Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 XÂY D ựN G QUY TRÌN H PHÂN TÍCH GEN C R H R l VÀ FCER2 BỆNH NHÂN NHI HEN PHẾ QUẢN Pham Thi Hồng Nhung \ Vũ Thị Thom s Đậu Thế Huy s Dương Thị Ly Hương ^ Đinh Đoàn Long s Nguyễn Thị Thu Hằng ^ ‘ Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội ^ Đại học Dược Hà Nội TĨM TẮT Đa hình di truyền gen CRHRl FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid điều trị hen phế quản Tuy nhiên chưa có nghiên cứu mơ tả mối liên hệ kiểu gen khả đáp ứng thuốc corticoid bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam M ục tiêu: xây dựng quy hình phân tích kiểu gen đa hình rs242941 gen CRHRl đa hình rs28364072 ữên gen FCER2 bệnh nhân nhi hen phế quản Phương pháp: tách DNA tìr máu ngoại vi, khuếch đại gen PCR, xác định kiểu gen bệnh nhân phương pháp giải trình tự PCR-RPLP Kết quả: 40 bệnh nhân nhi hen phế quản xác định kiểu gen CRHRl FCER2 Tần số alen đột biến đa hình rs242941 rs28364072 0.10 0.33 Kết luận: chúng tơi xây dựng quy trình xác định đa hình gen FCER2 sử dụng phương pháp giải trình tự xác định đa hình gen CRHRl với hai phương pháp song song phưofng pháp PCR-RPLP giải trình tự T khóa: FCER2, CRHRl, rs242941, rs28364072, bệnh nhân nhi hen phế quản, CONSTRUCTION PROCESS TO GENOTYPE THE CRH RÍ AND FCER2 GENE VARIATIONS OF PEDIATRIC ASTHMA PATIENTS SUMMARY The genetic variations of CRHRl and FCER2 gene have significant iníluences in response to corticosteroid drugs in the treatment o f asthma Hovvever, no study about the relationship betvveen this genotypes and the response to corticosteroid in pediatric asthma Vietnamese Objectives: construction genotyping tests of CRHRl (rs242941) and FCER2 (rs28364072) polymorphisms on asthma pediatric patients M ethod: DNA extraction from blood samples, polymerase Chain reaction (PCR) ampliíication of target genes, Sanger sequencing and PCR-RFLP Results: we have identiííed the FCER2 and CRHRl genotype of 40 patients The frequencies of mutated alleles of rs242941 and rs28364072 vvere 0.10 and 0.33, respectively Conclusion: We have established successíìilly process to identiíĩed 71 Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 FCER2 polymorphisms using sequencing and CRHRl polymorphisms using PCR - RFLP and sequencing Keywords: FCER2, CRHRl, rs242941, rs28364072, pediatric asthma patients ĐẶT VÁN ĐỀ Hen phế quản bệnh hô hấp mãn tính, đa nhân tố phổ biến nước ta frên giới với tỉ lệ gia tăng liên tục trẻ em thời gian qua [3], [4] Corticoid nhóm thuốc sử dụng phổ biến điều trị hen phế quản, nhiên đến 40% bệnh nhân khơng có đáp ứng điều trị với corticosteroid dạng hít [8] Một số đa hình di truyền xác định có ảnh hưởng đến đích tác dụng hay đường dược lý thuốc, qua ảnh hưởng đến kết điều trị [9] CRHRl gen nằm ừên NST số 17 mã cho thụ thể kết cặp G-protein liên kết với neuropeptide thuộc họ hormon giải phóng corticotropin CRHRl liên quan đến việc sản xuất corticosteroid nội sinh dự báo ảnh hưởng đến đáp ứng corticosteroid ngoại sinh Đa hình rs242941 (G> T) gen CRHRỈ chứng minh làm tăng đáp ứng với điều trị corticoid dạng hít [7] FCER2 gen nằm NST số 19 mã hóa cho thụ thể gắn với IgE lực thấp (FceRII/CD23) [6] Thụ thể PceRII xuất bề mặt nhiều dòng tế bào tế bào B, tế bào tua, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào trom tiểu cầu, có vai ừị ức chế tổng hợp IgE tế bào B hoạt hóa Đa hình rs28364072 (A>G) gen FCER2 chứng minh có liên quan với việc tăng nguy đợt kịch phát với bệnh nhân dử dụng corticosteroid dạng hít [2] Các alen c có liên quan với nồng độ IgE tăng cao bệnh nhân hen suyễn Việt Nam chưa có nghiên cứu thống kê tỷ lệ thành công/thất bại thuốc điều trị hen phế quản trẻ em nguyên nhân khơng đáp ứng điều trị Chính vậy, tiến hành đề tài nhằm xây dựng quy trình phân tích đa hình CRHRl FCER2 bệnh nhân nhi hen phế quản ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Đối tượng nghiên cứu Nhóm mẫu nghiên cứu gồm 40 bệnh nhân nhi hen phế quản có độ tuổi từ 6-16 điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương 1- ml mẫu máu bệnh nhân thu nhận ống chứa chất chống đông EDTA bảo quản -30°c tách chiết DNA Phương pháp nghiên cứu 72 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 2.1 Tách chiết DMA tổng số từ máu ngoại vi DNA tổng số tách từ máu toàn phần sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.2 Thiết kể mồi đặc hiệu nhân dòng gen Các cặp mồi thiết kế đánh giá thông số với phần mềm PerlPrimer version 1.1.14 Mồi đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) Cặp mồi cho phản ứng PCR gen FCER2: 5’- TCA TAG CTC CAG CAG AGA ACA c - 3’ 5’- GCC AAG ACT CAC CCT TCT AAT CT - 3’ nhân dòng đoạn gen dài 818 bp Để phân tích rs242941, sử dụng cặp mồi 5’- CTG AGT CCA GCA GAG AAA GGG AGC CAA T - 3’ 5’- GAC ACT TCA GGA GGG GAG GGT GGA TATG - 3’ nhân dòng vùng gen CRHRl dài 381 bp [5] 2.3 Tối ưu hóa điều kiện PCR Để có quy trình nhân dịng đặc hiệu ổn định, chủng tơi làm lơ thí nghiệm tìm nhiệt độ gắn mồi nồng độ hoạt động tối iru MgS04, nồng độ mồi mẫu 17 (nồng độ DNA 177 ng/|il), mẫu 29 (nồng độ DNA 90 ng/^il), mẫu 49 (nồng độ DNA 46 ng/p.1) Đánh giá độ nhạy phưomg pháp cách pha lỗng nồng độ DNA khn theo dải 500, 100, 50, 10, ng/fil Kiểm tra độ lặp lại quy trình tối ưu với mẫu Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% so sánh kích thước với thang chuẩn Ruler 100 bp Plus DNA Ladder (SM0321, Thermo Scientiíic) 2.4 Xác định kiểu gen CRHRI PCER2 20 sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu sáng rõ điện di gửi tinh giải trình tự chiều hãng First Base (Malaysia) Kẻt giải trình tự đọc phần mềm BioEdit version 7.1.9 Tần số alen SNP tính tốn so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg sử dụng chi-square test Kiểu gen rs242941 cịn phát triển quy trình xác định PCR - RFLP với enzyme giới hạn Ssil (ER1791, Thermo Scientiĩic) KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1 Tách chiết DNA tổng sổ từ máu ngoại vi Tất 40 mẫu máu tách DNA tổng số đủ chất lượng cho thí nghiệm DNA thu cho băng sáng rõ điện di có nồng độ tìr 8-176 ụg/ml (hình 3.1) 73 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 01 02 03 04 05 06 07 08 M