Khảo sát tác động chống đông máu của các phân đoạn nọc bò cạp : Heterometrus Laoticus : Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học chuyên ngành Quản lý và cung ứng thuốc

Năm 1974, nọc thô của loài Leiurus quinquestriatus đã được chứng minh có tác dụng chống đông máu ở động vật có vú và các yếu tố chống đông trong các PĐ tinh khiết của nọc loài Palam[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN HOÀNG MỸ AN

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP

Heterometrus laoticus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

TRANG PHỤ BÌA

NGUYỄN HOÀNG MỸ AN

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP

Heterometrus laoticus

Chuyên ngành: Quản lý cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS Hoàng Thị Phương Liên

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan:

- Đây đề tài nghiên cứu

- Số liệu đề tài xác trung thực - Tôi xin chịu trách nhiệm đề tài nghiên cứu

Chữ ký sinh viên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Nguyễn Tất Thành, khoa Dược môn Dược lý tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn TSKH Hồng Ngọc Anh đặt móng cho nghiên cứu lồi Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus), để từ em có sở thực

đề tài

Em xin đặc biệt cảm ơn ThS.DS Hoàng Thị Phương Liên - môn Dược lý truyền đạt kiến thức cần thiết, kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học tận tình dìu dắt, hướng dẫn em thực khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên môn Dược lý tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ em suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Hội đồng phản biện đưa nhận xét góp ý quý giá để báo cáo khóa luận em hồn thiện

Cuối cùng, cảm ơn bạn nhóm monitor mơn Dược lý hỗ trợ, giúp đỡ hồn thành khóa luận

i MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP

1.1.1 Giới thiệu bò cạp

1.1.2 Độc tính nọc bọ cạp

1.1.3 Tác dụng dược lý nọc bọ cạp

1.1.4 Cơ chế tác động nọc bọ cạp

1.2 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus) 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU 12

1.3.1 Tiểu cầu 12

1.3.2 Cầm máu 15

1.3.3 Rối loạn đông máu 19

1.3.4 Những chất chống đông máu 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN LIỆU 23

2.1.1 Nọc Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 23

2.1.2 Động vật thử nghiệm 23

2.1.3 Dụng cụ 23

2.1.4 Hóa chất 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP 24

2.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 25

ii

3.1.1 Tác động chất khảo sát lên q trình đơng máu 25

3.1.2 Tác động chất khảo sát lên trình chảy máu 26

3.2 BÀN LUẬN 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 31

4.1 KẾT LUẬN 31

4.2 ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu,

chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ADP Adenosine diphosphate BKCa Big conductance potassium

channel

Kênh Kali hoạt hóa Calci có độ dẫn lớn

BmK Buthus martensi Karsch DIC Disseminated intravascular

coagulation

Hội chứng đông máu rải rác/ lan tỏa

DS Dược sĩ

hNav Human voltage-gated sodium

channel

Kênh Natri cảm ứng điện người

IKCa Intermediate conductance

potassium channel

Kênh Kali hoạt hóa Calci có độ dẫn trung bình

KCa Calcium-activated potassium

channel

Kênh Kali hoạt hóa Calci

KTx Toxin tác động lên kênh Kali

Kv Voltage-gated potassium

channel

Kênh Kali cảm ứng điện

Nav Voltage-gated sodium channel Kênh Natri cảm ứng điện

PAF Platelet activator factor Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

PĐ Phân đoạn

PĐTC Phân đoạn thứ cấp

iv

PRP Platelet rich plasma Huyết tương giàu tiểu cầu rNav Human voltage-gated sodium

channel

Kênh Natri cảm ứng điện chuột

RyR Ryanodine receptor Thụ thể Ryanodin SKCa Small conductance potassium

channel

Kênh Kali hoạt hóa Calci có độ dẫn nhỏ

ThS Thạc sĩ

TSKH./ D.Sc

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bọ cạp hóa thạch

Hình 1.2 Cấu tạo thể bò cạp Androctonus crassicauda

Hình 1.3 Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 10

Hình 1.4 Phần (metasoma) Heterometrus laoticus 11

Hình 1.5 Các giai đoạn trình sinh tiểu cầu 13

Hình 1.6 Các tế bào máu 13

Hình 1.7 Hình dạng tiểu cầu 13

Hình 1.8 Cấu trúc tiểu cầu 14

Hình 1.9 Quá trình đơng máu 17

Hình 1.10 Các giai đoạn q trình đơng máu 17

Hình 1.11 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu, tạo cục máu đơng 18

Hình 1.12 Q trình tan cục máu đơng 19

Hình 3.1 Thời gian đông máu tác động PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48mg/kg 25

vi

DANH MỤC BẢNG

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 - 2018 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐÔNG MÁU

CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỌ CẠP (Heterometrus laoticus)

Nguyễn Hoàng Mỹ An

Hướng dẫn khoa học: ThS Hoàng Thị Phương Liên Đặt vấn đề

Phân đoạn nọc bị cạp Heterometrus laoticus An Giang có tác động chống đông mạnh vượt trội thử nghiệm in vitro Từ phân đoạn 5, phân lập 24 phân đoạn thứ cấp, có phân đoạn 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 Đề tài thực nhằm khảo sát tác động phân đoạn phân đoạn thứ cấp lên thời gian đông – chảy máu

Đối tượng – phương pháp

Nọc bọ cạp: phân đoạn 5, phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 cung cấp TSKH Hoàng Ngọc Anh (Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh)

Động vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss albino Viện Vắc xin sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp

Phương pháp:Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột dung dịch NaCl 0,9% (lô chứng) phân đoạn khảo sát pha NaCl 0,9% với liều 2,48 mg/kg (lơ thử), thể tích tiêm 0,1 ml/10g thể trọng chuột

Thời gian chảy máu: Cắt đoạn chuột (dài mm, đường kính 1,5 mm) từ đầu mút ngồi Nhúng phần cịn lại vào dung dịch NaCl 0.9% 37oC Tính thời gian chảy máu thời điểm 20, 30, 60, 90 120 phút sau tiêm

Thời gian đông máu: Lấy giọt máu (đường kính 6-7 mm) từ vết cắt chuột lên lam kính Tính thời gian đông máu thời điểm 20, 30, 60, 90 120 phút sau tiêm

Kết

Phân đoạn phân đoạn thứ cấp khảo sát cho thấy tác dụng kéo dài thời gian đơng – chảy máu so với nhóm chứng Trong đó, phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.22.3 có tác động mạnh phân đoạn thứ cấp 5.21.1 có tác động yếu

Kết luận

Phân đoạn phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 có tác động chống đông máu liều 2,48 mg/kg

Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2013 – 2018

ANTICOAGULANT ACTIVITY OF FRACTIONS FROM Heterometrus laoticus

SCORPION VENOM Nguyen Hoang My An Supervisor: Hoang Thi Phuong Lien Introduction

The fraction of Heterometrus laoticus venom (from An Giang province, Viet Nam) shows anticoagulant activity in vitro This fraction was separated into 24 sub-fractions and of them (5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3) are clean Therefore, this study was conducted to investigate the anticoagulant activity of fractions 5, 5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3 in vivo

Materials – Methods

Scorpion venom: fraction 5, sub-fractions 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (provided by D.Sc Anh Ngoc Hoang, Institute in Applied Materials Science, Vietnam Academy of Science and Technology, Ho Chi Minh City)

Mice:Swiss albino mice were provided by Institute of Vaccines and Biological Medical- IVAC

Method: Solution of the fractions in 0,9% NaCl were injected into the lateral vein of the mouse tail at a dose of 2,48 mg/kg (injection volume 0,1 ml/10g of body mouse weight) The mice of the control group received only 0,9% NaCl solution

Determination of Bleeding Time: Amputate the mouse tail (about mm long from the outside end, diameter of about 1,5 mm), soak the remaining tail into the 0,9% NaCl solution at 37oC Calculate the bleeding time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection

Determination of Blood Coagulation Time: Take a drop of blood from the amputated tail on the glass (diameter of about 6-7 mm) Calculate the clotting time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection

The results

Fraction and sub-fractions have bleeding time and blood coagulation time longer than control Specifically, sub-fraction 5.5.1, 5.22.3 have stronger effect and sub-fraction 5.21.1 has weaker effect

Conclusion

Fraction and sub-fraction 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 have anticoagulant activity at a dose of 2,48 mg/kg

