Nghiên cứu sự biểu hiện oxa B-lactamase ở Acinetobacter baumannii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN OXA β-LACTAMASE Ở Acinetobacter baumannii Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN OXA β-LACTAMASE Ở Acinetobacter baumannii Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS HỒ HUỲNH THÙY DƢƠNG TP HỒ CHÍ MINH, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tốt nghiệp, ngồi cố gắng, tâm huyết thân, xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu quý thầy cô trƣờng Đại Học Bách Khoa tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu cho Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Bách Khoa theo sát, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khóa học Q thầy cô Bộ môn Di Truyền Đại Học Khoa Học Tự Nhiên giúp đỡ tạo điều kiện để thực luận văn Ban Giám Đốc Công Ty TNHH CNSH Khoa Thƣơng tạo điều kiện tốt cho làm việc học tập PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, ThS Nguyễn Tuấn Anh tận tình hƣớng dẫn, góp ý hỗ trợ tơi suốt thời gian thực luận văn Các anh, chị, em ngƣời bạn động viên, giúp đỡ đồng hành Cuối cùng, xin gởi lịng biết ơn chân thành đến ba mẹ, ngƣời ln miệt mài đến cuối đƣờng dài Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2014 Nguyễn Thị Minh Tâm iii TĨM TẮT Chúng tơi nghiên cứu biểu gen OXA β-lactamase (blaOXA) Acinetobacter baumannii Kết phân tích nhóm gen bla OXA đƣợc tiến hành 252 mẫu thu thập bệnh viện: Bệnh viện Đại học Y dƣợc Tp HCM, Bệnh viện đa khoa Đồng Nai Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai cho thấy A baumannii chủ yếu đƣợc phân lập từ mẫu đàm với tỷ lệ kháng loại kháng sinh khác từ 60-80% Chủng mang hai nhóm gen bla OXA-23 bla OXA-51 chiếm tỷ lệ cao Phản ứng duplex Taq-Man real-time RT-PCR đƣợc tối ƣu với nồng độ mồi mẫu dò tƣơng ứng 0,4µM 0,2µM (đối với gen 0,1µM (đối với gen bla bla OXA-51); 0,2µM OXA-23), nồng độ hỗn hợp Apta Taq 1,5X Enzyme DNase sử dụng để xử lý RNA sau tách chiết 4µl/phản ứng Qui trình cảm ứng đƣợc tiến hành với kháng sinh Penicillin G (4µg/ml) Meropenem (0,01µg/ml), cảm ứng 370C, lắc 160rpm ngừng nồng độ tế bào đạt 2,0Mc Kết khảo sát biểu nhóm gen bla OXA số chủng lâm sàng cho thấy chủng mang hai nhóm gen blaOXA-23 blaOXA-51 biểu mạnh chủng mang nhóm gen blaOXA-51 (trong phạm vi khảo sát) Tuy nhiên, mức độ ảnh hƣởng chƣa có qui luật chung chƣa thể khẳng định chắn iv ABSTRACT We studied the expression of OXA β-lactamase (blaOXA) in Acinetobacter baumannii The analysis for different types of bla OXA was conducted on 252 samples collected from three hospitals: University medical center HCMC, Dong Nai General hospital and Dong Nai-Thong Nhat general hospital The result showed that A.baumannii was isolated primarily from sputum and the resistance rate to different antibiotics was from 60 to 80% The number of strains carrying both blaOXA-23 and bla OXA-51 genes has the highest percentage Duplex Taq-Man real-time RT-PCR was optimized with 0,4 µM primers and 0,2µM probes for primers and 0,1µM probes for bla bla OXA-51 gene; 0,2µM OXA-23; and 1,5X Apta Taq enzyme mixture After RNA was extracted, the amount of DNase for cleaning up DNA was 4µl/ reaction The induction process employed