N G H IỀ N C Ứ U S ẢN X U Ấ T E C O T IN M INIPROINSULIN T Ừ T Ế B À O ESCHERICHIA COLI T Á I T H P Ths M H ng Trà* H ng dẫn: T S Võ M in h Trí** TĨM TẴT Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ãn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh Bệnh xảy hormone insulin tuyển tụy bị thiếu insulin đủ hoạt động hiệu quà (Glesỉie R.D, 1994) Những nghiên cứu thể giới cho thấy Ecotin, protein ức chế trypsin E coỉi tổng hợp tiết vào chu chất nhờ Ư nh tự tiết nằm đầu N Ecotin Bằng cách đung hợp tr nh tự tiết tr nh tự mã hóa Ecotin vào đầu N proinsulin th proinsulin chuyển vào chu chất tái gấp cuộn proinsulin có hiệu cao so với việc dung hợp với peptide ĩín hiệu gen p lB, dsbA, hay om pĩ (Ajamaluddin Maỉik t al, 2007) Trong nghiên cứu này, sử đụng đòng tế bào E coli tái tổ hợp (đã tạo từ nghiên cứu trước) để xây dựng quy tr nh sản xuất ecotinminiproinsulin (EMPI) quy mơ phịng thí nghiệm sau đó, sản xuất insulin người giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu nước Kếỉ cho thấy: hàm lượng ecolinMPI thu sau lên men 20,4mg/l mơi inrờng có bổ sung ethanol 1% sau tinh 13,87mg/l, với hiệu suất thu hồi đạt 68% * Từ khóa: Đái tháo đường; Ecotin miniproinsulin; Insulin; Esch richia coli tái tổ họp Pr paration of Ecotin - miniproinsulin from r combinant Esch richm colỉ Summary Diabetes is a glucose metabolic disorder disease, causing an increase in high glucose in blood, which is due to deficiency o f pancreatic insulin or inefficient insulin (Glesiie R.D, 1994) N ative proinsu in belongs to theclassof the difficulttoexpress proteins in Escherichia coli In this study, we used E coli recombinant cell lines (that had been created from the previous study) to develop an Ecotinminiproinsulin (EMPI) manufacturing process in the laboratory scale, which aimed to produce human insulin at cheap cost which can meet domestic demand The results showed that the level of MPI ecotinobiained after fermentation was 20.4 mg/1 in medium supplemented with ethanol 1% and after purification was 13.87 mg/ , with 68% of recovery yield * Key words: Diabetes, Ecotin miniproinsulin; insulin; Recombinant Esch richia coli I Đ Ặ T V Ấ N Đ È Số lượng bệnh nhân ĐTĐ ngày gia tăng khiên nhu cầu cần insulin lớn Tuy nhiên, nguồn insulin trích từ động vật khơng đủ có nhiều rủi ro nên việc sản xuất insulin người protein tái tổ hợp giải pháp hiệu Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn Gram âm E coli ưu tiên làm tế bào chủ sản xuất protein tái tổ hợp Những nghiên cứu giới cho thấy ecotin E coli tổng hợp tiết vào chu chất nhờ tr nh tự tiết nằm đầu N Bằng cách dung hợp tr nh tự tiết tr nh tự mã hóa ecotin vào đầu N cùa proinsulin, proinsulin chuyển vào chu chất, giứp pronsulin có cấu h nh tự nhiên M ặt khác, đung họp