Xác định thành phần và khối lượng của plutionium trong nguồn pube bằng phương pháp gamma

kffj ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC o0o Lê Thị Liên NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ IN VITRO VÀ IN VIVO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ IN-VITRO VÀ IN-VIVO Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đình Thắng tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc chuyên ngành Sinh học thực nghiệm truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ, sinh viên Phòng Sinh học Nano Ứng dụng phịng Ung thư thực nghiệm - thuộc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein người giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơn tới đề tài mang mã số KLEPT-14-02 hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho tơi điều kiện tốt để hồn thành đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2016 Học viên Lê Thị Liên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Mơ hình nghiên cứu 1.1.1 Mơ hình nghiên cứu in vitro .2 1.1.2 Mơ hình nghiên cứu in vivo 1.2 Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) 1.2.1 Đặc điểm chung 1.2.2 Tác dụng hà thủ ô đỏ y học .4 1.2.3 Một số nghiên cứu giới 1.3 Melanin 1.3.1 Giới thiệu melanin 1.3.2 Melanocyte 1.3.3 Melanosome .7 1.3.4 Cơ sở hóa sinh q trình tổng hợp melanin 1.3.5 Cơ sở di truyền trình tổng hợp melanin 1.3.6 Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin 1.3.7 Các thị phân tử xác định mức độ biểu melanin 10 1.4 Sự hình thành sắc tố melanin sinh trƣởng cá ngựa vằn 11 1.4.1 Cá ngựa vằn 11 1.4.2 Sự hình thành sắc tố melanin trình phát triển cá ngựa vằn 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị .18 2.1.4 Dụng cụ vật tư tiêu hao 18 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Tách chiết hà thủ ô 18 2.2.2 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên khả sinh tổng hợp melanin mức độ in vitro 20 2.2.3 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên khả sinh tổng hợp melanin mức độ in vivo 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết hà thủ ô đỏ 29 3.2 Kết nghiên cứu in vitro 29 3.2.1 Kết hoạt hóa nhân ni tế bào 29 3.2.2 Độc tính cao dịch chiết hà thủ ô đỏ sinh trưởng tế bào SK-MEL-28 30 3.2.3 Ảnh hưởng cao dịch chiết lên tăng sinh tổng hợp melanin tế bào SK-MEL-28 32 3.2.4 Con đường tác dụng cao dịch chiết HTO lên tổng hợp melanin .34 3.3 Kết in vivo 41 3.3.1 Thử độc tính methanol lên phát triển phơi cá ngựa vằn 41 3.3.2 Thử độc tính dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol lên phát triển phôi cá ngựa vằn .45 3.3.3 Đánh giá khả tăng sinh tổng hợp melanin dịch chiết hà thủ ô methanol lên cá ngựa vằn mức độ phiên mã 48 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm bật thời kì phát triển phơi cá ngựa vằn 13 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.3 Dụng cụ vật tư tiêu hao nghiên cứu 18 Bảng 2.4 Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng PCR nghí nghiệm in vitro 24 Bảng 2.6 Các đặc điểm gây chết q trình phơi nhiễm phơi 26 Bảng 2.7 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α 26 Bảng 2.8 Các thành phần phản ứng PCR thí nghiệm vi vitro 27 Bảng 2.9 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf 27 Bảng 2.10 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase 28 Bảng 3.1 Khối lượng cao dịch chiết thu từ bột khô rễ HTO đỏ 29 Bảng 3.2 Kết đo nanodrop RNA tổng số tách từ tế bào 35 Bảng 3.3 Dải nồng độ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 41 Bảng 3.4 Bảng thống kê dị dạng gây methanol 42 Bảng 3.5 Dải nồng độ dịch chiết hà thủ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 45 Bảng 3.6 Bảng thống kê dị dạng gây dịch chiết hà thủ ô methanol 46 Bảng 3.7 Môi trường phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn dùng cho thí nghiệm thử hoạt tính 48 Bảng 3.8 Kết tinh ARN tổng số 48 Bảng 3.9 Kết tổng hợp cADN 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây củ hà thủ ô đỏ .3 Hình 1.2 Cơng thức hóa học eumelanin pheomelanin Hình 1.3 Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin .7 Hình 1.4 Con đường tín hiệu điều khiển q trình sinh tổng hợp melanin .9 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển phôi cá ngựa vằn 14 Hình 2.1 Hình ảnh tế bào SK-MEL-28 20 Hình 2.2 Chu trình nhiệt PCR 27 Hình 3.1 Tế bào SK-MEL-28 (sau 24h hoạt hóa) .30 Hình 3.2 Tế bào sau bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ nồng độ khác 31 Hình 3.3 Biểu đồ đánh giá độc tính HTO đỏ 31 Hình 3.4 Tế bào sản sinh melanin nội bào ngoại bào 33 Hình 3.5 Sự khác biệt hàm lượng melanin sinh nồng độ dịch chiết HTO đỏ khác 33 Hình 3.6 Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số 34 Hình 3.7 Mức độ biểu gene giữ nhà GAPDH cDNA mẫu tế bào melanoma 36 Hình 3.8 Mức độ biểu gene MC1R cDNA mẫu tế bào melanoma 37 Hình 3.9 Mức độ biểu gene MITF (A) tyrosinase (B) cDNA mẫu tế bào melanoma .38 Hình 3.10 Mức độ biểu gene Nras (120bp) cDNA mẫu tế bào melanoma .39 Hình 3.11 Mức độ biểu gene ERK cDNA mẫu tế bào melanoma .40 Hình 3.12 Một số dị dạng quan sát phơi nhiễm methanol 43 Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót tỷ lệ dị dạng phơi nhiễm methanol phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 44 Hình 3.14 Một số dị dạng quan sát phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol .46 Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót tỷ lệ dị dạng phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 47 Hình 3.16 Kết điện di phân tích hình ảnh điện di Chú thích: A – Gen ef1α B – Gen mitf C – Gen tyrosinase 50 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN cADN : Acid ribonucleic : Complement acid deoxyribonucleic cAMP : Cyclic adenosine monophosphate CREB : response element-binding protein cAMP ĐC DMEM (protein bám vùng đáp ứng cAMP) : Đối chứng : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DOPA : Dihydroxyphenylalanine dpf : Day post fertilisation (ngày sau thụ tinh) ef1α : Elongation factor alpha (nhân tố kéo dài alpha) ERK EtAc : extracellular -signal -regulated kinases : Ethyl acetate Fw HTO mc1r MC1R MeOH : Forward Primer (Mồi xuôi) : Hà thủ ô : Melanocortin receptor : Melanocortin-1-receptor : Methanol MT NC n-hex OD OECD PBS Rv : Microphthalmia-associated transcription factor (nhân tố phiên mã liên kết với microphthalmia) : Môi trường : Đối chứng : n-hexane : Mật độ quang : Organisation for Economic Co-operation and Development : Phosphate – buffered saline : everse primer (Mồi ngược) PCR PKA SDS TRP1 TRP2 UV α-MSH : Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân gen) : Protein kinase A : Sodium dodecyl sulphate : Tyrosinase-related protein : Tyrosinase-related protein : Tia cực tím : α -Melanocyte-stimulating hormone mitf Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên MỞ ĐẦU Melanin loại sắc tố màu nâu đen, tìm thấy nhiều sinh vật sống, từ nấm, thực vật đến động vật có vú Nó có chức khác tất sinh vật [13] Ở người, melanin yếu tố định màu da, màu tóc Melanin tìm thấy mơ sắc tố nằm bên tròng đen mắt, tế bào thần kinh sắc tố mang khu vực não, chẳng hạn locus coeruleus chất đen [43] Rối loạn tổng hợp đường truyền dẫn melanin xem ngun nhân gây tượng tóc bị nhạt màu, nám, tàn nhang, đốm nâu sạm da Sự rối loạn sắc tố melanin gây nhiều nguyên nhân, bao gồm: yếu tố nội sinh (do di truyền) yếu tố ngoại sinh (chế độ dinh dưỡng không hợp lý, thường xuyên thức khuya, hút thuốc lá, bị stress, sốc tâm lý, tia UV ) [52] Ở thời điểm tại, chưa có số liệu thống kê cụ thể tỷ lệ bệnh nhân bị bạc tóc sớm, nákm, tàn