Penicillin G (4µg/ml) or Meropenem (0,01µg/ml), performed at 370C, shaked (160rpm) and stopped when cell concentration reached 2,0Mc bla OXA expression on some clinical strains showed that the strains carrying both blaOXA-23 andblaOXA-51 genes had higher expression than those having only bla OXA-51 gene (within the scope of our study) However, this influence needs to be confirmed further v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2014 Nguyễn Thị Minh Tâm vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v LỜI CAM ĐOAN vi MỤC LỤC vii CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ xiii DANH MỤC ĐỒ THỊ xiv CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ Acinetobacter baumannii 2.1.1 Phân loại, mô tả 2.1.2 Sự nguy hiểm Acinetobacter baumannii 2.2 TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở Acinetobacter baumannii 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 KHÁNG SINH, NHÓM KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH 2.3.1 Kháng sinh nhóm kháng sinh β-lactam 2.3.2 Cơ chế kháng kháng sinh 10 2.4 HỆ ENZYME β-LACTAMASE VÀ ENZYME OXA β-LACTAMASE 11 2.4.1 Hệ enzyme β-lactamase 11 2.4.2 Enzyme OXA β-lactamase 12 2.5 CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH β-LACTAM Ở Acinetobacter baumannii 14 2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HIỆN NAY VỀ Acinetobacter baumannii 14 vii CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 VẬT LIỆU 17 3.1.1 Thiết bị máy móc 17 3.1.2 Hóa chất 17 3.1.3 Môi trƣờng 18 3.1.4 Nguyên vật liệu 18 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu lâm sàng 18 3.2.2 Phƣơng pháp tách chiết cột thu DNA 18 3.2.3 Phƣơng pháp monoplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man 19 3.2.4 Phƣơng pháp tách chiết tủa thu RNA 22 3.2.5 Phƣơng pháp xử lý RNA sau tách chiết enzyme DNase 24 3.2.6 Phƣơng pháp reverse transcription (RT) 24 3.2.7 Phƣơng pháp duplex Taq-Man real-time RT-PCR 25 3.2.8 Phƣơng pháp nuôi cấy cảm ứng biểu gen blaOXA A.baumannii26 3.2.9 Phƣơng pháp định lƣợng acid nucleic 27 3.2.10 Phƣơng pháp đo độ đục 28 3.2.11 Phƣơng pháp lọc vô khuẩn kháng sinh 28 3.2.12 Phƣơng pháp giải trình tự gen 29 3.2.13 Phƣơng pháp xác định biểu tƣơng đối gen 29 3.2.14 Phƣơng pháp xử lý thống kê 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 4.1 KẾT QUẢ THU THẬP MẪU LÂM SÀNG A baumannii VÀ PHÂN NHÓM CÁC LOẠI blaOXA 31 4.1.1 Bệnh viện Đại Học Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh 32 4.1.2 Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai 36 4.1.3 Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai 40 4.2 XÂY DỰNG QUI TRÌNH DUPLEX TAQ-MAN REAL-TIME RT-PCR 43 4.2.1 Thử nghiệm hiệu phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR 44 4.2.2 Tối ƣu phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với blaOXA-5 IC 46 4.2.3 Khảo sát lƣợng enzyme DNase sử dụng 50 4.2.4 Chứng minh hiệu phản ứng duplex Taq-Man real-time RT- PCR 51 4.3 XÂY DỰNG QUI TRÌNH CẢM ỨNG BIỂU HIỆN NHĨM GEN blaOXA51 TRÊN CHỦNG CHUẨN Acinetobacter baumannii ATCC 19606 54 viii 4.3.1 Khảo sát thời điểm kết thúc cảm ứng biểu 54 4.3.2 Khảo sát nồng độ loại kháng sinh sử dụng cảm ứng 56 4.4 CẢM ỨNG BIỂU HIỆN TRÊN CHỦNG LÂM SÀNG 