61 °c, 63°c, 65°c 564 Để lựa chọn nhiệt độ gắn primer tối ưu, thực phản ứng ống khác với thành phần phản ứng chu tr nh nhiệt trên; khác nhiệt độ gắn primer (Ta) Ta primer phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy primer (Tm) Thường Ta primer Tm ­ 10°c Căn vào Tm cùa primer 66°c, tiên hành thư nhiệt độ 55°c, 57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c, f c , 65°c Kết h nh cho thấy, dải nhiệt độ từ 55 ­ 65 ° c xuất băng sản phẩm Tuy nhiên, băng nhiệt độ gắn primer thấp có smear lớn Nhiệt độ tang, smear thu hẹp dần Từ 60 ­ 65°c không xuất smear Tuy nhiên, phản ứng PCR không ổn định nhiệt độ gắn primer cao, nên định chọn nhiệt độ gắn primer 60 °c Điều cho thấy, nhiệt độ < 60°c sản phẩm PCR tạo nhiều, không xuất sản phẩm phụ nhiệt độ cao, tính ổn định hoạt tính emzym polymerase giảm theo thời gian Ở 60°c, băng sản phẩm khơng có smear đậm Điều có nghĩa nhiệt độ ta thu sản phẩm đặc hiệu hiệu suất phản ứng cao Như vậy, nhiệt độ gắn primer phản ứng RT­PCR 60°c ­ Phản ứng n st d PCR H nh Kêt tối ứu hóa nhiệt độ gắn primer phản ứng nested PCR M: marker 100; NC1: chứng âm NC phản ứng RT­PCR; NC2 chứng âm hóa chất vịng 2; 1­7 băng sản phẩm phản ứng Ta 57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c, 63°c, 64°c Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết phản ứng PCR nhiệt độ gắn primer, thời gian gắn primer, thời gian kéo dài chuỗi, hoạt động enzym, nồng độ dNTP, nồng độ Mg2+ Khi tối ưu hóa phản ứng PCR, cần phải tối ưu hóa tất yếu tố để có kết tốt Tuy nhiên, cơng việc nhiều thời gian, cơng sức hóa chất V vậy, thực tể tối ưu hóa phản ứng PCR, thường tiến hành lựa chọn íhành phần phản ứng tiêu chuẩn tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ gắn primer (Ta) Ta định tới thành công hay thất bại phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, ban đầu iựa chọn thành phần phản ứng chu tr nh nhiệt Theo nguyên tắc dựa vào Tm R2­F 68°c Tm R2­R 64°c Chúng lựa chọn dải nhiệt độ tối ưu hóa cho cặp primer phản ứng nested PCR khoảng từ 57 ­ 64°c Chúng không đưa nhiệt độ Ta lên cao, v điều khơng có lợi cho hoạt tính enzym polymerase Chúng tiến hành chạy Ta nhiệt độ 57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c, 63°c, 64°c Kết h nh cho thây, Ta phản ứng Nested PCR 57°c, 58°c, 59°c, 60°c (băng từ 1­4) có băng sản phẩm phụ dài sản phẩm Ta 61°c, 63°c, 64°c xuất băng sản phẩm rõ nét khơng có sản phẩm phụ Theo ngun tắc ưu tiên sử đụng nhiệt Ta thấp, chọn Ta phản ứng nested 61°c Sau xác định Ta primer phàn ứng nested PCR 61°c, tiểp tục thay đổi thời gian gắn primer, thời gian kéo đài chuỗi, lượng template đưa vào nhung hiệu phản ứng nested không tốt nên chu tr nh nhiệt giữ nguyên cũ 3.1.2 Đánh giá độ xác kỹ thuật thuật nested RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella ­ Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật 565 Kỳ thuật xác định dương tính với 60 mẫu virut Rubella âm tính với 60 mẫu loại n ế u khác Độ nhạy kỹ thuật Se = [60:(60 + 0)] X 100% = 100%; độ đặc hiệu kỹ thuật: Sp = [60:(60 + 0)3 X 100% = 100% Các cặp primer phán ứng nested RT­PCR khơng có