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bò cạp loài động vật chân đốt, thuộc lớp Arachnida, có mặt Trái đất từ trước người xuất chúng mệnh danh “hóa thạch sống” [27] Từ xa xưa, y học cổ truyền, bò cạp sử dụng vị thuốc chữa kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván, tràng nhạc… [3] Trong y học đại, nọc bò cạp trở thành đối tượng nghiên cứu nhiều nhà khoa học nước Các nghiên cứu giới chứng minh polypeptide nọc bị cạp có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn kháng virus [53], thể tác động giảm đau, kháng viêm, chống động kinh chống đông máu [14, 17, 29-31, 38, 41, 54-56] Ngoài ra, chúng mở tiềm phát triển thuốc điều trị rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50] điều trị ung thư [24]

Heterometrus laoticus gọi bò cạp đen bò cạp rừng loại bò cạp phổ biến miền Nam Việt Nam Những năm qua có nghiên cứu nọc độc lồi bị cạp chứng minh chúng có tác dụng kháng khuẩn [51], giảm đau – kháng viêm [6-10, 33] Từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus An Giang, tách phân đoạn (PĐ) TSKH Hoàng Ngọc Anh đồng chứng minh PĐ 2, có tác dụng chống đơng máu thử nghiệm in vitro [2] Cũng từ PĐ 5, có 24 phân đoạn thứ cấp (PĐTC) phân lập, có PĐTC 5.5.1, 5.21.1 5.22.3

Đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP Heterometrus laoticus” thực nhằm khảo sát hoạt tính chống

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP

1.1.1 Giới thiệu bò cạp

Bị cạp lồi động vật thuộc ngành Arthropoda, phân ngành Chelicerata lớp Arachnida Chúng xem loài chân đốt cổ xưa nguồn gốc hình thái thể Chúng lần đầu xuất Trái đất từ kỷ Silur (416 – 444 triệu năm trước) dạng động vật thủy sinh Trong suốt trình phát triển, hình thể bị cạp thay đổi Vì mà chúng gọi “hóa thạch sống” [27]

Hình 1.1 Bọ cạp hóa thạch

(a) Allopaleopholus caledonicus (b) Protobuthus elegans (c) Gallioscorpio voltzi

(d) Protoischnurus axelrodorum (e) Archaeobuthus estephani

(f) Palaeolychas balticus [27]

Bị cạp tìm thấy khắp nơi Thế giới, trừ Bắc Cực, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, sa mạc bán sa mạc Chúng động vật ăn đêm nhút nhát, thường sống tảng đá, khe nứt, lớp vỏ gốc tối nhà [27]

a b c

3

Đặc điểm hình thái bị cạp

Cơ thể bò cạp chia thành phần: phần đầu-ngực (prosoma) phần bụng (opisthosoma) Tồn thân bị cạp bao phủ lớp vỏ gồm chitin, protein chúng lớn lên cách lột xác [27]

Phần prosoma bảo vệ “cái mai” có hình thang hình chữ nhật Bộ phận mang cặp mắt trung tâm, 2-5 cặp mắt bên có cánh thìa Chúng có cặp chi phụ trước miệng (chân kìm), cặp càng, cặp chân khơng có râu [27] Phần opisthosoma lại chia thành phần nhỏ phần bụng trước (mesosoma) phần (metasoma) Mesosoma có đốt, chứa phổi phận sinh dục Metasoma có đốt hẹp chuyển động linh hoạt Opisthosoma kết thúc phận telson (túi chức nọc độc) ngòi đốt [27]

Hình 1.2 Cấu tạo thể bị cạp Androctonus crassicauda

Chân kìm Càng Mắt Chân

Chân

Chân Đốt bụng trước Chân

4 1.1.2 Độc tính nọc bọ cạp

Bị cạp lồi động vật có độc gây chết người, có 2100 lồi thuộc 190 chi 16-19 họ Trong đó, Buthidae Hemiscorpiidae họ bọ cạp nguy hiểm cho người [27]

Nọc độc bò cạp có khả làm tê liệt phận thể người súc vật Bò cạp châu Phi loài độc nhất, giết chết người nhanh rắn độc Vết đốt gây đau đớn dội, làm nạn nhân vã mồ hôi, tim đập nhanh, co giật mạnh, bị tê liệt dẫn đến tử vong Bò cạp Việt Nam đốt gây sưng đau, nhức nhối phù nề, khơng gây chết người [3]

Độc tính nọc bị cạp ảnh hưởng chủ yếu lên hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa,… [36] - Hệ thần kinh thực vật: nọc độc bị cạp gây kích thích hệ thần kinh thực vật, bao

gồm hệ giao cảm hệ phó giao cảm

 Hệ phó giao cảm (hệ cholinergic): tăng tiết nước bọt, chảy nước mắt, co đồng tử, tăng tiết phế quản, tiêu chảy, nôn mửa, nhịp tim chậm, hạ huyết áp, cương dương,…

 Hệ giao cảm (hệ adrenergic): nhịp tim nhanh, tăng huyết áp, giãn đồng tử, thân nhiệt cao, tăng đường huyết, lo âu, bồn chồn,…

Trong hầu hết trường hợp, phản ứng phó giao cảm thường xảy sớm - Hệ thần kinh cơ: kích thích hệ thần kinh ngoại biên nọc độc dẫn đến hoạt

động thần kinh bất thường rối loạn thị giác, co động kinh,…

- Hệ tim mạch: loạn nhịp tim, ngoại tâm thu thất, đảo ngược sóng T, block nhánh (bundle-branch block), suy tim, mê, suy đa tạng…là tình trạng gặp phải bị bò cạp đốt

5

Ngồi ra, nọc độc lồi cịn ảnh hưởng đến phát triển thai nhi trẻ nhỏ sử dụng cho phụ nữ có thai cho bú Tuy nhiên, cần có nghiên cứu sâu nhằm xác định quan mức độ ảnh hưởng nọc độc lên phát triển trẻ [25]

1.1.3 Tác dụng dược lý nọc bọ cạp

Trong y học cổ truyền, bò cạp sử dụng (tồn yết) sử dụng (yết vĩ) Nọc bò cạp sử dụng rộng rãi Bò cạp có vị mặn, ngọt, cay, tính bình, có độc, vào kinh can, có tác dụng trấn kinh, khu phong Vị thuốc dùng để chữa kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván, tràng nhạc [3] Trong y học tại, nọc bò cạp đối tượng nghiên cứu tiềm có tác dụng dược lý quan trọng

Các peptide nọc độc bò cạp chứng minh có tác dụng kháng khuẩn (trên chủng gram dương gram âm), kháng nấm (Candida albicans, Fusarium culmorum Fusarium oxysporum), kháng virus (virus viêm gan C (HCV), herpes simplex virus type (HSV-1), virus sởi, SARS-CoV, virus cúm H5N1, H1N1,…), kháng kí sinh trùng (Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum) [53]

Lồi Buthus martensi Karsch (bị cạp vàng Trung Quốc) có khả giảm đau chứa toxin BmK IT-AP, BmK dIT-AP3 (hoặc BmK IT2), BmK AngP1, BmK AS BmK AS1 [17, 29-30, 38, 54] BmK AS thể tác động giảm đau ngoại biên lẫn trung ương phản ứng đau giảm rõ rệt theo liều thử nghiệm [38] Hơn nữa, BmK IT2 BmK AS cho thấy tác động kháng viêm [17, 29], chống co giật [55-56] Từ đó, chúng tạo tiềm phát triển thuốc chống động kinh Cơ chế đưa cho tác dụng tác động lên kênh Na+ tế bào thần kinh

các toxin nọc bò cạp [18, 55-56]

6

australis, Buthotus judaicus, toxin Ts3 nọc Tityus serrulatus (bị cạp vàng Brazil) có tác động kích thích giải phóng nitric oxide (NO) khỏi dây thần kinh nonadrenergic noncholinergic (NANC), gây giãn trơn thể hang cấu trúc dương vật, thúc đẩy hình thành priapism Điều có ý nghĩa việc phát triển tác nhân dược lý nhằm điều trị rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50] Nọc bò cạp mở tiềm phát triển thuốc điều trị ung thư Chlorotoxin (một peptide nhỏ tinh chế từ nọc lồi bị cạp Leiurus quinquestriatus) chất độc thần kinh, đóng vai trị chất chẹn kênh Cl- Toxin có tác động ưu tiên

trên loạt khối u ác tính người, điển hình u thần kinh đệm (glioma) lại khơng liên kết với mơ bình thường [40, 43, 47] Trong nghiên cứu khác, peptide tương tự chlorotoxin tinh chế, tái tổ hợp từ bò cạp Buthus martensi rBmK Cta, Bm-12 Bm-12b cho thấy tác động lên kênh Cl-, đặt biệt rBmK Cta gây ức chế tăng trưởng tế bào u thần kinh theo liều tác động lên tế bào hình [26, 29] Ngồi ra, lồi bị cạp Rhopalurus junceus Cuba chứng minh có tác động chọn lọc tế bào ung thư biểu mô [24]