vói tín hiệu tiết ecotin th hiệu suất proinsulin thu cao hẳn so với dung hợp peptide tín hiệu gen p lB, dsbA , hay ompT với suất đạt ỉà 51 mg proinsuỉin/1 dịch lên men (Ajamaluddin M alik t al, 2007) n VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Vật liệu Chủng chủ E colỉ B834(DE3) [F~ompT hsdSiiịrũmũ) gal dcm m t (DE3)] dùng để nghiên cứu biểu gen plasmid pET43EMPI lên men quy mơ phịng thí nghiệm * Đại học Lạc H ồng Đại học Khoa học T ự n h iên TP Hồ C h í M inh ** 593 2.2 P hư on g p h áp 2.2.1 C m ứng biểu h i n ecotỉn - M P I phân đoạn chu chất E coli a Tạo shock thẩm thấu kiểm tra khả tiết cùa cotin-M PỈ chu chất Thu 1,5 ml dịch nuôi cấy cảm ứng IPTG vào eppendorf Ly tâm 10.000 vòng, phút Sinh khối huyền phù 200 ịú dung dịch chứa sucrose 25%, TrisHCl 0,3M, M gCl2 0,5 mM, EDTA mM, pH Đễ eppendorf nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 13.000 vòng, pht t, 4°c Dịch loại bỏ cặn làm tan 100 |*i dung dịch làm lạnh chứa M gCl20,5 H Í, EDTA mM, TrisHCI 10 mM, pH 8, để đá 30 phút Ly tâm 13.000 vòng, 15 phứt, 4°c Dịch (phân đoạn chu chất) thu nhận (Ajamaluddin M alik c s , 2007) Phân tích diện cùa ecotm M PĨ chu chất điện di SDSPAGE b Xác nhận prot in dung hợp cotin~MPI W st rn blot Gồm bước chuyển màng, khóa màng, phát protein bắt đặc hiệu vói kháng thể kháng HƯ118 phim 2.2.2 K hảo sát ản h hưởng củ a điều kiện nuôi cấy cảm ứng đến biểu ecotinM PĨ chu chất a Ảnh hưởng cửa thơng khí Để xác định ảnh hưởng thơng khí đến khả sinh tổng hợp ecotinMPI, chủng ni cấy tốc độ lắc 200 vịng/phút với thể tích khác từ 25 200 ml erlen 500 ml Cảm ứng biểu ecotinMPI với nồng độ IPTG 0,5 mM 24 25°c ứ n g với điều kiện, thu sinh khối từ 1,5 ml dịch nuôi cấy để kiểm tra mức độ diện ecotinMPI chu chất điện di SDSPAGE gel polyacrylamide 12,5% b Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Chủng nuôi cấy cảm ứng tổng hợp ecotinMPI tương tự mục a (dung tích ni cấy 150 ml b nh erlen 500 ml), nhiệt độ cảm ứng khác 25°c, 30 °c v 37°c Thu mẫu phân tích mức độ diện ecotinM PI chu chất tương tự mục a c Ảnh hưởng nồng độ IPTG Chủng nuôi cấy với điều kiện tương tự mục b cảm ứng ĩ ồng độ IPTG khác 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM 1,0 mM 5°c 24 để phân tích mức độ biểu ecotin MPI chu chất d Ảnh hưởng thanol Chủng ni cấy mơi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, % 5% ethanol với điều kiện ni cấy, cảm ứng phân tích tương tự mục a 2.2.3 L ên m en chững E coli B 834(Đ E3)/pET43EM PI để tổng h ợ p eotirtM PI b ằn g hệ thống lên m en tự động Chủng E coli B834(DE3)/pET43EMPI lên men môi trường labo ỉabo + ethanol 1% để tổng hợp ecotinMPI hệ thống lên men tự động BioTronLiFIus GX GX05 12302 Giống cấp ỉ cấy vào hệ thống lên men theo tỷ lệ 1/20 Giống tăng sinh 37°c đến OD600llm đạt 0,8 