phản ứng chéo vởi virut khác gây triệu chứng phát ban Rubella Phản ứng chéo không xảy virut có chất ARN giống Rubella ADN khơng giống Rubella Các nghiên cứu khác giới cho thấy nested RT­ PCR có độ đặc hiệu cao (100%) [4] ­ Xác định ngưỡng phát kỹ thuật nested RT­PCR Hình Kết xác định ngư ng phát k ỹ thuật nested RT-PCR M: marker 100; NC: chứng âm NC cùa phản ứng RT­PCR; 1­11 băng sản phẩm mẫu 100ngẠiỉ, ÍOngẠiỉ, ngẠil, lO^ngẠiỉ, 10"2ngẠil, lO^ng/gỉ, ỈO^ngẠil, lO^ngẠd, 10"7ng/|i], I0'8ngẠiI Kỳ thuật nested RT­PCR phát mẫu có chứa nồng độ mức lơ 6ngẠil, tựơng ứng 0,001 pgẠil, điều cho thấy ngưõng phát kỹ thuật nested RT­PCR thấp Theo Thanapal AR cs (2008), phương pháp RT­PCR có độ nhạy ổn định so với phương pháp real time PCR [8] Cũng theo Bosma cs (1995) RT­PCR có độ nhạy tương đương với copies [4] Trong đó, nghiên cứu Kiyoko Okamoto cs (2011) khẳng định phương pháp real time PCR sử dụng kit Taqman chạy máy hãng ABI cho chẩn đốn dương tính có tối thiểu 10 copies ARN Rubella mẫu [6] Điều cho thấy kỹ thuật RT­PCR ưu thể hom so với kỳ thuật real time PCR độ nhạy Kết giải tr nh tự, Blast ngân hàng gen cho thấy, tr nh tự gen virut Rubella Phản ứng nested RT­PCR nhân đoạn gen virut Rubella virut khác 3.2 ứ n g dụng kỹ thuật nested RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella truớc sinh Sau chuẳn hóa quy tr nh mẫu chứng tiến hành áp dụng bước tiến hành chẩn đốn 41 mẫu địch thai phụ bị nhiễm virut Rubella tháng đầu 3.2.1 Kết chẩn đoán trước sinh Rubella dịch ối kết huyết học mẹ Trong 41 mẫu địch ỐỊ tiến hành xét nghiệm, 15/41 mẫu cho kết đương tính, 26/41 mẫu âm tính Kết xét nghiệm ĩgM mẹ cho trường hợp dương tính 33 trường hợp cịn lạĩâ m tính Bên cạnh đó, ket qua IgG lại cho 39 trường hợp dương tính va chi có trường âm tính Điều cho thấy, IgM IgG không phan ánh thai nhi có nhiễm virut Rubella hay khơng V vậy, khơng thể vào kết xét nghiệm IgM IgG máu mẹ để đưa định đ nh thai nghén 3.2.2 So sánh kết qu ả kỳ th u ật nested RT­PCR kỳ th u ật real tim e PC R Toàn mẫu dịch ối tién hành kỹ thuật nested RT­PCR phát virnt Rubella so sánh với kỹ íhuật kỳ thuãt real time­PCR 566 15/41 mẫu dịch ối cho kết dương tính với nested RT­PCR đo số coppies phương pháp real time­PCR Tất mẫu âm tính ngưỡng hay khơng phát có mặt ARN virut Rubella Các sản phụ có kết nested RT­PCR dương tính vói virnt Rubella định dinh thai nghén Xét nghiệm IgM máu cuống rốn thai nhi vói vi rút ru virut Rubella Kết cho thấy 15/15 số trường hợp đ nh thai nghén nghi đo CRI cho kết IgM máu cuống rốn dương tính Nested RT­PCR phương pháp chẩn đoán nhanh, với độ nhạy độ đặc hiệucao, định ARN Rubella nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác Kết xét nghiệm nhận vòng 24 kể từ nhận mẫu, ngược lại, phương pháp phân lập virat phải ­ tuần Như vậy, RT­PCR ưu việt hẳn so với phương pháp phân lập virut thời gian, phức tạp hơn, đòi hỏi thiết bị đơn giản [7, 8] Ưu điểm giúp kỹ thuật áp dụng nhiều bệnh viện, sở xét nghiệm Kỹ thuật huyết học có nhiều nhược điểm áp dụng tuổi thai > 22 tuần, tỷ ỉệ âm tính giả cao nồng độ kháng thể thấp máu cuống rốn thai nhi, lấy máu