Năm 1974, nọc thơ lồi Leiurus quinquestriatus chứng minh có tác dụng chống đơng máu động vật có vú yếu tố chống đơng PĐ tinh khiết nọc lồi Palamneus gravimanus có tác động ngăn cản hoạt động thrombin [31] Trong nọc loài Tityus discrepans chứa thành phần có hoạt tính ức chế yếu tố X hoạt hóa [14] Nọc độc từ bị cạp Mexico Anuroctonus phaiodactylus báo cáo gây tác động làm chậm thời gian đông máu PRP PPP người [41]

1.1.4 Cơ chế tác động nọc bọ cạp

7

29] Các kênh ion mà toxin nọc bò cạp tác động đến bao gồm: kênh Natri cảm ứng điện (Nav), kênh Kali cảm ứng điện (Kv), kênh Kali hoạt hóa

bởi Calci (KCa), kênh Calci kênh Chloride

Trong tổng hợp “Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level” đăng tờ Neuropharmacology năm 2017 David M Housley đồng [34] cho thấy có:

- 63 peptid tác động lên Nav

- 98 peptide có tác động ức chế Kv, trừ AaTXKb2-64 (Androctonus australis) có tác

động kích thích

- 20 peptide tác động lên KCa Tất ức chế IKCa SKCa, có peptid liên

quan đến BKCa Iberiotoxin (Buthus tamulus) ức chế chọn lọc mạnh lên BKCa,

Maurotoxin (Scorpio maurus palmatus) ức chế chọn lọc mạnh lên IKCa

Tamapin (Mesobuthus tamulus) có tác động mạnh lên SKCa

- Có 16 peptide ảnh hưởng lên kênh Ca2+ có peptide tác động lênh kênh Cl-

Toxin tác động lên kênh Natri cảm ứng điện (Nav)

Peptid nọc bò cạp tác động lên Nav gồm loại toxin: α-toxin β-toxin Các

peptide gọi α-toxin hay β-toxin vị trí gắn kết chúng kênh Na+

α-toxin liên kết với receptor site 3, β-toxin liên kết với receptor site kênh Na+ [27]

α-toxin có lực phụ thuộc điện màng, có tác dụng làm chậm ức chế trình bất hoạt kênh Na+ tế bào thần kinh, tim [20, 29]

Chúng polypeptide gồm chuỗi có 61-76 amino acid nối với cầu nối disulfide, chia thành nhóm [28]:

8

(Buthus occitanus tunetanus) toxin lần xác định thuộc nhóm có độc tính cao với người [28, 44];

(2) Các α-toxin hoạt động mạnh côn trùng LqhαIT (Leiurus quinquestriatus

hebraeus), Lqq3 (Leiurus quinquestriatus quinquestriatus), BotIT1 (Buthus occitanus tunetanus) BjαIT (Hotentota Judaica) có lực cao với tế bào thần kinh côn trùng [28];

(3) Các toxin tương tự α-toxin có hoạt tính động vật có vú trùng Lqh3 Lqh6 (Leiurus quinquestriatus hebraeus), Bom3 Bom4 (Buthus occitanus mardochei) BmK M1 (Mesobuthus martensii Karsch.) [28]

β-toxin gắn với vị trí thụ thể cụ thể có synaptosome độc lập với điện màng có não chuột [15], làm thay đổi q trình hoạt động kênh Na+ [29] Các β-toxin polypeptie có 61 amino acid với cystein nối với qua cầu nối disulfide [29], chia làm nhóm dược lý [27]:

- β-toxin tác động động vật có vú Css4 (Centruroides suffusus suffusus), Cn2 (Centruroides noxious) gắn kết lực cao với synaptosomes não chuột; - β-toxin kích thích chọn lọc với côn trùng AahIT (Androctonus australis),

Bj-xtrIT (Hottentotta judaicus) gây liệt co cứng tác động lặp lặp lại dây thần kinh vận động, làm tăng dòng điện làm chậm lại trình khử hoạt Nav;

- β-toxin ức chế côn trùng LqhIT2 Lqh-dprIT3 (Leiurus quinquestriatus hebraeus), BotIT2 (Buthus occitanus tunetanus) có lực cao với Nav

trùng không gây hại chuột, toxin gây liệt mềm, trái ngược với chứng liệt cứng toxin kích thích;

- β-toxin có lực cao với động vật có vú trùng Ts1 (Tityus serrulatus) Lqhβ1 (Leiurus quinquestriatus hebraeus) Hầu hết β-toxin có tác động thay đổi hoạt hóa rNav1.2 não chuột rNav1.4 xương chế, không ảnh hưởng hNav1.5 tim

Toxin tác động lên kênh Kali (KTx)

Các peptide ức chế kênh K+ phân lập từ nọc độc lồi bị cạp

9

Nhóm KTx bao gồm peptide chuỗi ngắn với 23-43 dư lượng amino acid chuỗi dài với 42-84 dư lượng cấu trúc ổn định 3-4 cầu nối disulfide Các toxin chia thành nhóm: α, β, γ κ dựa vào cấu trúc giống đặc trưng cho kênh K+ riêng biệt [27]

- α-KTx phát sớm nhất, đến có 133 chất chuỗi peptide ngắn (23-43 acid amin), ổn định 3-4 cầu disulfide, có tác động chẹn kênh KCa;

- β-KTx dài α-KTx (47-84 acid amin cầu disulfide), có nguồn gốc từ họ Buthidae, Caraboctonidae Scorpionidae Toxin chứa miền: N-terminal có hoạt tính phân giải độc tố C-terminal chẹn kênh K+;

- γ-KTx có 36-47 amino acid phần lớn có cầu disulfide Hiện có 29 toxin thuốc nhóm này;

- κ-KTx nhóm KTx gồm peptide có 22-28 acid amin cầu disulfide Chúng có nguồn gốc từ họ Scorpionaidae Liochelidae Hiện có 18 κ-KTx liệt kê danh sách UniProt;

Toxin tác động lên kênh Calci

Các peptide biết có hoạt tính receptor ryanodine (RyR) – receptor kênh Calci nhóm ligand-activated channel, tìm thấy nọc lồi bò cạp Buthotus hottentota Ryanotoxin (peptide 11KD Buthotus judaicus) làm tăng phóng thích Ca2+ từ mạng nội tương gây giảm độ dẫn RyR

2 peptid khác Buthotus judaicus BjtX-1 BjtX-2 ảnh hưởng kênh Ca2+

ở màng nội tương vân không ảnh hưởng đến gan tim Toxin BmK-AS BmK-AS1 (từ loài BmK) kích thích gắn kết với ryanodine với RyR vân thỏ IpTxi Iptxa (Pandinus imperator) peptide báo

10

Ngồi ra, kurtoxin (toxin Parabuthus transvaalicus) có lực cao với α1G T-type kênh Ca2+ Toxin có phân biệt kênh Calci T-type α1G

kênh khác gồm α1A, α1B, α1C α1E [19]

Toxin tác động lên kênh Chloride

Nọc độc loài Leiurus quinquestriatus chứng minh có khả chẹn kênh Cl- có độ dẫn điện nhỏ [23] Đó peptid nhỏ có 4070 Da [22]

1.2 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus) Heterometrus thuộc phân họ Scorpioninae, họ Scorpionnidae – 24 họ bò cạp tồn đến ngày Các loài Heterometrus phân bố Ấn Độ, Sri Lanka, Burma, Borneo, Philipine châu Phi Có khoảng 33 lồi Heterometrus tìm thấy chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Đơng Nam Á [27] Lồi Heterometrus laoticus

phân bố chủ yếu Lào, Campuchia, miền Nam Thái Lan miền Nam Việt Nam [21]

Đặc trưng hình thái Heterometrus laoticus

Heterometrus laoticus trưởng thành dài từ 90-125 mm có màu đen, riêng manus (phần thịt chela trước ngón (finger)) telson có màu nâu đỏ Ở hai giới đực cái, số 15-19 xếp thành dạng lược [37]

Hình 1.3 Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)

Chela lồi có tỷ lệ dài rộng – 2,3 có manus nhẵn Lớp giáp phần mesosoma nhẵn khơng có hạt nhỏ Telson có nhiều lơng, thn dài có bọng dài phần ngòi đốt [37]

manus chela

telson

11

Hình 1.4 Phần (metasoma) Heterometrus laoticus

Nọc bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)