61 4.4.1 Chủng lâm sàng mang gen blaOXA-51 61 4.4.2 Chủng lâm sàng mang gen blaOXA-23,51 62 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 5.1 KẾT LUẬN 68 5.2 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 73 ix CHỮ VIẾT TẮT ATCC : American Type Culture Collection NCBI : National Center for Biotechnology Information BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bla : OXA β-lactamase OXA LB : Luria Bertami (môi trƣờng nuôi vi khuẩn) LB : Lysis buffer (hóa chất tách chiết cột) PCR : Polymerase Chain Reaction DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid cDNA : Complementary DNA dNTP : Deoxyribonucleotide triphodphate IC : International control (Chứng nội) WB : Washing buffer Ct : Threshold cycle Mc : McFarland RT : Reverse transcription DEPC : Diethyl pyrocarbonate ANOVA : Phân tích phƣơng sai + : Có diện hay dƣơng tính - : Khơng diện hay âm tính x Tài liệu tham khảo [10] Chouchani, C., et al., Evolution of beta-lactams resistance in Gram-negative bacteria in Tunisia, Crit Rev Microbiol, 167-77 [11] Corvec, S et al (2003), AmpC cephalosporinase hyperproduction in Acinetobacter baumannii clinical strains, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, pp 629-635 [12] Corvec, S et al (2007), Genetics and expression of the carbapenemhydrolyzing oxacillinase gene blaOXA-23 in Acinetobacter baumannii Antimicrob Agents Chemother, p 1530-3 [13] Cuzon, G., et al (2008), Plasmid-encoded carbapenem-hydrolyzing betalactamase OXA-48 in an imipenem-susceptible Klebsiella pneumoniae strain from Belgium Antimicrob Agents Chemother, 52(9): p 3463-4 [14] Donald, H.M et al (2000), Sequence analysis of ARI-1, a novel OXA betalactamase, responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii 6B92 Antimicrob Agents Chemother, p 196-9 [15] Garlantezec, R et al (2011), Investigation and management of an imipenemresistant oxa-23 Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit Med Mal Infect, p 430-6 [16] Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using RealTime Quantitative PCR (2008) Applied Biosystems [17] Hao-Yuan, L et al (2010), Risk factors and resistant mechanisms of imipenem resistant A baumannii in Taiwan [18] Heritier, C et al (2005), Characterization of the naturally occurring oxacillinase of Acinetobacter baumannii Antimicrob Agents Chemother, p 4174-9 [19] Higgins, P.G et al (2013), OXA-235, A novel Class D Beta-Lactamase Involved in Resistance to Carbapenems in Acinetobacter baumannii American Society for Microbiology [20] Jeon, B.C et al (2005), Investigation of a nosocomial outbreak of imipenemresistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 beta-lactamase in korea J Clin Microbiol, p 2241-5 70 Tài liệu tham khảo [21] Karmostaji A et al (2013), Distribution of OXA-Type Class D β-Lactamase Genes Among Nosocomial Multi Drug Resistant Acinetobacter baumannii Isolated in Tehran Hospitals, Jundishapur Journal of Microbiology [22] Libera, M.D et al (2003), Outbreak of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Producing the OXA-23 Enzyme in Curitiba, Brazil, J Clin Microbiol, pp 3403–3406 [23] Livak, K.J et al (2001), Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method, Elsevier