Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập tại rừng quốc gia hoàng liên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRỊNH THÀNH TRUNG Hà Nội - Năm 2013 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.1.1 Tổng quan Bacillus amyloliquefaciens 1.1.2 Lịch sử phát 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Đặc điểm sinh học phân bố tự nhiên 1.2 ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.2.1 Sản xuất enzyme công nghiệp 1.2.2 Sản xuất chất kháng sinh 1.2.3 Sản xuất phân bón vi sinh 1.2.4 Sản xuất chế phẩm probiotics 1.3 MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 1.3.1 Xylanase 1.3.2 α-amylase 10 1.3.3 Protease 13 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG 15 2.2 NGUYÊN LIỆU 15 2.2.1 Chủng vi sinh vật 15 2.2.2 Môi trƣờng 15 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Nuôi cấy giống khởi động 16 2.3.2 Phân tích trình tự đa gen 16 2.3.3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn nghiên cứu 18 2.3.4 Lựa chọn môi trƣờng thời gian ni cấy thích hợp cho khả sinh enzyme ngoại bào cao 20 2.3.5 Phƣơng pháp xác định protein 21 2.3.6 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 21 2.3.7 Tách chiết tinh enzyme ngoại bào 25 2.3.8 Xác định đặc tính enzyme ngoại bào 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 28 3.1.1 Tuyển chọn chủng 28 3.1.2 Cây phân loại dựa trình tự 16S rDNA 28 3.1.3 Cây phân loại dựa trình tự đa gen 29 3.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 30 3.2.1 Đặc điểm hình thái 30 3.2.2 Đặc điểm sinh học chủng SP 1901 31 3.3 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO 38 3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng thời gian ni cấy thích hợp 38 3.3.2 Tinh enzyme ngoại bào phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 41 3.3.3 Tinh enzyme phƣơng pháp sắc ký lọc gel 43 3.3.4 Xác định trọng lƣợng phân tử xylanase điện di SDS-PAGE 44 3.3.5 Hiệu tinh xylanase từ chủng SP 1901 45 3.4 ĐẶC TÍNH ENZYME 46 3.4.1 Nhiệt độ tối ƣu 46 3.4.2 Khả bền nhiệt 47 3.4.3 pH tối ƣu 48 3.4.4 Khả bền axít 49 3.4.5 Khả bền ion kim loại hóa chất 50 3.4.6 Sắc ký lớp mỏng 51 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khả sinh trƣởng chủng SP 1901 nhiệt độ khác 33 Bảng 3.2 Khả đồng hoá loại đƣờng………………………………… 34 Bảng 3.3 Khả lên men loại đƣờng………………………………… 35 Bảng 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào theo phƣơng pháp sử dụng kit API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5 Tỷ lệ hoạt độ xylanase (U/ml) nồng độ protein (mg/ml) chủng SP 1901………………………………….……………………………… 40 Bảng 3.6 Hoạt độ xylanase sau bƣớc tinh sạch……………………… 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học xylan vị trí cơng hệ thống enzyme xylanolytic………………………………….………………………… Hình 1.2 Cấu trúc hóa học amylose amylopectin…………………… 11 Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide chuỗi polypeptide……… 13 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang BSA……………………………… 21 Hình 2.2 Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang xylose…………………………… 22 Hình 2.3 Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang glucose…………………………… 23 Hình 2.4 Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang L-tyrosine………………………… 24 Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập rừng Quốc gia Hồng Liên lồi thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis dựa phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….………… 28 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại lồi vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis………………………………….…………………………………… Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào nhuộm 30 gram (b) soi (c) ………………………………….…………………… Hình 3.4 pH sinh trƣởng tối ƣu (a) Khả chịu muối NaCl (b) Khả chịu dịch dày (c) Khả chịu muối mật (d) …………………………… Hình 3.5 Khả sinh chất kích thích sinh trƣởng IAA chủng SP 1901 sau 24, 48 72 giờ………………………………….……………………… 31 31 32 Hình 3.6 Khả sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a) Ảnh hƣởng chủng SP 1901 lên khả sinh trƣởng ngơ sau 10 ngày trồng (b) ………………………………….………………………… Hình 3.7 Vòng phân giải chất enzyme ngoại bào Amylase (a) 32 Cellulase (b) Phytase (c) Protease (d) Xylanase (e) ……………………… Hình 3.8 Phản ứng thử nghiệm khả sinh enzyme thử API ZYM………………………………….……………………………………… Hình 3.9 Khả sinh kháng sinh chủng SP 1901 theo phƣơng pháp khuếch tán thạch Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E coli (a) Vi khuẩn 36 Shigella sp (b) Vi khuẩn S aureus (c) ……………………………………… Hình 3.10 Khả sinh trƣởng môi trƣờng khác (a, b) hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) chủng SP 1901 nuôi cấy 10 loại môi trƣờng khác nhau………………………………….……………… 38 37 39 Hình 3.11 Hoạt độ xylanase (U/ml) nồng độ protein (mg/ml) ni cấy mơi trƣờng có bổ sung CMC glucose môi trƣờng NA dịch thể khác nhau………………………………….………………………… 39 Hình 3.12 Hoạt tính amylase protease chủng SP 1901 mơi trƣờng có bổ sung CMC glucose môi trƣờng NA dịch thể…………………… 40 Hình 3.13 Hoạt độ xylanase nồng độ protein phân đoạn sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… Hình 3.14 Hoạt độ amylase nồng độ protein phân đoạn sắc ký 41 trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….