Các dấu hiệu lâm sàng gặp phải bị loại bò cạp loài Heterometrus đốt là: sưng – đau cục bộ, tấy đỏ đổi màu, hạ huyết áp, bồn chồn, suy hô hấp, buồn nôn, nôn, đau bụng, khát nước, đau đầu, sốt, run sốc [27]

Ở Việt Nam, nọc bò cạp Heterometrus laoticus của tỉnh An Giang Tây Ninh tiến hành nghiên cứu Nọc Heterometrus laoticus vùng tương đối giống nhau, tách 10 PĐ (bằng phương pháp sắc ký cột Bio-gel P 10 phương pháp điện di) Trong đó, PĐ độc chứa neurotoxin – protein nằm vùng 3-8 kDa Tuy nhiên, nọc bò cạp An Giang, PĐ độc 7, nọc bị cạp Tây Ninh phân đọc độc Như vậy, nọc bò cạp tỉnh khơng giống hồn tồn [1]

Qua mơ hình thử độc tính cấp, nọc độc bị cạp Heterometrus laoticus An Giang có LD50 xác định 190,0 ± 1,7 mg/kg cân nặng chuột qua đường tiêm da

12,0 ± 0,6 mg/kg qua đường tiêm tĩnh mạch Cịn mơ hình độc tính bán trường diễn, nọc bị cạp tiêm hàng ngày da với liều 0,1 mg/ 10g thể trọng/ ngày 30 ngày gây hoại tử da chưa biểu độc tính gan, thận huyết học tháng thử nghiệm Nọc lồi bị cạp thể tác dụng giảm đau – kháng viêm chuột [6-7, 10, 33] Tác dụng có Heterometrus laoticus Tây Ninh (LD50 = 170 ± 0,95 mg/kg qua đường tiêm da) [8-9]

12

K+ HS-1 có tác động chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Klebsiella

pneumoniae Pseudomonas aeruginosa mạnh gấp 300 lần so với nọc thô [51] HelaTx1 thành viên phân họ κ-KTx5 [52] Toxin tác động kênh K+ khác hoạt động mạnh Kv1.1 [33] Hetlaxin (thuộc

nhóm α-toxin) toxin phân lập từ nọc Heterometrus laoticus có lực cao với Kv1.3 [32-33] Heteromtoxin (HmTx) có nucleotide chứa 649 bp (base pair) với cấu trúc protein trưởng thành gồm 131 amino acid dư lượng (tiểu đơn vị lớn gồm 104 amino acid, tiểu đơn vị nhỏ gồm 27 amino acid) [35]

Cũng vài lồi bị cạp khác, Heterometrus laoticus thể hoạt tính chống đơng máu Từ nọc Heterometrus laoticus An Giang, tách PĐ Trong đó, PĐ 2, thể tác động chống đông máu thử nghiệm

in vitro Ở nồng độ mg/ml, PĐ có thời gian đông máu gấp đôi so với mẫu đối chứng xét nghiệm Prothrombin; PĐ gây trình chậm đơng máu xét nghiệm APTT (thời gian đông máu cục bộ) tăng thời gian đông máu cục PĐ có tăng thời gian đơng máu 10 lần so với mẫu đối chứng [2]

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU

1.3.1 Tiểu cầu

Nguồn gốc

Tiểu cầu mảnh tế bào tách từ tế bào lớn, gọi mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) – có nguồn gốc từ tế bào gốc sinh máu vạn tủy xương Một mẫu tiểu cầu sinh 6000 tiểu cầu [11]

13

Hình 1.5 Các giai đoạn trình sinh tiểu cầu

Cấu trúc

Tiểu cầu mảnh hình đa giác, hình đĩa nhỏ (nhỏ số tế bào máu), đường kính từ 2-4 μm khơng có nhân

Hình 1.6 Các tế bào máu Hình 1.7 Hình dạng tiểu cầu

Màng tiểu cầu tích điện âm mạnh, có nhiều chỗ lõm vào bào tương làm tiểu cầu có tính xốp tăng diện tích bề mặt lên nhiều Trên màng tiểu cầu có receptor với collagen, yếu tố von-Willebrand thành mạch fibrinogen Bào tương tiểu cầu có actin, myosin thrombosthenin Các protein giúp tiểu cầu co lại giải phóng chất chứa hạt như:

- Hạt alpha chứa nhiều enzyme protein có tác dụng sửa chữa thành mạch sau tổn thương (yếu tố tăng trưởng)

- Thể đông đặc giàu Ca2+, serotonin, adenosinediphosphat (ADP)

Hồng cầu

Bạch cầu

14

Ngồi ra, tiểu cầu cịn chứa yếu tố von-Willebrand, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (platelet activator factor – PAF) yếu tố ổn định fibrin (XIII) [11]

Hình 1.8 Cấu trúc tiểu cầu

Đặc tính

Khả hấp phụ vận chuyển chất: q trình tiếp xúc, tiểu cầu có khả hấp phụ chất huyết tương tế bào tổ chức khác để tạo thành lớp khí quanh tiểu cầu Nhờ mà chất thiết yếu cho q trình cầm máu đơng màu lưu hành tới nơi cần thực nhiệm vụ [11]

Khả kết dính tiểu cầu: tiểu cầu có khả dàn vào bám dính vào tổ chức nội mạc, collagen,… lực hút tĩnh điện tiểu cầu chất, với tham gia số yếu tố: Ca2+, yếu tố huyết tương, yếu tố von-Willebrand,… [11]

Khả ngưng tập tiểu cầu: tiểu cầu có khả kết dính lẫn tạo thành kết tập tiểu cầu gọi tượng ngưng tập tiểu cầu Nhờ mà tiểu cầu thực chức [11]

Khả thay đổi hình dạng giải phóng tiểu cầu: sau ngưng tập trình thay đổi hình dạng giải phóng tiểu cầu: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, hạt, co lại,… Sau đó, tiểu cầu co rút, giải phóng loạt yếu tố (serotonin, adrenalin, histamine, yếu tố tiểu cầu,…) Quá

Vi ống Glycogen

Ty thể

Hạt lysosoma Hạt α

Hạt đặc

Chất chuyển hóa Hệ thống kênh mở bề

mặt

15

trình xảy có tham gia thrombin, collagen có tiêu tốn lượng tiểu cầu Khả đóng vai trị quan trọng việc hình thành đinh cầm máu mạch máu bị tổn thương [11]

Chức

Bảo vệ thành mạch: tiểu cầu có khả làm non hóa tế bào nội mạc củng cố màng nội mạc qua vai trò yếu tố tăng trưởng tế bào nội mạc nguồn gốc từ tiểu cầu Vì vậy, tiểu cầu giúp củng cố tính bền vững thành mạch [11]

Tham gia vào q trình cầm máu: nhờ có khả bám dính, ngưng tập giải phóng chất [11]

Tham gia vào q trình đơng máu: tiếp xúc với collagen, ngồi q trình dính, ngưng tập,… màng tiểu cầu cịn xảy q trình hoạt hóa chuyển yếu tố IX thành IXhoạt hóa, đồng thời giải phóng yếu tố tiểu cầu, đóng vai trị quan trọng

trong tạo phức hợp (IXhoạt hóa, VIIIhoạt hóa Ca2+) q trình đơng máu [11]

1.3.2 Cầm máu

Cầm máu chấm dứt trình máu tổn thương thành mạch [15], gồm giai đoạn chính:

1 Co mạch chỗ

2 Hình thành nút tiểu cầu Tạo cục máu đông Co cục máu đông Tan cục máu đông

Co mạch chỗ

Co mạch máu chỗ giúp hạn chế lượng máu thoát ngồi Đồng thời làm chậm tốc độ dịng máu, tạo điều kiện hình thành nút tiểu cầu cục máu đông [11]

16

của điện tế dọc thành mạch Ngồi cịn có tham gia serotonin thromboxane A2 tiểu cầu phóng thích [11]

Q trình xảy vài phút đến vài nhằm tạo điều kiện cho tiểu cầu kết dính kết tập nơi tổn thương [11]

Tạo nút tiểu cầu

Khi thành mạch bị tổn thương, lớp nội mô bị rách làm lộ lớp collagen tích điện dương (+) Các tiểu cầu mang điện âm (-) nhanh chóng di chuyển đến nơi tổn thương gắn vào màng nội mô nhờ lực hút tĩnh điện, yếu tố von-Willebrand receptor Ngay gắn vào thành mạch, tiểu cầu hoạt hóa phóng thích yếu tố cần thiết: chất kích thích kết tập tiểu cầu (ADP, thromboxane A2) chất chống kết tập tiểu cầu (prostaglandin) Song song đó, tiểu cầu liên kết với nhờ receptor GPIIb/IIIa cầu nối fibrinogen [5, 11]