Science (USA), Methods 25, 402–408 [24] Naas, T et al (2005), Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the carbapenemase OXA-23 in a tertiary care hospital of Papeete, French Polynesia J Clin Microbiol, p 4826-9 [25] Ning, D et al (2010), Drug-resistant genes carried by Acinetobacter baumanii isolated from patients with lower respiratory tract infection, Chinese Medical Journal, pp 2571-2575 [26] Peleg, A.Y., Seifert, H., Paterson, D.L (2008), Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen, Clin Microbiol Rev [27] Poirel, L., Nordmann, P (2006), Cephalosporinase over-expression resulting from insertion of ISAba1 in Acinetobacter baumannii, Clin Microbiol Infect, pp 123–130 [28] Poirel, L., Nordmann, P (2006), Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology Clin Microbiol Infect [29] Poirel, L et al (2007), Carbapenemases: molecular diversity and clinical consequences Future Microbiol, 501-512 [30] Rezaee, M.A et al (2013), Prevalence of Ambler class A β-lactamases and ampC expression in cephalosporin-resistant isolates of Acinetobacter baumannii Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, pp 330–334 [31] Sinha, N., Agarwal, J., Srivastava, S., Singh, M (2013), Analysis of carbapenem-resistant Acinetobacter from a tertiary care setting in North India, Department of Microbiology, pp 60-63 71 Tài liệu tham khảo [32] Teichroeb, K (2011), ESBLs: Molecular Mechanism of Resistance Microbial Pathogenicity [33] Turton, J.F et al (2006), The role of ISAba1 in expression of OXA carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii Federation of European Microbiological Societies, pp.72-77 [34] Virologie, S.B et al (2006), Genetic Structures at the Origin of Acquisition and Expression of the Carbapenem-Hydrolyzing Oxacillinase Gene bla OXA-58 in Acinetobacter baumannii, American Society for Microbiology, pp 1442–1448 [35] Walther, J (2006), OXA-type carbapenemases, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, p 373–383 Web tham khảo [36] http://www.davolterra.com/content/resistance-antibiotics-rise [37].http://vnreview.vn/goc-nhin-vnreview/-/view_content/content/731496/hieu-vekhang-sinh-va-su-dung-khang-sinh-dung-cach [38].http://hoanmy.com/saigon/index.php?option=com_content&task=view&id=59 83&Itemid=109 [39] https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Acinetobacter_baumannii [40] http://www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.php [41].http://benhnhietdoi.vn/tin-tuc/Nghien-cuu-khoa-hoc/hoi-chung-hoat-hoa-daithuc-bao-sau-nhiem-khuan-huyet-do-acinetobacter-baumannii_7976.html [42].http://benhviendakhoabotrach.com/3/00002-xac-dinh-gen-da-khang-cuachung-acinetobacter-baumannii-phan-lap-duoc-tai-benhvien.aspx?id_tt=50C45FFE-B569-442A-8A93-78048F012E8D [43] http://www.yhanoi.com/forum/showthread.php?t=326&page=19 72 Phụ lục PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: CÁC QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT 1.1 Qui trình tách chiết tủa thu RNA Chuẩn bị eppendorf 1,5ml đánh số tƣơng ứng với số mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900l dung dịch Cho 100l dung dịch mẫu xử lý vào ống Vortex mạnh eppendorf máy