………… Hình 3.15 Hoạt độ protease nồng độ protein phân đoạn sắc ký 42 trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… 42 Hình 3.16 Hoạt độ xylanase phân đoạn sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17 Hoạt độ amylase phân đoạn sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18 Hoạt độ protease phân đoạn sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19 Điện di SDS-PAGE mẫu xyl 29 xyl 36…………………… 45 Hình 3.20 Nhiệt độ hoạt động tối ƣu xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901…………………………………………………………… Hình 3.21 Khả bền nhiệt xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… Hình 3.22 pH hoạt động tối ƣu xyl 29, xyl 36, amylase protease từ 46 chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23 Khả bền axít xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… Hình 3.24 Khả bền ion kim loại hóa chất xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901………………………………………………… Hình 3.25 Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ chất xylan xylanase chủng SP 1901…………………………………… 47 49 50 52 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS Dinitrosalicylic IAA Indole-3-acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào đời sống sản xuất trở nên phổ biến Con ngƣời khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật nhiều lĩnh vực khác Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà ngƣời tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm nhƣ vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh cho ngƣời Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đƣợc sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại làm phân bón vi sinh Trong cơng nghiệp thực phẩm, ngƣời ứng dụng vi sinh vật để sản xuất loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic loại thực phẩm lên men truyền thống Ngồi ra, vi sinh vật cịn đƣợc ứng dụng vào xử lý rác thải hữu nƣớc thải sản xuất cơng nghiệp Với khả chuyển hóa mạnh mẽ sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng vai trị to lớn hệ sinh thái tự nhiên hoạt động cải thiện chất lƣợng sống ngƣời Bacillus vi sinh vật đƣợc phát mơ tả giai đoạn đầu tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học cuối kỷ 19 Đây chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que có khả sinh nội bào tử Chúng phân bố rộng rãi hệ sinh thái tự nhiên, từ cạn đến dƣới nƣớc, từ nƣớc đến nƣớc mặn từ ven bờ đến đáy Đại Dƣơng Ngoài loài vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời nhƣ B anthracis B cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt nhóm B subtilis có tính ứng dụng cao nhiều lĩnh vực nhƣ y dƣợc học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm xử lý môi trƣờng Do đó, lồi thuộc chi Bacillus ngày trở thành vi sinh vật quan trọng hàng đầu mặt ứng dụng Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức chi Bacillus nói chung ứng dụng lồi thuộc nhóm B subtilis nói riêng, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập rừng Quốc gia Hoàng Liên” với mục tiêu sau: (i) Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis phân lập rừng Quốc gia Hồng Liên (ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại xác chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài dƣới lồi (iii) Tìm hiểu đặc tính sinh học quý chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn (iv) Tách chiết, tinh đánh giá sơ đặc tính enzyme ngoại chủng vi khuẩn nghiên cứu Trong số ion kim loại nghiên cứu, ion Na+, K+, Ca2+, Fe2+, Zn2+ ßmercapto tăng cƣờng hoạt độ loại enzyme xyl 29 xyl 36, Ca2+ tăng cƣờng mạnh (hoạt độ xyl 29 xyl 36 tăng lần lƣợt 151,91% 154,5% nồng độ ion Ca2+ hỗn hợp phản ứng 10 mM) Ion Cu2+ ức chế mạnh hoạt động xylanase (hoạt độ xyl 29 xyl 36 giảm lần lƣợng 35,66% 29,55% nồng độ Cu2+ hỗn hợp phản ứng đạt 10 mM) Ion Ca2+ tăng cƣờng hoạt động amylase mạnh nồng độ mM giảm dần nồng độ cao Ngoài cịn ion Na+, K+ Mg2+ khơng làm ảnh hƣởng nhiều đến hoạt động enzyme Các ion Zn2+ Cu2+ làm giảm mạnh hoạt động enzyme, nồng độ ion hỗn hợp phản ứng đạt 10 mM hoạt tính enzyme amylase hầu nhƣ khơng cịn Các ion Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Fe2+ ß-mercapto tăng cƣờng hoạt động enzyme protease, ß-mercapto tăng cƣờng mạnh (hoạt độ protease tăng lên 210% nồng độ ß-mercapto hỗn hợp phản ứng đạt 10 mM) Ion Fe3+ ức chế mạnh hoạt động protease (hoạt độ protease giảm 9% nồng độ Fe3+ hỗn hợp phản ứng 10 mM) 3.4.6 Sắc ký lớp mỏng Dựa vào kết hình 3.25., sau sản phẩm thủy phân chủ yếu xylotetraose, sau 24 sản phẩm thủy phân chủ yếu xylobiose xylotetraose, cịn sau 48 ngồi sản phẩm thủy phân chủ yếu xylobiose xylotetraose, ngồi cịn có hàm lƣợng nhỏ xylose Điều chứng tỏ enzyme xylanase chủng SP 1901 thủy phân chất thành sản phẩm chủ yếu xylooligosaccharides Bên cạnh đó, xuất xylose sản phẩm thủy phân chứng tỏ hệ enzyme xylanolytic chủng SP 1901 tồn dạng exoglycosidase endoglycosidase 51