Quá trình tạo nút tiểu cầu bịt kín vết thương, giúp cầm máu tạm thời [5, 11]

Tạo cục máu đông (cơ chế đông máu)

Đông máu trình biến máu từ dạng lỏng sang dạng sol-gel (huyết khối) Huyết khối gồm mạng lưới fibrin bao lấy tế bào máu, làm chặt thêm nút tiểu cầu, bịt kín vết thương [5]

Q trình đơng máu loạt phản ứng hóa học nối tiếp yếu tố đông máu huyết tương, mô tổn thương tiểu cầu [11]

Đa phần yếu tố tiền chất trạng thái bất hoạt Khi hoạt hóa, chúng trở thành enzyme có hoạt tính tiếp tục hoạt hóa yếu tố bất hoạt [11]

17

Hình 1.9 Q trình đơng máu

Hình 1.10 Các giai đoạn q trình đơng máu

CON ĐƯỜNG NỘI SINH Bề mặt bị tổn thương

Kininogen Kallikrein

XII XIIa

XI XIa IX IXa

X Xa

VIIIa

Prothrombin (II)

Thrombin (IIa)

Va

Fibrinogen (I)

Fibrin (Ia)

XIIIa

X

Yếu tố mô

VII

Yếu tố mô

VIIa

Tổn thương

Tổn thương CON ĐƯỜNG NGOẠI SINH

18

Hình 1.11 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu, tạo cục máu đông

Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu huyết tương [5]

Yếu tố Tên khác Vị trí tác động

I II

Fibrinogen Prothrombin

Heparin (IIa)

Warfarin (ức chế tổng hợp)

III Thromboplastin mô

IV Calci

V Proaccelerin

VII Proconvertin Warfarin (ức chế tổng hợp)

VIII Globulin chống bệnh ưa chảy máu (antihemopphilic globulin = AHG) IX Yếu tố Christmas (= thromboplastin

huyết tương)

Warfarin (ức chế tổng hợp)

X Yếu tố Stuart – Prower Heparin (Xa)

Warfarin (ức chế tổng hợp) XI Plasma thromboplastin antecedent

(PTA)

XII Yếu tố Hageman

XIII Yếu tố ổn định fibrin Protein

và S

19

Co cục máu đông tan cục máu đông

Co cục máu đông: sau máu đông khoảng 1-2 giờ, cục máu đông co lại giải phóng huyết (huyết tương khơng có yếu tố đơng máu) Q trình có tham gia chất thrombosthenin, actin, myosin ion Ca2+ Quá trình giúp cho mép vết thương khép lại gần nhau, tạo điều kiện cho hóa sẹo [11]

Tan cục máu đơng: tượng cục máu đông tan tác động phân hủy fibrin plasmin Plasmin hoạt hóa từ plasminogen plasminogen hoạt hóa vài yếu tố: yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ, thrombin, yếu tố XIIhoạt hóa,

các enzyme lysosome từ mơ tổn thương, urokinase nước tiểu, độc tố streptokinase từ vi khuẩn [11]

Hình 1.12 Quá trình tan cục máu đơng

Q trình tan cục máu đơng chế chống đơng máu thể xuất cục máu đông để ngăn ngừa tắc mạch tạo điều kiện cho trình liền sẹo [11]

1.3.3 Rối loạn đơng máu

Rối loạn đơng máu phân thành dạng: - Tình trạng tăng đơng (hypercoagulability status) - Tình trạng giảm đơng (hypocoagulability status)

Plasminogen

Plasmin

Kinase Urokinase Streptokiase

Fibrin Fibrin Degradation Product (FDP)

Fibrinogen

20

Tình trạng tăng đơng

Ngun nhân [4]: - Tăng hoạt động tiểu cầu

- Tăng hoạt động yếu tố đông máu

- Tăng hoạt động đồng loạt tiểu cầu yếu tố đông máu

Tăng hoạt động tiểu cầu: rối loạn dòng chảy mạch tổn thương nội mạc, tạo điều kiện thuận lợi cho tiểu cầu bám dính, ngưng tập, đồng thời hoạt hóa yếu tố đông máu nội [4]

Tăng hoạt động yếu tố đông máu: hay gặp ứ trệ tuần hoàn lâu dài, thể bất động lâu ngày Nồng độ yếu tố tăng lên vùng ứ trệ hậu thoát nước khỏi thành mạch (áp lực thủy tĩnh thiếu oxy) chúng bị hoạt hóa tiểu cầu có điều kiện bám dính vào mạc nội mạc (máu chảy chậm, nội mạc thay đổi thiếu oxy) Cũng vậy, huyết khối dể hình thành tĩnh mạch động mạch [4]

Tăng hoạt động đồng loạt tiểu cầu yếu tố đông máu: gặp hội chứng DIC Các yếu tố đông máu bị tiêu thụ mức, đến cạn kiệt, dẫn đến người bệnh bị chảy máu không cầm Hội chứng bắt đầu hoạt hóa tiểu cầu phạm vi toàn thân Các tiểu cầu bám vào vách đến mức làm giảm hẳn số lượng máu Đồng thời, theo yếu tố đơng máu bị hoạt hóa với cường độ cao, để tạo hậu [4]:

 Tạo vô số cục đông vi thể khắp thể, gây thiếu oxy nặng cho mô quan

 Máu trở nên khó đơng xuất huyết yếu tố đông máu bị tiêu thụ mức khiến nồng độ chúng máu toàn thân giảm mạnh

21

Có nhiều chế dẫn đến hội chứng DIC: đưa vào máu lượng lớn thromboplastin mô (trong vết thương bị dập nát, bỏng rộng, can thiệp ngoại khoa rộng,…), độc tố số virus vi khuẩn gram âm (sốc nhiễm khuẩn, sốt xuất huyết,…), hủy hoại rộng (nhiễm độc thai, lupus nặng, ung thư giai đoạn muộn,…) [4]

Huyết khối (thrombosis): là tình trạng bệnh lý liên quan nút cầm máu bệnh

động mạch ứ máu tĩnh mạch tâm nhĩ Các mảnh huyết khối bị vỡ theo dòng máu gây tắc nghẽn mạch máu nhỏ mạch phổi, mạch não, tĩnh mạch, vị trí khác tim [5]

1.3.4 Những chất chống đơng máu

Trong lịng mạch

Bình thường, lịng mạch có sẵn yếu tố ngăn cản q trình đơng máu, quan trọng [11]:

- Lớp glycocalyx có chất mucopolysaccharid (tích điện âm): đẩy tiểu cầu yếu tố đông máu

- Prostacyclin (bài tiết từ tế bào nội mơ): ức chế kết dính tiểu cầu

- Thrombomodulin (bài tiết từ tế bào nội mô): tạo phức hợp thrombomodulin-thrombin, làm bất hoạt thrombin hoạt hóa protein C Protein C gây bất hoạt yếu tố V VIII

- Antithrombin III: bất hoạt phần thrombin không bị hấp phụ vào mạng lươi fibrin bất hoạt yếu tố IX, X, XI, XII

- Heparin (bài tiết từ dưỡng bào bạch cầu ưa base có nhiều mơ phổi gan): tăng tác dụng antithrombin III lên hàng trăm đến hàng nghìn lần Heparin thuốc chống đơng máu phịng điều trị huyết khối gây tắc mạch đặc biệt viêm tắc tĩnh mạch, nhồi máu tim

Sử dụng lâm sàng

22

- Streptokinase (sinh từ tiểu cầu): hoạt hóa plasminogen từ plasmin, làm tan sợi fibrin [11]

- tPA (tissue plasminogen activation): yếu tố hoạt hóa plasminogen có nguồn gốc từ mơ [11]

23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nọc Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)

- PĐ phân lập từ nọc Bò cạp đen An Giang Heterometrus laoticus

- Các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (thu từ PĐ 5)

Các mẫu cung cấp TSKH Hoàng Ngọc Anh (Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh)

2.1.2 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, không dị tật, thể trọng 20 ± 02 g/ con, Viện Vắc xin sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp Chuột mua về, nuôi ổn định, cung cấp đầy đủ thức ăn nước uống ngày phịng thí nghiệm Bộ mơn Dược lý, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, Thành phố Hồ Chí Minh Sau đó, chúng tiến hành làm thử nghiệm 2.1.3 Dụng cụ

- Cân phân tích số

(TLD204E, hãng Mettler – Toledo, Thụy Sĩ) - Bếp điện

- Cốc có mỏ 500ml - Đĩa petri

- Kéo cắt

- Đồng hồ bấm

- Nhiệt kế thủy ngân - Kim tiêm

- Lọ bi - Micro pipet - Vĩ bắt chuột - Bocal nhựa

2.1.4 Hóa chất

NaCl 0,9% (công ty Cổ phần thương mại thiết bị y tế Vĩnh Phúc)