Bổ sung ĨPTG vào b nh lên men cho đạt nồng độ 0,5 mM N gây sau cảm ứng, nhiệt độ b nh lên men điều chỉnh xuống 25°c Tiếp tục lên men 24 M âu thu cách lúc cấy giống vào b nh lên men để phân tích sinh khối khơ ỉượng ecotinM PI tạo Các thông sổ lên men kiểm soát tr nh lên men sau: pH: 7,1 (chỉnh pH tự động NaOH HCỈ) DO: 100%, tốc độ kh í vào (air inlet): vpm, tốc độ khuấy: 250 rpm 594 2.2.4 Tinh chế ecotinMPI EcotinMPI biểu hệ thống pET43EMPI chu chất cùa E coli dạng tan V thế, protein tinh chế điều kiện tự nhiên, pH kiềm phương pháp sắc ký lực sử dụng cột Ni NTA hệ thống tinh chế HPLC Protein mục tiêu dung ỉy khỏi cột điều kiện pH kiềm nồng độ imidazole cao r a K Ế T Q UẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tối u h óa điều kiện nuôi cấy để nãng cao biểu h iện M P I đ u n g h ợ p với ecotin tro n g chu ch ấ t E coli Trong tr nh ỉên men, số yếu tố vật lý nhiệt độ, độ thơng khí ảnh hưởng lỏn đến phát triển vi sinh vật sản xuất chất chuyển h ó a Ngồi ra, để sản xuất protein tái tổ hợp từ chủng biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng nhân tố ảnh hưởng lớn đến tr nh tổng hợp chúng M ặt khác, ảnh hưởng chất bổ sung vào môi trường suốt tr nh nuôi cấy làm tăng hiệu suất protein dung hợp Ở đây, khảo sát yểu tố thơng khí, nhiệt độ, nồng độ IPTG bổ sung ethanol môi trường nuôi cấy lên tổng hợp ecotinMPI 3.1.1 Ả n h hư ởng thơng k h í Kết h nh cho thấy độ thơng khí có ảnh hường không lớn đến khả biểu ecotin MPI Trong nghiên cứu này, binh mà dịch nuôi cấy chiếm khoảng từ 15 30% thể tích binh ni cấy (hình , giếng 4, giếng 5) th hàm lượng protein ecotinMPI lớn so với ecotinM PI thu b nh có lượng dịch ni chiém khoảng 5% 40% (hình 1, giểng 2, giếng ố) Từ kết trên, độ thơng khí thích hợp chọn cho sinh tổng hợp ecotinM PI lượng dịch nuôi cấy chiếm 15 30% thể tích b nh ni cấy kD a H nh Ảnh hường độ thống khí đến khả biểu ecotinMPI chu chất 1, 30 Thang protein chuẩn; 26, Protein tái tổ hợp — E thể tích nuồi cấy 25, 50, 75, 150 200 mỉ/ thể tích b nh 500 mi 3.1.2.Ả n h hư ởng nhi t độ n uôi cấy Kết cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả biểu protein tái tổ hợp chu chất Ở 30°c, lượng protein tái tổ hợp thu sau ni cấy khơng cao V vậy, nói nhiệt độ khơng thích hợp cho chủng B834(DE3)/pET43EMPI biểu protein tái tổ họp Ổ 37°c, nhiệt độ tối ưu cho tăng trưởng E coỉi, điều kiện tối ưu để tạo sản phẩm M ặt khác, 37°c nhiệt độ thích hợp hoạt động nhiều protease Còn 25°c cho thấy vạch protein ecotinMPI đậm nỉiắt ứng vói điều kiện khảo sát 25 °c (hình 2, giếng 4) chứng tỏ nhiệt độ thích hợp để biểu ecotinMPI chu chất chủng B834(DE3)/pET43EMPĨ 595 I'D* -EM PI 3 » EMPI H nh Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu ecotinM PI chu chất 1, Thang protein chuẩn; 2, 0,25 mM; ,0 ,5 mM; ,0,7 