vortex giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200l dung dịch Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị eppendorf 1,5ml mới, đánh số tƣơng ứng với số mẫu Chuyển 600l dịch sang ống eppendorf 1,5ml Thêm 600l dung dịch (dung dịch cần đƣợc trộn trƣớc sử dụng) Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 12 Thêm 900l dung dịch 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60C bồn ủ nhiệt khô (Tránh để cặn / RNA khơ q lâu, nhƣ gây khó khăn cho việc hịa tan lại tủa sau này) 16 Hịa cặn 50l dung dịch Nếu khơng tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản RNA tách chiết 2-8C vòng 2-3 ngày, 20C vòng tháng 73 Phụ lục 1.2 Qui trình tách chiết cột Đặt ống nƣớc cất TE vào bể ủ nhiệt 700C Trong ống 1.5ml, cho vào 10µl ddK (ghi tên ống 1.5ml tƣơng ứng với mẫu) Hút 200µl mẫu tƣơng ứng vào ống Thêm 200µl dung dịch LB, vortex giây Ủ 20 phút 700C Thêm 100µl DS, vortex giây (Chỉnh pipette 600µl) Đƣa tồn hỗn hợp vào cột (ghi tên mẫu nắp cột) Đóng nắp ly tâm 8000v/1 phút Bỏ dịch lọc Đặt cột vào ống 2ml Thêm vào 600µl dung dịch WB1 Ly tâm 8000v/1 phút Bỏ dịch lọc Đặt cột vào ống 2ml Thêm vào 600µl dung dịch WB2 Ly tâm 8000v/1 phút Bỏ dịch lọc Đặt cột vào ống 2ml Ly tâm 13000v/3 phút để loại bỏ hết dấu vết cồn 10 Đặt cột vào ống 1.5ml (Nhớ ghi tên ống 1,5ml giống với cột) 11 Thêm vào 50µl TE 700C Ủ 20 phút 700C 12 Ly tâm 13000v/3 phút để thu DNA 13 Bảo quản DNA -40C, -200C hay -700C tùy theo mục đích sử dụng PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỐI ƢU PHẢN ỨNG DUPLEX REAL-TIME PCR 2.1 Kết thử nghiệm hiệu phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Bảng 2.1: Kết thử nghiệm hiệu phản ứng Duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) 1,42 x 102 1,42 x 103 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu Ct IC Ct mẫu Ct IC Ct mẫu Lần 27,63 28,44 24,69 25,1 21,67 21,79 Lần 27,28 28,02 25,05 24,98 21,74 21,67 Lần 27,75 28,06 24,43 25,23 21,11 21,97 TB 27,55 28,17 24,72 25,10 21,51 21,81 74 Phụ lục 2.2 Kết tối ƣu mồi, mẫu dò phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Bảng 2.2: Kết NT1 tối ưu mồi, mẫu dò phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) 1,42 x 102 1,42 x 103 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu Ct IC Ct mẫu Ct IC Ct mẫu Lần 27,63 28,44 24,69 25,1 21,67 21,79 Lần 27,28 28,02 25,05 24,98 21,74 21,67 Lần 27,75 28,06 24,43 25,23 21,11 21,97 TB 27,55 28,17 24,72 25,10 21,51 21,81 Bảng 2.3: Kết NT2 tối ưu mồi, mẫu dò phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 1,42 x 102 1,42 x 103 1,42 x 104 Ct IC 28,51 27,74 28,13 Ct mẫu 27,19 27,05 27,47 Ct IC 24,53 25,01 24,55 Ct mẫu 24,11 23,65 23,59 Ct IC 21,21 21,77 21,49 Ct mẫu 20,57 20,83 20,35 28,13 27,24 24,70 23,78 21,49 20,58 Bảng 2.4: Kết NT3 tối ưu mồi, mẫu dò phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 2.3 1,42 x 102 Ct IC Ct mẫu 27,84 26,99 27,4 26,85 27,13 26,81 27,46 26,88 1,42 x 103 Ct IC Ct mẫu 24,83 23,71 24,02 23,55 23,93 23,6 24,26 23,62 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu 20,25 20,44 20,76 20,21 20,5 20,34 20,50 20,33 Kết tối ƣu nồng độ hỗn hợp phản ứng duplex với blaOXA-51 IC 75 Phụ lục Bảng 2.5: Kết NT1 tối ưu nồng độ hỗn