24 2.2 PHƯƠNG PHÁP

Các chất khảo sát hòa tan dung dịch NaCl 0,9% sau tiêm vào tĩnh mạch đuôi chuột để khảo sát tác động PĐ5 PĐTC lên q trình đơng – chảy máu (thể tích tiêm 0,1 ml/10g thể trọng chuột)

Chuột tham gia thử nghiệm phân thành lô (6 chuột/ lô): - Lô chứng: chuột tiêm tĩnh mạch đuôi dung dịch NaCl 0,9%

- Lô thử: chuột tiêm tĩnh mạch đuôi PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48 mg/kg (1/5 LD50, LD50 = 12,4 mg/kg)

Thời gian chảy máu: tiến hành theo mô hình chuẩn hóa Yang Liu

đồng [39] Cầm chuột cách giữ phần da đầu da lưng chuột, thả lỏng đuôi chuột tránh tác động vào đuôi Cắt đoạn đuôi chuột dài khoảng 5mm tính từ chóp đường kính vết cắt khoảng 1,5 mm Phần cịn lại nhúng vào dung dịch NaCl 0,9% nhiệt độ trì 37oC Tính thời gian chảy máu từ lúc

bắt đầu chảy máu đến ngừng chảy Tiến hành thao tác thời điểm 20, 30, 60, 90, 120 phút kể từ sau tiêm thuốc

Thời gian đông máu: sau cắt đuôi chuột, hứng giọt máu từ vết cắt lên lam kính

được đặt đĩa petri có nắp đậy (nhằm tránh tác động từ môi trường) trước nhúng vào NaCl 0,9% Giọt máu lấy có đường kính khoảng 6-7 mm Theo dõi thời gian từ lúc lấy giọt máu khỏi đuôi đến giọt máu đơng hồn tồn Tiến hành lấy máu thời điểm 20, 30, 60, 90 120 phút kể từ sau tiêm thuốc

2.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ

Các số liệu trình bày dạng Số trung bình (Mean) ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn số trung bình) Nếu có khác biệt lơ, xác định khác biệt hai lô phép kiểm Mann-Whitney với phần mềm thống kê Minitab 16.0 Sự khác xem có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05

25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Tác động chất khảo sát lên q trình đơng máu

Kết khảo sát tác động PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 lên thời gian đông máu so với lô chứng (NaCl 0,9%) thể Bảng 3.1

Bảng 3.1. Thời gian đông máu tác động chất khảo sát PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%)

Thời gian đông máu (giây)

Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút

PĐ5 422.3± 48.4* 391.7± 48.1* 387.5± 35.0 360.2± 56.5 358.8± 26.6*

5.5.1 442.5± 20.6** 426.2± 25.6** 366.2± 25.0** 428.3± 51.1 296.3± 37.4

5.21.1 401.5± 31.2 340.8± 29.1 300.3± 32.1 460.5± 41.7 313.3± 24.9*

5.22.3 556.5± 87.2** 426.2± 53.7* 388.0± 46.3* 367.0± 25.5* 261.8± 16.4

Chứng 307.7± 17.4 290.67± 9.58 286.00± 6.31 256.3± 20.4 229.7± 13.2 * p < 0,05 ** p < 0,01 so với chứng

26

Nhìn chung, PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 cho tác động kéo dài thời gian đông máu suốt q trình thử nghiệm (thời gian đơng máu xác định thời điểm 20, 30, 60, 90 120 phút sau tiêm tĩnh mạch đuôi chuột PĐ khảo sát)

PĐ khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) quan sát thấy thời điểm 20, 30 120 phút sau tiêm Riêng thời điểm 60 90 phút, khác biệt không mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Trong 30 phút đầu kể từ sau tiêm thuốc, ngoại trừ PĐTC 5.21.1, PĐTC khác cho thời gian đông máu dài hẳn so với nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê PĐTC 5.21.1 kéo dài thời gian đông máu đáng kể so với nhóm chứng lại khơng mang ý nghĩa thống kê

Sau 60 phút PĐCT 5.5.1 5.22.3 cho khác biệt có ý nghĩa thống kê PĐTC 5.21.1 dù có kéo dài thời gian đơng máu lại khơng có ý nghĩa thống kê

Sau 90 phút, PĐTC kéo dài thời gian đông máu đáng kể so với nhóm chứng Tuy nhiên, khác biệt có ý nghĩa thống kê thể PĐTC 5.22.3, PĐTC cịn lại khơng có ý nghĩa thống kê

Sau 120 phút có khác biệt so với thời điểm trước Các PĐTC cho tác động kéo dài thời gian đông máu, 5.21.1 cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê, 5.5.1 5.22.3 cho thấy khác biệt không đáng kể không mang ý nghĩa thống kê

Như vậy, PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48 mg/kg tăng thời gian đơng máu so với lơ chứng Trong đó, PĐTC 5.21.1 cho tác động chậm 3.1.2 Tác động chất khảo sát lên trình chảy máu

27

Bảng 3.2. Thời gian chảy máu tác động chất khảo sát PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%)

Thời gian chảy máu (giây)

Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút

PĐ 386.2±57.3* 187.0±64.6* 86±2.38 119.3±29.2* 183±80.7

5.5.1 248.2±66.7* 314±58.6* 146.7±46.0* 65±14.5 40.2±10.3

5.22.3 233.0±30.6 ** 179.0±41.4* 218.7±78.5** 151.5±57.4 83.8±13.7

5.21.1 314.5±85.2* 84.8±16.7 81.2±15.4 61.8±14.8 68.8±16.4

Chứng 79.5±13.7 43.33±1.94 45.83±3.95 40.67±5.02 49.67±7.85 * p < 0,05 ** p < 0,01 so với chứng

Hình 3.2 Thời gian chảy máu tác động PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48mg/kg

28

PĐ khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) quan sát thấy thời điểm 20, 30 90 phút sau tiêm Riêng thời điểm 60 120 phút, khác biệt không mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Sau 20 phút kể từ tiêm thuốc, PĐTC kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng từ 3-5 lần tất khác biệt có ý nghĩa thống kê

Sau 30 phút, PĐTC 5.5.1 5.22.3 kéo dài thời gian chảy máu đáng kể so với nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê Đáng ý, PĐTC 5.5.1 có thời gian chảy máu gấp khoảng 7,2 lần so với nhóm chứng chênh lệch cao so với thời điểm khảo sát khác PĐTC PĐTC khác suốt trình thử nghiệm Ở PĐTC 2.21.1, thời gian chảy máu có kéo dài lại khơng có ý nghĩa thống kê

Sau 60 phút, PĐTC kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng có 5.5.1 5.22.3 có ý nghĩa thống kê, 5.21.1 có khác biệt so với nhóm chứng không lớn (1,8 – 1,9 lần, 5.5.1 5.22.3 tương ứng 3,2 4,8 lần) khơng có ý nghĩa thống kê

Sau 90 phút, PĐTC 5.5.1, 5.22.3 5.21.1 dù có kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng không mang ý nghĩa thống kê

Sau 120 phút, so với nhóm chứng, hầu hết PĐTC kéo dài thời gian chảy máu, có PĐTC 5.5.1 có thời gian chảy máu ngắn Tuy nhiên, PĐTC khảo sát cho thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê

Như vậy, PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 liều 2,48 mg/kg tăng thời gian chảy máu so với lơ chứng Trong đó, PĐTC 5.21.1 cho tác động yếu 3.2 BÀN LUẬN

29

Trong thử nghiệm in vivo, PĐ thể rõ ảnh hưởng lên thời gian đông – chảy máu

thông qua việc kéo dài thời gian đơng – chảy máu so với nhóm chứng suốt 120 phút trình thử nghiệm Cụ thể, PĐ có thời gian đơng máu gấp 1,1 – 1,4 lần nhóm chứng thời gian chảy máu gấp 2,9 – 4,9 lần nhóm chứng Như vậy, kết in vivo

đã góp phần củng cố thêm chứng chứng minh tác dụng chống đông máu PĐ nọc bò cạp Heterometrus laoticus

Từ PĐ Heterometrus laoticus, tách 24 PĐTC qua sắc ký pha đảo Trong

đó, PĐTC tách 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 cho thấy tác động kéo dài thời gian đông – chảy máu suốt trình thử nghiệm