nhang, sạm da chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu melanin chế sinh tổng hợp melanin từ tìm phương pháp điều trị [52] Ngày nay, việc chữa bệnh dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Từ lâu, nguồn dược liệu có sẵn tự nhiên dân gian sử dụng làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, chẳng hạn bệnh tim, hen suyễn, ho, thấp khớp, tiểu đường, cho thấy có kết khả quan [3] Bên cạnh đó, nhiều kết nghiên cứu cho thấy rằng, loại thuốc có nguồn gốc thảo dược có tác hại sức khỏe người, thuốc tổng hợp hóa học lại dễ gây tác dụng phụ không mong muốn [3] Các nước phương Đông, đặc biệt Việt Nam, nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm, mà hệ thống thực vật tương đối đa dạng phong phú, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc chữa bệnh từ loại thảo dược Theo kinh nghiệm dân gian, ông cha ta biết dùng hà thủ để chữa bạc tóc sớm Hà thủ có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp melanin Để trả lời câu hỏi này, chúng thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng dịch chiết hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) lên khả psinh tổng hợp melanin mức độ in vitro in vivo” với mục đích: Phân tích ảnh hưởng dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh tổng hợp melanin mơ hình tế bào mơ hình phơi cá ngựa vằn Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Mơ hình nghiên cứu 1.1.1 Mơ hình nghiên cứu in vitro thử nghiệm tế bào Phương pháp nghiên cứu sinh học thực nghiệm cho phép người nghiên cứu sử dụng thành phần, hay phận sinh vật (thường quy mô tế bào hay vi khuẩn) dạng cô lập khỏi mơi trường thơng thường nó, để nghiên cứu phân tích chi tiết trước thực sinh vật sống Nói cách khác, thử nghiệm thường gọi "thí nghiệm ống nghiệm" [54] Viê ̣c các tế bào đô ̣ng vâ ̣t có thể nuôi cấ y , trì sự tăng sinh các chai , điã ngày càng dễ dàng các phòng thí nghiê ̣m đã mở hướng mới quan trọng công cuô ̣c tìm kiế m các hoa ̣t chấ t có vai trò quan tr ọng lĩnh vực y học Có thể thấy ưu điểm mơ hình nghiên c ứu này là khả tự đô ̣ng hóa cao , rút ngắn thời gian nghiên cứu cho phép quan sát tr ực tiếp diễn biế n tra ̣ng thái bê ̣nh lí của tế bào Đồng thời, nhà nghiên cứu thao tác lúc nhiều dòng tế bào khác , nhiề u hơ ̣p chấ t khác với dải nồ ng đô ̣ rô ̣ng Tuy nhiên, mô hình này có nhươ ̣c điể m tương tác tế bào với hợp chấ t chỉ theo mô ̣t chiề u , thiế u sự tương tác giữa các tế bào với ̣ miễn dich ̣ cũng của ̣ miễn dich ̣ với chấ t thử nghiê ̣m ; điề u kiê ̣n làm viê ̣c phải hoàn toàn vơ trùng địi hỏi ki ̃ thuâ ̣t và kinh nghiê ̣m cao của người làm thí nghiê ̣m , chi phí cho thí nghiê ̣m đắ t tiề n 1.1.2 Mơ hình nghiên cứu in vivo thử nghiệm cá ngựa vằn Phương pháp in vivo dùng để thí nghiệm dùng mơ sống hay tồn thể sống làm đối tượng thử nghiệm Các phương pháp in vivo khác với in vitro (thí nghiệm ngồi thể sống, thử nghiệm ống nghiệm) thí nghiệm mô hay thể chết Thông thường, nói đến in vivo, người ta thường nghĩ đến thí nghiệm, thử nghiệm đối tượng sinh vật sống Các thí nghiệm sử dụng động vật hay thử nghiệm lâm sàng người ví dụ nghiên cứu in vivo [55] Mô hiǹ h in vivo có ưu điểm bật đánh giá xác tác động th́ c lên có thể sinh vâ ̣t có đầ y đủ sự tương tác của yế u tố : chấ t thử nghiê ̣m và ̣ miễn dich ̣ của đối tượng thử nghiệm Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên hoàng, tổn thương liên quan đến mạch máu hoại tử (hình 3.12B, 3.12C, 3.12D) Từ kết phân tích trên, kết luận rằng, mức độ gây dị dạng methanol phụ thuộc vào nồng độ thời gian phơi nhiễm Một chất coi tác nhân gây quái thai tỷ số TI (LC50/EC50) > [47] Từ số liệu thu được, giá trị LC50 EC50 ấu thể cá ngựa vằn ngày sau thụ tinh tính toán kết là: LC50 (4dpf) = 2,128 %v/v; EC50 (4dpf) = 1,821 %v/v Như vậy, methanol chất