cuống rốn kỹ thuật phức tạp, tiến hành số bệnh viện chuyên sản khoa [7] Năm 2011, dịch sốt Rubella bùng phát phức tạp V iệt Nam Đặc biệt, bệnh lây lan rộng, nhiều phụ nữ mang thai nhiễm bệnh Do chưa có cơng cụ chẩn đốn nhanh, đặc biệt chẩn đoán trước sinh nhiễm Rubella bẩm sinh, kết hợp với cộng đồng íhiếu thơng tin Rubelỉa gây tâm lý hoang mang, lo lắng Hơn nữa, có nhiều phụ nữ mang thai phải đ nh thai nghén khơng có sở chẩn đốn xác, khoa học [1] V vậy, yêu cầu cần cơng cụ chẩn đốn nhanh, xácgiúp cho việckiểm sốt địch, hạn chế việc đ nh thai nghén không cần thiết [7] IV K ẾT LUẬN ­ Đã tối ưu hóa quy tr nh kỹ thuật nested RT­PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella trước sinh xác định độ nhạy độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát 10"6 ngẠil (0,001 pg/ịil) ­ Kết chẩn đoán trước sinh kỹ thuật nested RT­PCR phát 15/41 thai nhi nhiễm virut Rubella, tương đồng vói kết real time PCR xét nghiệm máu cuống rốn sau đ nh thai nghén TÀ I LIỆU TH A M K H ẢO Nguyên Vãn Thưởng, Triệu Thị Thái, Phùng Nhã Hạnh, Nguyễn Vãn Bàng (2012), Hội chứng Rubelỉa bẩm sinh Hà Nội sau vụ địch đầu năm 2011, Tạp chí Nghiên cứu Y học Nguyễn Vũ Trung (2007) Vi rút Rubeỉla V Sinh Y Học Nhã xuất Y học, Hà Nội; tr 304-307 Banatva a J E., Brown D w (2004), "Rub lla", Lancet, 363(9415), pp 1127­37 Bosma T J., Corbett K M., Eckstein M B., O'Shea s., Vijayalakshmi p., Banatvala J E., Morton K., Best J M (1995), "Use of PCR for prenatal and postnatal diagnosis of congenital rubella", J Clin Microbiol, 33(11), pp 2881­7 Cutts F T­, Robertson s E., Diaz­Ortega J L., Samuel R (1997), "Control of rubella and congenital rubelia syndrome (CRS) in developing countries, Pari Ỉ: Burden of disease from CRS", Bull World H alth Organ, 75(1), pp 55­68 Kiyoko o et al (2011) D v lopm nt o f a nov l TaqMan r al tim PCR assay for d t cting rub lla virus RNA Journal of Virological M thods 168: pp 267-271 Kazumi K, Kaneko M, Sameshima H et al (2010) Rubella outbreak on Tokunoshima Island in 2004: a population­ based study of pregnant women J Obst t Gyna col R s.36(5): pp 938-43 Thanapal AR et al (2008), Laboratory Confirmation of Cong nital Rub lla Syndrom inlnfanis: An Eye Hospital Based Investigation Journal ofM dical Virology 80:pp 536-546 WHO (2010), "Controlling rubella and preventing congenital rubella syndrome ­ global progress, 2009", Wkly Epid miol R c, 85(42), pp 413­8 567 ... hành đề tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Nested RT ­ PCR chẩn đoán nhiễm vi rút Rubella trước sinh? ?? với mục tiêu: Hồn thiện quy trình ph t nhiễm virut Ruh ỉỉa k ỹ thuật n st d RT- PCR ­ Ắ p n... mẫu bệnh phẩm nhiễm loại vi khuẩn yirut khác, gây triệu chứng phát ban Rubella ­ Áp dụng kỹ thuật nested RT? ?PCR chẩn đoán trước sinh ­ 41 thai phụ chẩn đoán nhiễm virut Rubella kỹ thuật huyết học... nh kỹ thuật nested RT? ?PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella trước sinh xác định độ nhạy độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát 10"6 ngẠil (0,001 pg/ịil) ­ Kết chẩn đoán trước sinh kỹ thuật nested RT? ?PCR phát