Tác động lên q trình đơng máu PĐTC

Kết khảo sát cho thấy tác động kéo dài thời gian đông máu PĐTC khảo sát không cao, từ 1,3 – 1,8 lần so với nhóm chứng

Trong đó, PĐTC 5.21.1 5.22.3 cho tác động nhanh kéo dài Cả PĐTC thể tác động từ phút thứ 20 sau tiêm kéo dài suốt 60 PĐTC 5.5.1 90 phút PĐTC 5.22.3 Đáng ý, thời điểm 20 phút kể từ tiêm thuốc, PĐTC 5.22.3 có thời gian đơng máu kéo dài đến 1,8 lần so với nhóm chứng

Ngược lại, PĐTC 5.21.1 lại cho tác động yếu chậm hẳn PĐTC phát huy tác động sau 120 phút kể từ tiêm thuốc cho kèo dài thời gian đông máu 1,4 lần so với nhóm chứng

Tác động lên trình chảy máu PĐTC

Kết khảo sát cho thấy tác động kéo dài thời gian chảy máu PĐTC khảo sát rõ ràng, từ khoảng từ 2,9 đến 7,2 lần so với nhóm chứng Trong PĐTC 5.5.1 5.22.3 thể tác động mạnh PĐTC 5.21.1 yếu

30

31

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN

- PĐ 5, PĐTC 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 cho thấy tác động kéo dài thời gian đông máu chảy máu

- Tác động kéo dài thời gian chảy máu PĐ PĐTC 5.5.1, 5.21.1 5.22.3 rõ đơng máu

- PĐTC 5.5.1 5.22.3 có tác động kéo dài thời gian đông – chảy máu mạnh - PĐTC 5.21.1 có tác động kéo dài thời gian đông - chảy máu yếu

4.2 ĐỀ NGHỊ

Tiến hành nghiên cứu nhằm xác định đích tác động chế tác động PĐ lên hoạt động chống đông máu

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Hồng Ngọc Anh, Phạm Ngun Đơng Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Trần Thanh Đức, Võ Phùng Nguyên (2010), "Khảo sát thành phần protein nọc bọ cạp

Heterometrus laoticus phân bố Tây Ninh so sánh với nọc bọ cạp phân bố An Giang", Tạp chí Hóa học, 48(4B), tr 285-289

2 Hoàng Ngọc Anh, Võ Đỗ Minh Hoàng, Nikitin Ilya, Utkin Yurin (2011), "Tách bước đầu nghiên cứu toxin ngắn nọc bọ cạp Heterometrus laoticus",

Tạp chí Hóa học, 49(1), tr 117-121

3 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 1074-1076

4 Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh - Trường đại học Y Hà Nội (2012), Sinh lý bệnh học, tái lần thứ 2,NXB Y học, Hà Nội, tr 297-298

5 Trần Thị Thu Hằng (2018), Dược lực học, tái lần thứ 22,NXB Phương Đông, Tp Hồ Chí Minh, tr 947-964

6 Võ Đỗ Minh Hồng, Phạm Ngun Đơng n, Lưu Hồng Lê Giang, Võ Phùng Ngun, Hồng Ngọc Anh (2014), "Khảo sát tính chất hóa học dược tính nọc bọ cạp đen Heterometrus laoticus (An Giang)", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(1C), tr 217-224

7 Võ Phùng Nguyên, Hoàng Ngọc Anh, Lưu Hồng Lê Giang (2009), "Độc tính cấp - bán trường diễn tác động giảm đau, kháng viêm nọc bọ cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)", Tạp chí Dược học, 400, tr 13-17

9 Võ Phùng Nguyên, Hoàng Ngọc Anh, Nguyễn Thị Phương Khuê (2008), "Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng giảm đau, kháng viêm nọc bọ cạp đen Tây Ninh",

Tạp chí Dược học, 389, tr 31-34

10 Nguyễn Thị Thùy Trang, Trần Hiếu Trung, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Cửu Khoa, Võ Phùng Nguyên, Yuri Utkin, Hoàng Ngọc Anh (2014), "Khảo sát tác động kháng viêm, giảm đau phân đoạn nọc bọ cạp Heterometrus laoticus",

Tạp chí Dược học, 464, tr 41-45

11 Vụ Khoa học Đào tạo - Bộ Y tế (2012), Giải phẩu sinh lý người (Dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), NXB Giáo dục Việt Nam, tr 75-85

TIẾNG ANH

12 Andrade E., Villanova F., Borra P., Leite K., Troncone L., Cortez I., Messina L., Paranhos M., Claro J., Srougi M (2008), "Penile erection induced in vivo by a purified toxin from the Brazilian spider Phoneutria nigriventer", BJU Int, 102(7), p 835-837

13 Berger R., Billups K., Brock G., Broderick G A., Dhabuwala C B., Goldstein I., Hakim L S., Hellstrom W., Honig S., Levine L A., Lue T., Munarriz R., Montague D K., Mulcahy J J., Nehra A., Rogers Z R., Rosen R., Seftel A D., Shabsigh R., Steers W (2001), "Report of the American Foundation for Urologic Disease (AFUD) Thought Leader Panel for evaluation and treatment of priapism", Int J Impot Res, 13 Suppl 5, p S39-43

14 Brazón Josmary, Guerrero Belsy, D´Suze Gina, Sevcik Carlos, Arocha-Piñango Carmen L (2013), "Anticoagulant and factor Xa-like activities of Tityus discrepans scorpion venom", Acta Toxicol Argent., 21(1), p 26-32

15 Brunton Laurence L., Chabner Bruce A., Knollmann Bjorn C (2011), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basic of Therapeutics, 12th edition,McGraw Hill Medical, New York, p 849

17 Chen B., Ji Y (2002), "Antihyperalgesia effect of BmK AS, a scorpion toxin, in rat by intraplantar injection", Brain Res, 952(2), p 322-326

18 Chen J., Feng X H., Shi J., Tan Z Y., Bai Z T., Liu T., Ji Y H (2006), "The anti-nociceptive effect of BmK AS, a scorpion active polypeptide, and the possible mechanism on specifically modulating voltage-gated Na+ currents in primary afferent neurons", Peptides, 27(9), p 2182-2192

19 Chuang R S., Jaffe H., Cribbs L., Perez-Reyes E., Swartz K J (1998), "Inhibition of T-type voltage-gated calcium channels by a new scorpion toxin", Nat Neurosci, 1(8), p 668-674

20 Couraud F., Jover E., Dubois J.M., Rochat H (1982), "Two types of scorpion toxin receptor sites, one related to the activation, the other to the inactivation of the action potential sodium channel", Toxicon, 20(1), p 9-16

21 Couzijn H.W.C (1981), "Revision of the Genus Heterometrus Hemprich & Ehrenberg (Scorpionidae, Arachnidea)", Zoologische Verhandelingen, 184(1), p 1-196

22 DeBin J A., Maggio J E., Strichartz G R (1993), "Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion", Am J Physiol, 264(2 Pt 1), p C361-369

23 DeBin J A., Strichartz G R (1991), "Chloride channel inhibition by the venom of the scorpion Leiurus quinquestriatus", Toxicon, 29(11), p 1403-1408 24 Diaz-Garcia A., Morier-Diaz L., Frion-Herrera Y., Rodriguez-Sanchez H.,

Caballero-Lorenzo Y., Mendoza-Llanes D., Riquenes-Garlobo Y., Fraga-Castro J A (2013), "In vitro anticancer effect of venom from Cuban scorpion

Rhopalurus junceus against a panel of human cancer cell lines", J Venom Res, 4, p 5-12

26 Fu Y J., Yin L T., Liang A H., Zhang C F., Wang W., Chai B F., Yang J Y., Fan X J (2007), "Therapeutic potential of chlorotoxin-like neurotoxin from the Chinese scorpion for human gliomas", Neurosci Lett, 412(1), p 62-67

27 Gopalakrishnakone P., Possani Lourival D., Schwartz Elisabeth F., Vega Ricardo C Rodríguez de la (2014), Scorpion venoms, Springer, Dordrecht, p 3-496 28 Gordon D., Karbat I., Ilan N., Cohen L., Kahn R., Gilles N., Dong K., Stuhmer

W., Tytgat J., Gurevitz M (2007), "The differential preference of scorpion alpha-toxins for insect or mammalian sodium channels: implications for improved insect control", Toxicon, 49(4), p 452-472

29 Goudet C., Chi C W., Tytgat J (2002), "An overview of toxins and genes from the venom of the Asian scorpion Buthus martensi Karsch", Toxicon, 40(9), p 1239-58

30 Guan R., Wang C G., Wang M., Wang D C (2001), "A depressant insect toxin with a novel analgesic effect from scorpion Buthus martensii Karsch", Biochim Biophys Acta, 1549(1), p 9-18