gây quái thai ấu thể cá ngựa vằn ngày tuổi (TI = 1,17) Sau thí nghiệm thử độc tính với methanol, chúng tơi thu kết quan trọng: Với nồng độ 0,75% v/v trở xuống, methanol hồn tồn khơng gây ảnh hưởng lên q trình sinh trưởng phôi cá ngựa vằn Kết sử dụng cho thí nghiệm 3.3.2 Thử độc tính dịch chiết hà thủ đỏ methanol lên phát triển phôi cá ngựa vằn Để đánh giá cách xác ảnh hưởng dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol lên sinh trưởng phôi cá ngựa vằn, sử dụng methanol nồng độ 0,75% để hòa tan cao dịch chiết hà thủ ô, đảm bảo methanol không làm ảnh hưởng đến phôi cá ngựa vằn Tương tự methanol, thử độc tính dịch chiết hà thủ ô, chúng tiến hành thí nghiệm sơ thu hẹp nồng độ cuối thử độc tính với dải nồng độ cho bảng 3.5 Bảng 3.5 Dải nồng độ dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol dùng để thử độc tính lên phơi cá ngựa vằn Nồng độ Dịch chiết hà thủ ô đỏ (mg/l) 135 175 225 295 385 500 650 845 Sau phơi nhiễm cá ngựa vằn với mơi trường có chứa dịch chiết hà thủ ơ, ngồi dị dạng quan sát phơi nhiễm methanol, xuất kiểu hình thân dị thường: Đ’i cong (hình 3.14B, 3.14D, 3.14F, 3.14G) 45 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên Bảng 3.6 Bảng thống kê dị dạng gây dịch chiết hà thủ ô methanol Dị dạng Ngày thứ Ngày thứ hai + Phù màng noãn hoàng Phù màng bao tim Tổn thương liên quan đến mạch máu Hoại tử Đuôi cong Ngày thứ ba + + Ngày thứ tƣ + + + + + + + + Hình 3.14 Một số dị dạng quan sát phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol Chú thích: e – phù nề (phù màng nỗn hồn/bao tim); h – tổn thương liên quan đến mạch máu; n – hoại tử; t – cong đuôi 46 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên Phân tích số liệu thống kê số lượng cá thể sống sót dị dạng phơi (ấu thể) cá ngựa vằn ngày tuổi ta có biểu đồ sau: Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót tỷ lệ dị dạng phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi Chú thích: Tỷ lệ sống sót Tỷ lệ dị dạng Khi phơi nhiễm phơi cá ngựa vằn dịch chiết hà thủ ô methanol, chúng thu kết tương tự phơi nhiễm methanol: Mức độ dị dạng phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ thời gian phơi nhiễm Tuy nhiên, dịch chiết hà thủ có chứa hỗn hợp chất có khối lượng phân tử lớn, việc vận chuyển khó khăn so với methanol, mà dị dạng xuất muộn Ở đây, vào ngày thứ hai, phôi cá ngựa vằn bắt đầu có biến đổi bất thường: phù màng nỗn hồng từ ngày thứ ba trở đi, đặc điểm dị thường khác xuất (bảng 3.6) Mức độ dị dạng tăng dần theo thời gian phơi nhiễm biểu rõ hình Tại nồng độ 385 mg/l 500 mg/l, ngày thứ tư, mức độ phù màng bao tim tăng lên rõ rệt (hình 3.14C, 3.14D, 3.14F, 3.14G) Từ biểu đồ hình 3.15, chúng tơi thấy rằng, 135 mg/l nồng độ an toàn, đây, cá ngựa vằn sinh trưởng hồn tồn bình thường Từ nồng độ lớn 175 mg/l bắt đầu xuất dị dạng, từ nồng độ 385 mg/l trở lên, phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bị chết Giá trị LC50, EC50, EC10 ấu thể cá ngựa vằn ngày tuổi thử dịch chiết hà thủ tính tốn kết là: 456 mg/l; 400 47 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên mg/l 245 mg/l Như vậy, dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol coi tác nhân gây quái thai cá ngựa vằn ngày tuổi (TI = 1,14) Sau thử độc tính dịch chiết hà thủ methanol lên sinh trưởng phôi cá ngựa vằn, lựa chọn nồng độ giá trị EC10 (là nồng độ mà 10% số lượng cá thể bị dị dạng) để đánh giá hoạt tính tăng sinh tổng hợp melanin cá ngựa vằn 3.3.3 Đánh giá khả tăng sinh tổng hợp melanin dịch chiết hà thủ ô methanol lên cá ngựa vằn mức độ phiên mã Dựa vào kết thu từ thí nghiệm thử độc tính dịch chiết hà thủ ô methanol lên cá ngựa vằn, tiến hành phơi nhiễm phơi nhiễm cá ngựa vằn mơi trường có chứa dịch chiết hà thủ ô methanol với nồng độ khác cho bảng 3.7 Bảng 3.7 Môi trường phơi