Xác định điều kiện hoạt động tối ưu và động học của enzyme α amylase và glucoamylase toruzyme

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BÁO CÁO NCKH CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU VÀ ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE VÀ GLUCOAMYLASE TORUZYME Chủ nhiệm đề tài TS TRẦN PHƯƠNG LAN AN GIANG, 8/2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BÁO CÁO NCKH CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU VÀ ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE VÀ GLUCOAMYLASE TORUZYME Chủ nhiệm đề tài TS TRẦN PHƯƠNG LAN AN GIANG, 8/2019 Đề tài nghiên cứu khoa học “Xác định điều kiện hoạt động tối ưu động học enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme” tác giả Trần Phương Lan, công tác Khoa Nông nghiệp Tài nguyên thiên nhiên thực Tác giả báo cáo kết nghiên cứu Hội đồng Khoa học Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày 28/08/2019 Thư ký ThS NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG Phản biện Phản biện TS NGUYỄN HỮU THANH TS NGUYỄN DUY TÂN Chủ tịch hội đồng PGS TS VÕ VĂN THẮNG i LỜI CẢM TẠ Trong trình thực đề tài nghiên cứu khoa học “Xác định điều kiện hoạt động tối ưu động học enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme” nhận nhiều giúp đỡ từ Ban Giám hiệu nhà Trường, Ban Quản lý Phòng Quản lý khoa học − Đào tạo sau đại học, Ban Quản lý Phòng Kế hoạch − Tài vụ, Ban Quản lý Phòng Quản trị − Thiết bị Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp − Tài nguyên thiên nhiên để hồn thành nghiên cứu Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc Ban Giám hiệu Trường Đại học An Giang, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp − TNTN Phịng ban chức có liên quan giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực nghiên cứu Tơi xin cảm ơn đến quý thầy cô đồng nghiệp, chuyên viên Khu Thí nghiệm Trung tâm Trường Đại học An Giang nhiệt tình hỗ trợ tơi q trình thực thí nghiệm Tơi xin cám ơn đến hai em sinh viên Trần Hoàng Phúc Khưu Thị Huỳnh Dương ngành Cơng nghệ thực phẩm, khóa ĐH16TP trực tiếp tơi thực thí nghiệm xử lý số liệu Cuối xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh động viên sát cánh lúc khó khăn Người thực TS TRẦN PHƯƠNG LAN ii TÓM TẮT Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu thông số động học enzyme αamylase glucoamylase Toruzyme thực nhằm cung cấp kiến thức cho nghiên cứu Thí nghiệm thực xác định nhiệt độ pH tối ưu, dung dịch đệm phù hợp, khả bền nhiệt phân tích thơng số động học hai enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme Kết phân tích cho thấy αamylase Toruzyme có nhiệt độ pH tối ưu tương ứng 50 °C 5,5 α-Amylase Toruzyme hoạt động dung dịch đệm sodium acetate (NaOAC) tốt so với sodium phosphate (NaP) hay sodium citrate (NaCHO) Khả bền nhiệt enzyme tương đối yếu Hoạt lực khoảng 70% sau ủ nhiệt độ 40 °C hay 50 °C Các thông số động học enzyme α-amylase Toruzyme Km = 4,34 mg.mL−1, Vmax = 1,50×10−2 mg.mL−1.s−1, kcat = 740 s−1 kcat/Km = 171 mL.mg−1.s−1 Trong đó, glucoamylase Toruzyme có nhiệt độ pH tối ưu tương ứng 35 °C 3,0 Mặc dù, glucoamylase hoạt động tốt dung dịch đệm NaCHO, không chênh lệch nhiều so với dung dịch đệm NaOAc sodium formate (HCOONa) Glucoamylase Toruzyme hoạt động tốt quanh nhiệt độ tối ưu; đặc biệt enzyme giữ 87,64% 89,53% hoạt tính tương đối nhiệt độ 30 °C hay 35 °C sau ủ Các thông số động học enzyme glucoamylase Toruzyme Km = 2,52 mg.mL−1, Vmax = 4,00×10−2 mg.mL−1.s−1, kcat = 62 s−1 kcat/Km = 35 mL.mg−1.s−1 Từ khóa: α-amylase, glucoamylase, nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, dung