31 Hamilton P J., Ogston D., Douglas A S (1974), "Coagulant activity of the scorpion venoms Palamneus gravimanus and Leiurus quinquestriatus",

Toxicon, 12(3), p 291-296

32 Hoang Anh N , Vo Hoang D.M , Kudryashova K S., Nekrasova O V., Feofanov A V., Andreeva T V., Tsetlin V I., Utkin Y N (2013), "Hetlaxin, a new toxin from the Heterometrus laoticus scorpion venom, interacts with voltage-gated potassium channel Kv1.3", Dokl Biochem Biophys, 449, p 109-111

33 Hoang Anh N , Vo Hoang D.M , Vo Nguyen P., Kudryashova K S., Nekrasova O V., Feofanov A V., Kirpichnikov M P., Andreeva T V., Serebryakova M V., Tsetlin V I., Utkin Y N (2014), "Vietnamese Heterometrus laoticus

scorpion venom: evidence for analgesic and anti-inflammatory activity and isolation of new polypeptide toxin acting on Kv1.3 potassium channel",

34 Housley D M., Housley G D., Liddell M J., Jennings E A (2017), "Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level", Neuropharmacology, 127, p 46-78

35 Incamnoi P., Patramanon R., Thammasirirak S., Chaveerach A., Uawonggul N., Sukprasert S., Rungsa P., Daduang J., Daduang S (2013), "Heteromtoxin (HmTx), a novel heterodimeric phospholipase A(2) from Heterometrus laoticus

scorpion venom", Toxicon, 61, p 62-71

36 Isbister G K., Bawaskar H S (2014), "Scorpion envenomation", N Engl J Med, 371(5), p 457-463

37 Kovařík František (2004), "A review of the genus Heterometrus Ehrenberg, 1828, with descriptions of seven new species (Scorpiones, Scorpionidae)",

Euscorpius, 2004(15), p 1-60

38 Liu T., Pang X Y., Jiang F., Bai Z T., Ji Y H (2008), "Anti-nociceptive effects induced by intrathecal injection of BmK AS, a polypeptide from the venom of Chinese-scorpion Buthus martensi Karsch, in rat formalin test", J Ethnopharmacol, 117(2), p 332-338

39 Liu Y., Jennings N L., Dart A M., Du X J (2012), "Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice", World J Exp Med, 2(2), p 30-36

40 Mamelak A N., Jacoby D B (2007), "Targeted delivery of antitumoral therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin (TM-601)", Expert Opin Drug Deliv, 4(2), p 175-186

41 Manjunatha Kini R., Clemetson Kenneth J, Markland Francis S., McLane Mary Ann, Morita Takashi (2011), Toxins and Hemostasis: From Bench to Bedside, Springer, New York

43 Pennington M W., Czerwinski A., Norton R S (2018), "Peptide therapeutics from venom: Current status and potential", Bioorg Med Chem, 26(10), p 2738-2758

44 Possani Lourival D., Becerril Baltazar, Delepierre Muriel, Tytgat Jan (1999), "Scorpion toxins specific for Na+-channels", FEBS Journal, 264(2), p 287-300 45 Quintero-Hernandez V., Jimenez-Vargas J M., Gurrola G B., Valdivia H H., Possani L D (2013), "Scorpion venom components that affect ion-channels function", Toxicon, 76, p 328-342

46 Saidani C., Hammoudi-Triki D., Laraba-Djebari F., Taub M (2016), "In vitro

studies with renal proximal tubule cells show direct cytotoxicity of Androctonus australis hector scorpion venom triggered by oxidative stress, caspase activation and apoptosis", Toxicon, 120, p 29-37

47 Soroceanu L., Gillespie Y., Khazaeli M B., Sontheimer H (1998), "Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors", Cancer Res, 58(21), p 4871-4879

48 Teixeira C E., de Oliveira J F., Baracat J S., Priviero F B., Okuyama C E., Rodrigues Netto N., Jr., Fregonesi A., Antunes E., De Nucci G (2004), "Nitric oxide release from human corpus cavernosum induced by a purified scorpion toxin", Urology, 63(1), p 184-189

49 Teixeira C E., Faro R., Moreno R A., Rodrigues Netto N., Jr., Fregonesi A., Antunes E., De Nucci G (2001), "Nonadrenergic, noncholinergic relaxation of human isolated corpus cavernosum induced by scorpion venom", Urology, 57(4), p 816-820

characterization of Heteroscorpine-1 (HS-1) toxin from Heterometrus laoticus

scorpion venom", Toxicon, 49(1), p 19-29

52 Vandendriessche T., Kopljar I., Jenkins D P., Diego-Garcia E., Abdel-Mottaleb Y., Vermassen E., Clynen E., Schoofs L., Wulff H., Snyders D., Tytgat J (2012), "Purification, molecular cloning and functional characterization of HelaTx1 (Heterometrus laoticus): the first member of a new kappa-KTX subfamily", Biochem Pharmacol, 83(9), p 1307-1317

53 Wang X., Wang G (2016), "Insights into Antimicrobial Peptides from Spiders and Scorpions", Protein Pept Lett, 23(8), p 707-721

54 Xiong Y M., Lan Z D., Wang M., Liu B., Liu X Q., Fei H., Xu L G., Xia Q C., Wang C G., Wang D C., Chi C W (1999), "Molecular characterization of a new excitatory insect neurotoxin with an analgesic effect on mice from the scorpion Buthus martensi Karsch", Toxicon, 37(8), p 1165-1180

55 Zhao R., Weng C C., Feng Q., Chen L., Zhang X Y., Zhu H Y., Wang Y., Ji Y H (2011), "Anticonvulsant activity of BmK AS, a sodium channel site 4-specific modulator", Epilepsy Behav, 20(2), p 267-276

PL1 PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM KHẢO SÁT TÁC DỤNG LÊN THỜI GIAN ĐÔNG MÁU CỦA PĐ5 VÀ CÁC PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 Ở LIỀU 2,48mg/kg

Nhóm thử nghiệm

Chuột Thời gian đông máu (giây)

Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút

PĐ5 643 437 482 391 355

2 337 222 295 447 447

3 341 282 496 532 378

4 298 212 386 123 299

5 350 430 206 329 304

6 465 567 360 339 340

PĐTC 5.5.1 374 397 359 550 376

2 450 404 340 307 288

3 522 336 312 316 223

4 410 492 341 610 435

5 366 503 486 413 257

6 433 425 359 374 199

PĐTC 5.21.1 488 406 363 414 372

2 424 409 307 409 314

3 330 304 270 401 272

4 365 353 414 479 394

5 387 219 198 400 359

6 315 354 250 660 296

PĐTC 5.22.3 389 291 295 267 177

2 495 357 450 289 274

3 407 305 184 134 158

4 712 524 580 445 327

5 918 648 224 365 213

6 418 262 295 382 272

CHỨNG 558 381 684 640 712

2 654 505 594 604 457

3 401 313 344 391 218

4 172 288 279 213 285

5 174 116 271 303 242

PL2

PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM KHẢO SÁT TÁC DỤNG LÊN THỜI GIAN CHẢY MÁU CỦA PĐ5 VÀ CÁC PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 Ở LIỀU 2,48mg/kg

Nhóm thử nghiệm

Chuột Thời gian đông máu (giây)

Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút

PĐ5 558 115 197 74 55

2 121 68 74 253 204

3 600 40 53 47 1530

4 600 600 20 99 39

5 530 600 1800 1800 1017

6 122 112 86 124 97

PĐTC 5.5.1 419 215 465 72 44

2 135 296 77 26 18

3 76 26 48 21 18

4 600 1217 90 71 54

5 147 125 113 87 25

6 122 88 94 113 82

PĐTC 5.21.1 302 62 91 74 17

2 511 119 122 118 53

3 58 66 80 44 39

4 141 54 44 30 92

5 275 56 119 82 128

6 600 152 31 23 84

PĐTC 5.22.3 322 36 194 48 115

2 125 317 88 147 122

3 292 102 114 99 87

4 184 164 1800 420 51

5 273 250 199 159 90

6 202 205 117 36 38

CHỨNG 181 52 191 65 50

2 600 138 209 100 71

3 600 76 61 33 28

4 68 106 1800 184 69

5 411 511 465 175 110

PHIẾU XÁC NHẬN SỬA CHỮA

Nội dung khóa luận chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng

GVHD

(ký ghi rõ họ tên)

Sinh viên

(ký ghi rõ họ tên)

Chủ tịch Hội đồng

(ký ghi rõ họ tên)

GV phản biện