nhiễm phơi cá ngựa vằn dùng cho thí nghiệm thử hoạt tính Mẫu Mơi trƣờng Nồng độ E3 MeOH 0,75% v/v HTO/ (0,75% MeOH) 135 mg/l HTO/ ( 0,75% MeOH) 225 mg/l Sau ngày phơi nhiễm, tiến hành thu mẫu, tinh đo hàm lượng ARN tổng số Kết trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết tinh ARN tổng số Mẫu Nồng độ (ng/µl) A260/280 235,5 1,91 79,9 1,85 22,8 1,78 45 1,93 48 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên Từ kết bảng trên, ta thấy rằng, độ tinh ARN cao, hoàn toàn đủ điều kiện tiến hành phản ứng tổng hợp cADN Tiếp theo, tổng hợp cADN từ lượng ARN thu kết thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết tổng hợp cADN Mẫu Nồng độ (ng/µl) A260/280 3856,7 1,63 3077,6 1,61 1826,3 1,55 2124,0 1,01 Theo bảng 3.9, ta thấy nồng độ cADN thu cao, đủ điều kiện để tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn Sau thực phản ứng nhân gen, chúng điện di sản phẩm gel 1,5 % để kiểm tra mức độ biểu gen ef1α, mitf tyrosinase với cặp mồi đặc hiệu Kết hình ảnh băng điện di biểu hình 3.16a Các băng phân tích định lượng phần mềm ImageJ trình bày hình 3.16b a) 49 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên b) Hình 3.16 Kết điện di phân tích hình ảnh điện di Chú thích: A – Gen ef1α – Mẫu đối chứng âm B – Gen mitf C – Gen tyrosinase – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường E3 – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa 0,75% methanol – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa 135 mg/l HTO/0,75% methanol – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa 225 mg/l HTO/0,75% methanol Từ ảnh điện di thu được, ta thấy băng ef1α, mitf tyrosinase lên đúng kích thước (ef1α: 202 bp, mitf: 176 bp, tyrosinase: 192 bp), điều chứng tỏ chúng khuếch đại thành công đoạn genquan tâm Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng ef1α, gen quản gia, làm chuẩn để so sánh mức độ biểu gen mitf tyrosinase mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm với mơi trường có bổ sung không bổ sung dịch chiết hà thủ ô Gen quản gia gen biểu mức độ tế bào, mô quan thời điểm Do đó, dựa vào mức độ biểu ef1α để đánh giá biểu gen mitf tyrosinase Nhìn vào hình ảnh điện di, ta thấy rằng, độ sáng băng ef1α mẫu tương đối (hình 3.16a-A) Trong đó, với lượng mẫu tương đương, băng mitf giếng có độ sáng khác (hình 3.16a-B) Ở giếng 3, độ sáng băng mờ giếng lại Kết phù hợp giếng mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm môi trường không bổ sung hà thủ ô, giếng 5, cá ngựa vằn phơi nhiễm với mơi trường có chứa dịch chiết hà thủ methanol với nồng độ tăng 50 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên dần Tương tự vậy, hình 3.16a-C, giếng không lên băng, giếng 5, băng lên rõ ràng Điều giải thích dịch chiết hà thủ ô methanol tác động làm tăng biểu tyrosinase Đồng thời định lượng phần mềm phân tích hình ảnh băng điện di, giếng có hàm lượng ef1α lớn (9,30; 11,57) hàm lượng giảm dần giếng 4, (hình 3.16b-A) với gen mitf tyrosinase, hàm lượng tăng dần giếng 4, so với giếng giếng (hình 3.16b-B, hình 3.16b-C) Từ phân tích đây, chúng kết luận rằng, dịch chiết hà thủ ô methanol có khả làm tăng biểu mitf tyrosinase mức độ phiên mã 51 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên KẾT LUẬN Từ kết thu đây, chúng rút số kết luận sau:  Đã chứng minh cao dịch chiết hà thủ đỏ methanol có khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin tế bào melanoma SKMEL-28 nồng độ < 5000µg/ml thơng qua đường MAPK/ MITF/ tyrosinase  Dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol có khả gây dị dạng phơi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi (giá trị LC50 = 456 mg/l)  Bước đầu nhận thấy khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin cá ngựa vằn dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol thông qua làm tăng biểu phân tử mitf tyrosinase mức độ phiên mã 52 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên KIẾN NGHỊ Với kết thu được, chúng xin đưa số hướng nghiên cứu sau: Tách, tinh chất có cao dịch chiết methanol hà thủ ô đỏ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Thực thí nghiệm để xác định chất có cao dịch chiết hà thủ đỏ có ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp melanin tế bào SKMEL-28 melanocyte Tiếp tục tìm hiểu sâu chế phân tử tác dụng cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh tổng hợp melanin tế bào sinh sắc tố Khảo sát ảnh hưởng cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên biểu có gen khác đóng vai trị quan trọng đường điều hòa sinh tổng hợp melanin cá ngựa vằn mc1r, dct, Nras, Erk, Đánh giá ảnh hưởng cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên biểu mức độ dịch mã (protein) phân tử mitf, tyrosinase, mc1r, dct, Đánh giá tác dụng cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh melanin mô hình động vật khác 53 Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học (Tập 1), NXB Y học Phan Quốc Kinh (2011), Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Giáo dục Tiếng Anh “Approache to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase”, Journal of Investigative Dermatology, 127(4), pp.751-761 Andersson L (2003), "Melanocortin 1-receptor (MC1R) mutations are associated with plumage colour in chicken," Animal genetics, 34, pp 241-248 Beermann F., S J Orlow, R E Boissy, A Schmidt, Y L Boissy and M L Lamoreux (1995), “Misrouting of tyrosinase with a truncated cytoplasmic tail as a result of the murine platinum (cp) mutation”, Experimental eye research, 61(5), pp 599-607 Bellei B., E Flori, E Izzo, V Maresca and M Picardo (2008), “GSK3β inhibition promotes melanogenesis in mouse B16 melanoma cells and normal human melanocytes”, Cellular signalling, 20(10), pp 1750-1761 Bertolotto C., P Abbe, K Bille, E Aberdam, J P Ortonne and R Ballotti (1998), “Different cis-acting elements are involved in the regulation of TRP1 and TRP2 promoter activities by cyclic AMP: pivotal role of M boxes (GTCATGTGCT) and of microphthalmia”, Molecular and cellular biology, 18(2), pp 694-702 Bolognia J, Orlow S Regulation of Melanin Biosynthesis Bolognia: Dermatology (2nd Ed)Chapter 64 – Melanocyte BiologySection Ten – Pigmentary Disorders: Elsevier Inc; 2008 10 Brenner M, Hearing VJ Modifying skin pigmentation – approaches through intrinsic biochemistry and exogenous agents Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 2008;5(2):e189-e99 eng 54 Luận văn Thạc sĩ 11 Lê Thị Liên Carlson JA, Linette GP, Aplin A, Ng B, Slominski A Melanocyte receptors: clinical implications and therapeutic relevance Dermatol Clin 2007 Oct;25(4):541-57, viii-ix PubMed PMID: 17903613 Pubmed Central PMCID: 2732336 eng 12 Cerenius L., B L Lee and K Söderhäll (2008), “The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity”, Trends in immunology, 29(6), pp 263-271 13 Césarini JP, I.N.S.E.R.M Melanins and their possible roles through biological evolution Advances in Space Research 1996;18(12):35-40 14 Chang T S (2012), “Natural melanogenesis inhibitors acting through the down-regulation of tyrosinase activity”, Materials, 5(9), pp.1661- 1685 15 Dahm R., R Geisler and C Nüsslein‐Volhard (2005), Zebrafish (Danio rerio) genome and genetics, Wiley‐VCH Verlag GmbH and Co KgaA 16 D'Orazio J., S Jarrett, A Amaro-Ortiz and T Scott (2013), “UVRadiation and the Skin”, International journal of molecular sciences, 14(6), pp 12222-12248 17 Eva Maria (2009), “Studies of Proteins that Regulate Melanin Synthesis”, Toronto., Kerje S., Lind J., Schutz K., Jensen P 18 Flinn L., S Bretaud, C Lo, P W Ingham and O Bandmann (2008), “Zebrafish