hợp phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 1,42 x 102 Ct IC Ct mẫu 29,06 28,33 27,95 28,40 28,99 28,66 28,67 28,46 1,42 x 103 Ct IC Ct mẫu 25,64 24,55 25,17 25,29 25,24 25,24 25,35 25,03 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu 21,82 21,82 20,56 21,67 21,85 21,96 21,41 21,82 Bảng 2.6: Kết NT2 tối ưu nồng độ hỗn hợp phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 1,42 x 102 Ct IC Ct mẫu 28,81 27,62 27,66 27,94 28,69 27,81 28,39 27,79 1,42 x 103 Ct IC Ct mẫu 25,09 24,3 25,56 24,54 24,58 24,11 25,08 24,32 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu 22,02 21,01 21,36 21,46 21,88 20,94 21,75 21,14 Bảng 2.7: Kết NT3 tối ưu nồng độ hỗn hợp phản ứng duplex với blaOXA-51 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 2.4 1,42 x 102 Ct IC Ct mẫu 28,53 27,63 27,24 26,98 27,87 27,71 27,88 27,44 1,42 x 103 Ct IC Ct mẫu 24,74 24,09 24,65 24,25 24,22 23,79 24,54 24,04 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu 21,34 20,86 20,97 20,43 21,12 20,71 21,14 20,67 Kết thử nghiệm hiệu phản ứng duplex với blaOXA-23 IC Bảng 2.8: Kết thử nghiệm hiệu phản ứng duplex với blaOXA-23 IC Nồng độ DNA (bản sao/µ) Lần Lần Lần TB 1,42 x 102 Ct IC Ct mẫu 29,53 29,09 29,66 28,93 29,01 28,28 29,40 28,77 1,42 x 103 Ct IC Ct mẫu 26,29 25,67 26,28 25,6 25,56 24,94 26,04 25,40 76 1,42 x 104 Ct IC Ct mẫu 22,9 22,45 23,02 22,29 22,37 21,63 22,76 22,12 Phụ lục PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ CHỨNG MINH HIỆU QUẢ PHẢN ỨNG DUPLEX REAL-TIME RT-PCR 3.1 Kết chứng minh hiệu phản ứng real-time RT-PCR với blaOXA51 IC Bảng 3.1: Kết chứng minh hiệu phản ứng real-time RT-PCR với blaOXA51 IC FAM Nồng độ cDNA (ng/µl) 3.2 HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB 72,81 36,89 36,47 36,68 36,68 22,01 22,35 22,63 22,33 145,63 34,23 34,31 34,15 34,23 19,89 20,43 20,16 20,16 291,25 32,89 32,77 33,01 32,89 19,95 19,99 20,03 19,99 582,50 32,17 32,11 32,19 32,15 18,77 18,38 18,38 18,51 2330,00 29,63 29,94 29,78 29,78 16,39 16,06 15,95 16,13 Kết chứng minh hiệu phản ứng real-time RT-PCR với blaOXA- 23 IC Bảng 3.2: Kết chứng minh hiệu phản ứng real-time RT-PCR với blaOXA51 IC Nồng độ cDNA (ng/µl) FAM HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB 128,91 30,01 30,11 30,45 30,19 27,27 27,91 27,27 27,48 257,81 28,35 28,75 28,35 28,48 25,86 26,05 25,51 25,81 515,63 27,56 27,70 27,74 27,67 24,58 24,63 25,22 24,81 1031,25 27,08 27,12 27,03 27,08 24,19 24,36 24,15 24,23 4125,00 24,70 25,01 24,99 24,90 22,25 22,12 22,01 22,13 77 Phụ lục PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ TỐI ƢU QUI TRÌNH CẢM ỨNG BIỂU HIỆN 4.1 Kết tối ƣu hàm lƣợng enzyme DNase xử lý Bảng 4.1: Kết tối ưu hàm lượng enzyme DNase xử lý Hàm lƣợng enzyme (µl/pứ) Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB 24,25 24,71 24,87 24,61 24,89 25,03 24,94 24,95 29,18 29,29 29,13 29,2 30,15 30,4 30,44 30,33 33,12 32,88 32,96 32,99 33,21 33,12 33,21 33,21 - - - - - - - - 4.2 FAM HEX Kết khảo sát thời gian cảm ứng Bảng 4.2: Kết khảo sát thời gian cảm ứng 0.5Mc không cảm ứng FAM HEX oxacillin µg/ml 1.0Mc không cảm ứng 1.5Mc oxacillin µg/ml không cảm ứng 2.0Mc oxacillin µg/ml khơng cảm ứng oxacillin µg/ml Lần - 35,57 35,94 