mM; 5, ỉ mM; 6, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG 3.1.4 Ả n h hưởng bổ sung ethanol vào m ôi trư ờng nuôi cấy Kết điện di protein h nh cho thấy bổ sung ethanol vói nồng độ 2%, lượng protein tái tổ T) em tin M P ĩ hiển hiên írn nơ rh n r.hát tănơ lốn ítánrr líi th i Kỉốti kằnr> /= * A A> ĩ r í ~ u n t\ biểu protein bị ức chế hoàn toàn 5% ethan ol Như vậy, việc bổ sung ethanol 2% (v/v) làm tăng suất biểu protein ecotinMPI chu chất kDa wp H nh Ảnh hưởng ethanol (%) môi trường nuôi cấy lên biểu ecotinMPI 30— EMPĨ I I I E coll B834(DE3)/pET43EMPI 1, Thang protein chuẩn; 2,0% ; , 1%; 4,2% ; 5,3% ; 6,4% ; 7,5% 3.2 L ê n m en tỗng h ợp thu nhận ecotin-M PI h thống lên m en tự động Kết theo dõi động học tăng tnrởng chủng {hình 5) cho thấy chủng b đầu vào giai đoạn tăng trường hàm mũ sau cấy giống cấp kết thúc 16 Sinh khối tế bào đạt cực đại thời điểm 16 ni cấy vói sinh khối khơ thu thời điểm 2,6 g/I môi trirờng LB 2,8 g/1 môi trường LB bổ sung ethanol 1% 596 Đưửng cong ting tiuửng cùa chủng 2mâi tnràmo H nh Động học tăng trường chủng E coli B834(DE3)/pET43EMPI HtMglMi(ató> Để đánh giá khả biểu protein dung họp ecotinMPI chủng B834(DE3)/pET43EMPI lên men mẻ môi trường LB cõng môi trường LB + ethanol 1%, chóng tơi thu mẫu chu chất tr nh nuôi cấy thời điểm 16 giờ, 18 giờ, 22 24 kiểm tra mức độ biểu SĐS PAGE khẳng định lại W estern blot định lượng EMPI chu chất phần mềm Quantity OneImagine J phương pháp Bradford 1234 s H nh Biểu ecotinM PI chu chất E.coli theo thời gian nuôi cấy SDS PAGE (A); Western blot (B) 6, Thang protein chuẩn; 1: Trước cảm ứng; 25: 16, 18, 22, 24 sau nuôi cấy môi trường; 710: 16, 18, 22, 24 sau nuôi cấy môi trường LB + ethanol \% to Ỉ I EMPI A B Kết phân tích ecotinM PI SDSPAGE cho thấy có xuất c vạch protein ecotinM PI (khoảng 30 kDa) giếng đến (môi trường LB) giếng đến 10 (môi trường LB + ethanol 1%) (H nh 6) Đ ây mẫu protein thu phân đoạn chu chất cảm ứng biểu IPTG khoảng thời gian khác Trong m ẫu đối chứng âm vạch (H nh 6, giếng 1) M ặt khác, phim (H nh 6B) giếng xuất vạch tín hiệu tương ứng với vạch protein geỉ SDSPAGE chứng tỏ vạch protein ecotinMPI Mức độ biểu ecotinMPI chủng lên men mẻ tốt thể qua đậm độ kích thước tương đối vạch ecotinMPI so với vạch protein khác giếng 64.77 56.3 sM itru ịn glB (%EMÍ>I) HMơitmịngLB + ethanol 1% (%EMPI) B iểu đồ % EMPĨ phân đoạn chu chất sau thời điểm nuôi cấy khác môi trường (Dựa vào phần m ềm Q uantity OneIm agineJ) lổ 18giờ 22giờ 24giờ D ựa vào biểu đồ cho thấy hàm lượng EM PI thu phân đoạn chu chất cao thời điểm 22 nuôi cấy môi trường LB (chiếm 60,45% protein chu chất) thời điểm 18 nuôi cấy môi trường LB + ethanol 1% (chiếm 64,77% protein chu chất) M ặt khác, hàm lượng protein tổng phân đoạn chu chất thời điểm nuôi cấy tính