as a new animal model for movement disorders” Journal of neurochemistry, 106(5), pp 1991-1997 19 Gillbro JM, Olsson MJ The melanogenesis and mechanisms of skinlightening agents-existing and new approaches Int J Cosmet Sci 2011 Jun;33(3):210-21 PubMed PMID: 21265866 20 Groves A K., Bronner-Fraser M (1998), “7 Neural Crest Diversification”, Current topics in developmental biology, 43, pp 221-258 21 Halaban R., R S Patton, E Cheng, S Svedine, E S Trombetta, M L Wahl, and D N Hebert (2002), “Abnormal acidification of melanoma cells induces tyrosinase retention in the early secretory pathway”, Journal of Biological Chemistry, 277(17), pp 14821-14828 22 Hawkes J W (1973), “The structure of fish skin II The chromatophore unit”, Cell and tissue research, 149(2), pp 159-172 55 Luận văn Thạc sĩ 23 Lê Thị Liên Howe K., M D Clark, C F Torroja, J Torrance, C Berthelot, M Muffato, and B Plumb (2013), “The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome”, Nature, 496(7446), pp 498-503 24 Jiang Z., J Xu, M Long, Z Tu, G Yang and G He (2009), “2, 3, 5, 4′tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside (THSG) induces melanogenesis in B16 cells by MAP kinase activation and tyrosinase upregulation”, Life sciences, 85(9), pp 345-350 25 Jimbow K., Sugiyama S (1998), “Melanosomal translocation and transfer”, The Pigmentary System: Physiology and Pathophysiology New York: Oxford University Press, pp 107-114 26 Johnson S L., D Africa, C Walker and J A Weston (1995), “Genetic control of adult pigment stripe development in zebrafish”, Developmental biology, 167(1), pp 27-33 27 Kerje S., Lind J., Schutz K., Jensen P and Andersson L (2003), "Melanocortin 1-receptor (MC1R) mutations are associated with plumage colour in chicken," Animal genetics, 34, pp 241-248 28 Kimmel C B., W W Ballard, S R Kimmel, B Ullmann and T F Schilling (1995), “Stages of embryonic development of the zebrafish”, Developmental dynamics, 203(3), pp 253-310 29 Kwon B S., A K Haq, S H Pomerantz and R Halaban (1987), “Isolation and sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse c-albino locus”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 84(21), pp 7473-7477 30 Lipsker D, Boeckler P Hyperpigmentation Dermatologie 2006;Tous droits réservés 31 Liu W S., Kuan Y D., Chiu K H., Wang W K., Chang F H., Liu C H., et al (2013), "The extract of Rhodobacter sphaeroides inhibits melanogenesis through the MEK/ERK signaling pathway," Marine drugs, 11, pp 1899-1908, 50 32 Melanocyte regeneration reveals mechanisms of adult stem cell regulation," Seminars in cell & developmental biology, 20, pp 117-124 56 Luận văn Thạc sĩ 33 Lê Thị Liên Milos N., Dingle, A D (1978), “Dynamics of pigment pattern formation in the zebrafish, Brachydanio rerio I Establishment and regulation of the lateral line melanophore stripe during the first eight days of development”, Journal of Experimental Zoology, 205(2), pp 205- 216 34 Nakajima A, Funasaka Y, Kawana S Investigation by in vivo reflectance confocal microscopy: melanocytes at the edges of solar lentigines Experimental Dermatology 2012;21:18-21 35 Nordlund JJ, Boissy R, Hearing V The pigmentary system: physiology and pathophysiology, 2d ed Portland: Ringgold Inc; 2006 36 O'Reilly-Pol T and Johnson S L (2009), "Melanocyte regeneration reveals mechanisms of adult stem cell regulation," Seminars in cell & developmental biology, 20, pp 117-124 37 Orr-Urtreger A., A A R O N Avivi, I T Z H A K Zimmer, D A V I D Givol, Y O S E F Yarden and P E T E R Lonai (1990), “Developmental expression of c-kit, a proto-oncogene encoded by the W locus”, Development, 109(4), pp 911-923 38 Parichy D M., D G Ransom, B Paw, L I Zon and S L Johnson (2000), “An orthologue of the kit-related gene fms is