34,48 35,30 35,76 34,36 35,71 Lần - 35,88 36,00 34,74 35,73 35,33 34,94 35,74 Lần - 35,46 35,84 34,74 35,15 35,88 34,57 36,08 TB - 35,64 35,93 34,65 35,39 35,66 34,62 35,84 Lần 19,03 20,22 22,12 20,08 20,39 20,94 21,06 23,92 Lần 19,23 20,22 22,45 20,26 20,35 21,89 21,10 23,43 Lần 19,28 20,18 22,34 20,87 20,65 21,12 21,26 23,86 TB 19,18 20,21 22,30 20,40 20,46 21,32 21,14 23,74 78 Phụ lục 4.3 Kết khảo sát nồng độ kháng sinh Oxacillin cảm ứng Bảng 4.3: Kết khảo sát khảo sát nồng độ kháng sinh Oxacillin cảm ứng Cảm ứng Oxacillin Khơng cảm ứng 0,5µg/ml FAM HEX 4.4 1µg/ml 2µg/ml 4µg/ml 8µg/ml 16µg/ml Lần 35,64 34,92 34,05 33,79 35,22 34,08 35,55 Lần 34,36 34,08 33,88 34,55 35,19 34,53 34,93 Lần 35,90 34,20 33,56 34,99 35,11 34,53 33,92 TB 35,30 34,40 33,83 34,44 35,17 34,38 34,80 Lần 25,47 26,20 26,55 26,56 26,24 25,14 25,29 Lần 24,89 26,13 26,67 26,21 26,65 25,52 25,19 Lần 25,07 26,01 26,84 26,85 26,49 25,26 24,84 TB 25,14 26,11 26,69 26,54 26,46 25,31 25,11 Kết khảo sát nồng độ kháng sinh Penicillin G cảm ứng Bảng 4.4: Kết khảo sát nồng độ kháng sinh Penicillin G cảm ứng Cảm ứng Penicillin Khơng cảm ứng 0,5µg/ml Lần Lần FAM Lần TB Lần Lần HEX Lần TB 35,64 34,36 35,90 35,30 25,47 24,89 25,07 25,14 36,80 36,25 36,77 36,61 29,25 29,63 29,78 29,55 1µg/ml 36,52 36,00 36,52 36,35 26,13 26,75 26,30 26,39 79 2µg/ml 34,98 35,27 36,40 35,55 26,82 27,06 26,61 26,83 4µg/ml 33,43 33,01 33,30 33,25 25,83 26,65 26,49 26,32 8µg/ml 34,00 34,48 34,68 34,39 25,17 25,92 25,93 25,67 16µg/ml 35,24 35,00 35,23 35,16 26,53 27,12 26,52 26,72 Phụ lục PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ KHẢO SÁT TRÊN CHỦNG LÂM SÀNG 5.1 Kết khảo sát gen blaOXA-51 chủng mang gen blaOXA-51 Bảng 5.1: Kết khảo sát gen blaOXA-51 chủng mang gen blaOXA-51 Mẫu FAM HEX không c/ứng Peni G Mero không c/ứng 33,03 32,49 32,46 32,66 23,42 23,64 22,94 23,33 34,00 34,36 34,45 34,27 24,13 24,33 24,39 24,28 32,02 32,56 32,29 32,29 22,00 22,04 21,82 21,95 36,07 35,10 35,43 35,53 25,04 24,21 24,59 24,61 Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB Mẫu FAM HEX Peni G 34,09 34,37 35,44 34,63 23,28 23,21 23,05 23,18 Mero không c/ứng Peni G 33,29 34,08 33,04 33,47 21,21 21,58 20,84 21,21 36,79 36,20 36,21 36,40 25,58 25,52 25,78 25,63 34,17 33,28 33,35 33,60 22,36 22,42 22,44 22,41 Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB Mero 34,43 34,49 33,57 34,16 22,23 22,16 22,29 22,23 không c/ứng Peni G Mero không c/ứng 33,33 33,96 34,43 33,91 23,57 23,87 23,37 23,60 31,35 32,15 31,61 31,70 20,82 21,40 20,74 20,99 33,00 32,91 32,55 32,82 21,51 21,45 21,94 21,63 35,39 35,21 34,15 34,92 23,50 22,86 23,40 23,25 Peni G 36,00 36,01 36,28 36,10 23,64 24,00 24,00 23,88 Mero 36,70 36,70 36,70 36,70 24,16 24,00 24,15 24,10 5.2 Kết khảo sát gen blaOXA-23 chủng mang gen blaOXA-23,51 Bảng 5.2: Kết khảo sát gen blaOXA-23 chủng mang gen blaOXA-23,51 Mẫu không c/ứng FAM HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB 24,18 24,32 24,19 24,23 17,38 17,47 17,68 17,51 Peni G 26,27 25,85 25,33 25,82 20,64 20,33 20,64 20,54 Mero không c/ứng 27,37 27,27 27,32 27,32 22,85 22,48 22,00 22,44 24,48 24,58 24,24 24,43 18,87 18,87 18,84 18,86 80 Peni G 24,15 24,18 24,23 24,19 19,63 19,78 19,93 