tốn dựa vào phương pháp Bradford để định lượng EM PI có phân đoạn (biểu đồ 2) 597 35 ] _| ị 2Q ^ I — I 23 25,5 25 — -H àm luọiiạ protein trỄnmòi 25'^ Hõm Itỉợnạ protein tiên mơi ímịiiạLB +• ị _ j Ị , 16 te l) T T1 18giớ 22giố' B iểu đồ Hàm lượng protein tổng chu chất môi truờ ng thời điểm nuôi cấy eỉtiBiiõl i°0 24g iờ Từ biểu đồ suy ra: Hàm lượng protein EMPI thu nhiều môi trường LB là: 60,45% X 25,8 = 15,6 mg/1 Hàm lượng protein EMPĨ thu nhiều môi trường LB 4 ethanol 1% là: ,77 % X 31,5 = ,4 m g/l 3.3 T ìn h chế ecotin-M P Sau ỉên men chủng B834(DE3)/pET43EMPI thu nhận protein tái tổ hợp ecotinMPI dung hợp với Ehẻ 6xHis phân đoạn chu chất, tiển hành tinh chể ecotinMPI sắc ký lực chuyên biệt cột NiNTA Phân đoạn có protein ecotinMPI phân tích SDSPAGE để kiểm tra độ tinh (hình 7, giếng 4) H nh Kết tinh chế ecotinMPI cột NiNTA SDSPAGE (A); Western blot (B) 1, Thang phân tử lượng protein; 2, Phân đoạn sau qua cột; 3, Phấn đoạn rửa cột; 4, Phân đoạn sau dung ỉy A B Kết SDSPAGE cho thấy tr nh tinh chế ecotinMPI cột NiNTA loại bỏ phần lớn thành phần protein cùa chu chất E.coli Nhiều vạch protein địch chu chất bị qua sắc ký lực (hình 7A, giếng 2, 3), Trong phân đoạn dung ly thu vạch đậm có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa tương ứng vói vạch protein ecotinMPI khẳng định kết lai Western bỉot (hình 7B) Két định lượng protein phương pháp Bradford cho thấy từ sinh khối ỉ lít địch lên men chủng B834(DE3)/pET43EM PI thu nhận 13,87 mg ecotinMPI tinh tương ứng với hiệu suất thu hồi 13,87/20,4 = 68% V K Ể T L U Ặ N Đã thực thành công lên men chủng E coỉi B834(DE3)/pET43EMPI thu nhận protein đung hợp ecotinMPI quy mơ lít mơi trường ni cấy (20,4 mg/1) hệ thống lên men tự động tinh chế thành công ecotinMPĩ băng bước sắc kỹ lực đùng cộtNiNTA (13,87 mg/l), đạt hiệu suất 68% T À I LIỆ U T H A M K H Ả O Gleslie R.D., í 994 Y học thường thức bệnh đái tháo đường Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh, 200 írang Ajamaluddin Malik, Marco Jenzsch, Andreas Lubbert, Rainer Rudolph, (2007) Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to Esch richia coli ecotin Prot in xpr ssion and purification 55:100111 598 ... 24, Protein tái tổ họp tổng hợp nhiệt độ 37, 30 25°c môi trường cảm ứng; 5, Protein tái tổ hợp môi trường không cảm ứng Mri 3.1.3 Ả n h hư ởng I P T G Kết khảo sát h nh lượng ecotin? ?M PI chu... m g/l 3.3 T ìn h chế ecotin- M P Sau ỉên men chủng B834(DE3)/pET43EMPI thu nhận protein tái tổ hợp ecotin? ?MPI dung hợp với Ehẻ 6xHis phân đoạn chu chất, tiển hành tinh chể ecotin? ?MPI sắc ký lực... đến khả biểu ecotin? ? MPI Trong nghiên cứu này, binh mà dịch nuôi cấy chiếm khoảng từ 15 30% thể tích binh ni cấy (hình , giếng 4, giếng 5) th hàm lượng protein ecotin? ?MPI lớn so với ecotin? ?M PI