required for development of neural crest-derived xanthophores and a subpopulation of adult melanocytes in the zebrafish, Danio rerio”, Development, 127(14), pp 3031-3044 39 Parichy D M., J F Rawls, S J Pratt, T T Whitfield and S L Johnson (1999), “Zebrafish sparse corresponds to an orthologue of c-kit and is required for the morphogenesis of a subpopulation of melanocytes, but is not essential for hematopoiesis or primordial germ cell development”, Development, 126(15), pp 3425-3436 40 Park H J., N Zhang and D K Park (2011), “Topical application of Polygonum multiflorum extract induces hair growth of resting hair follicles through upregulating Shh and β-catenin expression in C57BL/6 mice”, Journal of ethnopharmacology, 135(2), pp 369-375 41 Parvez S., M Kang, H S Chung, C Cho, M C Hong, M K Shin and H Bae (2006), “Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents”, Phytotherapy Research, 20(11), pp 921-934 57 Luận văn Thạc sĩ 42 Lê Thị Liên Prota G., M D’Ischia and A Napolitano (1998), “The chemistry of melanins and related metabolites”, The pigmentary system, pp 307-332 43 Raible D W., A Wood, W Hodsdon, P D Henion, J A Weston and J S Eisen (1992), “Segregation and early dispersal of neural crest cells in the embryonic zebrafish”, Developmental dynamics, 195(1), pp.29-42 44 Rawls J F., E M Mellgren and S L Johnson (2001), “How the zebrafish gets its stripes”, Developmental biology, 240(2), pp 301-314 45 Reemann P., Reimann E., Ilmjarv S., Porosaar O., Silm H., Jaks V., et al (2014), "Melanocytes in the skin comparative whole transcriptome analysis of main skin cell types," PloS one, 9, e115717., 46 Schiaffino M V (2010), “Signaling pathways in melanosome biogenesis and pathology”, The international journal of biochemistry & cell biology, 42(7), pp 1094-1104 47 Speeckaert R, Van Gele M, Speeckaert MM, Lambert J, van Geel N The biology of hyperpigmentation syndromes Pigment cell & melanoma research 2014;27(4):512-24 Eng, 48 Steel K P., D R Davidson and I J Jackson (1992), “TRP-2/DT, a new early melanoblast marker, shows that steel growth factor (c-kit ligand) is a survival factor” Development, 115(4), pp 1111-1119 49 Sugimoto M., N Uchida and M Hatayama (2000), “Apoptosis in skin pigment cells of the medaka, Oryzias latipes (Teleostei), during longterm chromatic adaptation: the role of sympathetic innervation”, Cell and tissue research, 301(2), pp 205-216 50 Sun YN, Cui L, Li W, Yan XT, Yang SY, Kang JI, Kang HK, Kim YH (2013), “Promotion effect of constituents from the root of Polygonum multiflorum on hair growth”, Bioorg Med Chem Lett 23(17): pp 4801-4805 51 Tobin D J., R Paus (2001), “Graying: gerontobiology of the hair follicle pigmentary unit”, Experimental gerontology, 36(1),pp 29-54 52 Uyen L, Nguyen D, Kim E-K Mechanism of skin pigmentation Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008 2008/08/01;13(4):383-95 Eng, 58 Luận văn Thạc sĩ 53 Lê Thị Liên Yee N S., Pack M (2005), “Zebrafish as a model for pancreatic cancer research”, Pancreatic Cancer, pp 273-298 Websise 54 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC175930 55 http://www.perfinity.com/) 59 ... Tyrosinase gắn vào màng hạt melanosome, cấu trúc gồm có ba phần: phần nằm melanosome có hoạt tính xúc tác enzyme, phần thứ hai ngắn nằm xuyên màng cuối phần cho phép tyrosinase gắn xác vào hạt melanosome... Liên Bảng 2.8 Các thành phần phản ứng PCR thí nghiệm vi vitro Thể tích (μl) Thành phần Taq Buffer 2,5 dNTP 2,5 Fw Rv Taq polymerase 0,2 Tùy vào nồng độ khuôn Khuôn ADN Thêm vào lượng cho tổng thể... xanthophore iridophore Trong trình phát triển sau này, khoảng vài tuần vài tháng, sọc sáng tối thứ cấp thêm vào mặt lưng mặt bụng theo phát triển cá, với 4-5 sọc tối cá trưởng thành Cuối cùng, xuất