19,78 Mero 25,29 25,15 24,30 24,91 21,14 21,19 21,17 không c/ứng Peni G 26,39 27,00 26,13 26,51 22,29 22,09 21,98 22,12 21,91 21,68 21,00 21,53 17,67 17,29 17,69 17,55 Mero 25,74 25,72 24,95 25,47 21,38 21,66 21,36 21,47 Phụ lục Mẫu FAM HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB không c/ứng 22,02 21,25 21,80 21,69 17,42 16,92 17,14 17,16 Peni G 22,30 22,73 22,53 22,52 18,04 18,53 18,54 18,37 10 không c/ứng Peni G 25,12 25,27 24,06 25,78 25,00 24,75 24,73 25,27 20,13 20,31 18,96 20,69 19,35 19,50 19,48 20,17 Mero 21,41 21,00 21,80 21,40 17,59 18,10 17,80 17,83 Mero 23,19 23,18 23,20 23,19 17,92 18,28 18,55 18,25 5.3 Kết khảo sát gen blaOXA-51 chủng mang gen blaOXA-23,51 Bảng 5.3: Kết khảo sát gen blaOXA-51 chủng mang gen blaOXA-23,51 Mẫu không c/ứng FAM HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB 34,00 34,01 34,09 34,03 21,43 21,81 21,48 21,57 Peni G 32,34 32,67 33,43 32,81 22,14 21,73 22,54 22,14 Mero không c/ứng 34,91 34,71 34,71 34,78 24,53 24,10 24,10 24,24 32,51 33,08 33,13 32,91 20,36 20,73 20,89 20,66 Mẫu FAM HEX Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB không c/ứng 32,07 32,26 32,30 32,21 20,60 20,64 20,50 20,58 Peni G 32,52 32,80 32,40 32,57 21,62 21,76 21,56 21,65 81 Mero 30,77 30,83 31,00 30,87 20,27 20,30 20,23 20,27 Peni G 32,64 33,03 32,64 32,77 21,58 21,74 21,75 21,69 Mero không c/ứng Peni G Mero 31,39 32,22 31,39 31,67 21,12 21,01 21,64 21,26 33,00 33,00 32,87 32,96 21,45 21,68 21,97 21,70 33,15 33,31 33,85 33,44 21,71 21,38 21,00 21,36 10 không c/ứng Peni G 32,36 32,33 32,14 32,31 32,69 32,33 32,40 32,32 21,28 21,08 20,65 21,09 21,22 21,29 21,05 21,15 33,51 33,44 33,44 33,46 21,75 21,61 21,94 21,77 Mero 34,32 34,75 34,21 34,43 23,19 23,22 23,52 23,31 Phụ lục PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ BLAST CÁC ĐOẠN GIẢI TRÌNH TỰ GEN blaOXA TRÊN NCBI 6.1 Kết BLAST đoạn gen blaOXA-23 NCBI Hình 6.1: Kết BLAST đoạn gen blaOXA-23 NCBI 6.2 Kết BLAST đoạn gen blaOXA-51 NCBI Hình 6.2: Kết BLAST đoạn gen blaOXA-51 NCBI 82 Phụ lục 6.3 Kết BLAST đoạn gen chứng nội NCBI Hình 6.3: Kết BLAST đoạn gen chứng nội NCBI 83 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN THỊ MINH TÂM Ngày, tháng, năm sinh: 23/12/1988 Nơi sinh: Quảng Nam Địa liên lạc: 166/18 Lê Lợi, Phƣờng 3, Qn Gị Vấp, Tp HCM Q TRÌNH ĐÀO TẠO 2006 – 2011: Theo học trƣờng Đại học Bách Khoa Tp HCM, chuyên ngành Công nghệ sinh học 2012 – 2014: Theo học trƣờng Đại học Bách Khoa Tp HCM, chƣơng trình cao học, chun ngành Cơng nghệ sinh học Q TRÌNH CƠNG TÁC 2011 – nay: Công tác Công ty TNHH CNSH Khoa Thƣơng ... số (Mẫu) Tỷ lệ (%) bla OXA- 23 3,1 bla OXA- 51 9,2 bla OXA- 58 6,2 bla OXA- 23 blaOXA-51 40 61,5 bla OXA- 23 blaOXA-58 1,5 bla OXA- 51 blaOXA58 1,5 bla OXA- 23, blaOXA-51 blaOXA-58 3,1 13,8 Tỷ lệ (%)... mồi blaOXA F/R mẫu dò blaOXA thay tương ứng: mồi blaOXA-23 F/R/mẫu dò blaOXA-23; mồi blaOXA-24 F/R /mẫu dò blaOXA-24; mồi bla OXA- 51 F/R/mẫu dò blaOXA-51; mồi blaOXA-58 F/R/mẫu dị blaOXA-58 Chƣơng... kháng A baumannii Oxacillinase có khả thủy giải carbepenem nhân tố thƣờng đƣợc phát chủng A baumannii kháng carbapenem [28] 2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HIỆN NAY VỀ Acinetobacter baumannii Sự gia tăng