dịch đệm, độ bền nhiệt, động học enzyme iii ABSTRACT Determination of the optimal condition and enzyme kinetic of Toruzyme αamylase glucoamylase Toruzyme were performed to provide basic knowledge for future related researches The experiments include the determination of the optimal temperature and pH, suitable buffers, thermostability and kinetic analysis of two enzymes Toruzyme α-amylase and glucoamylase The results showed that Toruzyme α-amylase had the optimal temperature and pH at 50 °C 5.5, respectively The enzyme was more activated in sodium acetate (NaOAC) buffer than in sodium phosphate (NaP) or sodium citrate (NaCHO) The thermostable ability of this enzyme was relatively weak Its relative activity remained only approximately 70% after 2-hour incubation at 40 °C or 50 °C The kinetic parameters of α-amylase Toruzyme were Km = 4.34 mg.mL−1, Vmax = 1.50x10−2 mg.mL−1.s−1, kcat = 740 s−1 and kcat/Km = 171 mL.mg−1.s−1 Toruzyme glucoamylase whereas owned the optimal temperate and pH were 35 °C 3.0, respectively Although the glucoamylase expressed the highest activity in the NaCHO buffer, however it was only slightly different in comparison with the one in NaOAc or HCOONa Glucoamylase Toruzyme could work well around the optimal temperature; especially it still kept about 87.64% 89.53% enzyme activity after 2-hour incubation at 30 °C or 35 °C The kinetic parameters of glucoamylase Toruzyme were Km = 2.52 mg.mL−1, Vmax = 4.00x10−2 mg.mL−1.s−1, kcat = 62 s−1 and kcat/Km = 35 mL.mg−1.s−1 Key words: α-amylase, glucoamylase, optimal temperature, optimal pH, buffer, thermostability, enzyme kinetic iv LỜI CAM KẾT Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cá nhân thực Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khác An giang, ngày tháng năm 2019 Người thực Trần Phương Lan v MỤC LỤC Nội dung HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT ABSTRACT LỜI CAM KẾT MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH Chương GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme 2.2 Cấu trúc chức enzyme 2.3 Hoạt động enzyme 2.4 Động học enzyme 2.4.1 Diễn tiến thời gian phản ứng enzyme 2.4.2 Động học trạng thái cân 2.4.3 Các thông số động học enzyme 2.4.4 Phương trình Michaelis-Menten 2.4.5 Đồ thị Lineweaver-Burk 2.5 Ảnh hưởng yếu tố đến vận tốc enzyme 2.5.1 Ảnh hưởng nồng độ chất 2.5.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 2.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 2.5.4 Ảnh hưởng pH 2.5.5 Ảnh hưởng ion dung dịch phản ứng 2.6 Tổng quan enzyme α-amylase 2.6.1 Đặc điểm cấu tạo nguồn gốc trích ly 2.6.2 Cơ chế hoạt động enzyme α-amylase 2.6.3 Ứng dụng enzyme α-amylase 2.7 Tổng quan enzyme glucoamylase 2.7.1 Đặc điểm cấu tạo nguồn gốc trích ly vi Trang i ii iii iv v vi ix xi 1 2 4 7 8 10 11 11 12 12 13 14 14 14 16 17 17 17 2.7.2 Cơ chế hoạt động enzyme glucoamylase 2.7.3 Ứng dụng enzyme glucoamylase 2.8 Các nghiên cứu liên quan 2.8.1 Các nghiên cứu nước 2.8.2 Các nghiên cứu nước Chương PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.1.2 Nguyên vật liệu thiết bị sử dụng 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2 Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm Xác định nhiệt độ tối ưu enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme Thí nghiệm Xác định pH tối ưu enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme Thí nghiệm Xác định khả hoạt động enzyme αamylase glucoamylase Toruzyme số dung dịch đệm Thí nghiệm Xác định độ bền nhiệt enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme Thí nghiệm Xác định giá trị động học enzyme αamylase glucoamylase Toruzyme 3.3 Phương pháp phân tích số liệu tiêu Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nhiệt độ tối ưu 4.1.1 Nhiệt độ tối ưu enzyme α-amylase Toruzyme 4.1.2 Nhiệt độ tối ưu enzyme glucoamylase Toruzyme 4.2 pH tối ưu 4.2.1 pH tối ưu enzyme α-amylase Toruzyme 4.2.2 pH tối ưu enzyme glucoamylase Toruzyme 4.3 Dung dịch đệm thích hợp 4.3.1 Dung dịch đệm thích hợp cho enzyme α-amylase Toruzyme 4.3.2 Dung dịch đệm thích hợp cho enzyme glucoamylase Toruzyme 4.4 Độ bền nhiệt 4.4.1 Độ bền nhiệt enzyme α-amylase Toruzyme 4.3.2 Độ bền nhiệt enzyme glucoamylase Toruzyme 4.5 Động học enzyme 4.5.1 Xác định nồng độ enzyme nồng đồ chất thích hợp cho động học enzyme α-amylase glucoamylase Toruzymeenzyme vii 18 18 19 19 19 22 22 22 22 22 22 23 23 24 25 26 27 28 29 29 29 31 33 33 35 37 37 38 40 40 41 43 43 4.5.2 Động học enzyme α-amylase Toruzyme 4.5.2 Động học enzyme glucoamylase Toruzyme Chương KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Khuyến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ chương A Phụ chương B Phụ chương C viii 44 48 52 52 52 53 pc01 pc06 pc11 PHỤ CHƯƠNG A MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU Thí nghiệm Xác định nhiệt độ tối ưu enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme B B B B (a) (b) 5 7 8 (a’) (b’) Hình 31 Xác định nhiệt độ tối ưu enzyme α-amylase Toruzyme (a, b) glucoamylase Toruzyme (a’, b’) thơng qua (a, a’) hàm lượng chất cịn lại sau phản ứng phương pháp Lugol (b, b’) hàm lượng đường khử hình thành phương pháp DNS B Mẫu đối chứng Mẫu phản ứng nhiệt độ 30 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 35 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 40 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 45 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 50 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 55 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 60 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 65 °C Mẫu phản ứng nhiệt độ 70 °C pc1 Thí nghiệm 2: Xác định pH tối ưu enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme (a) (b) B B B 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ (a’) B 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ (b’) 8 Hình 32 Xác định pH tối ưu enzyme α-amylase Toruzyme (a, b) glucoamylase Toruzyme (a’, b’) thông qua (a, a’) hàm lượng chất lại sau phản ứng phương pháp Lugol (b, b’) hàm lượng đường khử hình thành phương pháp DNS B Mẫu đối chứng Mẫu phản ứng pH 4,0 Mẫu phản ứng pH 4,5 Mẫu phản ứng pH 5,0 Mẫu phản ứng pH 5,5 Mẫu phản ứng pH 6,0 Mẫu phản ứng pH 6,5 Mẫu phản ứng pH 7,0 Mẫu phản ứng pH 7,5 Mẫu phản ứng pH 8,0 1’ Mẫu phản ứng pH 2,0 2’ Mẫu phản ứng pH 2,5 3’ Mẫu phản ứng pH 3,0 4’ Mẫu phản ứng pH 3,5 5’ Mẫu phản ứng pH 4,0 6’ Mẫu phản ứng pH 5,5 7’ Mẫu phản ứng pH 6,0 8’ Mẫu phản ứng pH 6,5 9’ Mẫu phản ứng pH 7,0 pc2 Thí nghiệm 3: Xác định dung dịch đệm tối ưu enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme B B 2 3 (a) B (a’) B 2 3 (b) (b’) Hình 33 Xác định dung dịch đệm phù hợp cho enzyme α-amylase Toruzyme (a, b) glucoamylase Toruzyme (a’, b’) thơng qua (a, a’) hàm lượng chất cịn lại sau phản ứng phương pháp Lugol (b, b’) hàm lượng đường khử hình thành phương pháp DNS B Mẫu đối chứng Dung dịch đệm NaP Dung dịch đệm NaOAC Dung dịch đệm NaCHO 1’ Dung dịch đệm HCOONa 2’ Dung dịch đệm NaOAC 3’ Dung dịch đệm NaCHO pc3 Thí nghiệm 4: Xác định độ bền nhiệt enzyme α-amylase glucoamylase Toruzyme B B B B 1 2 7 (b) (c) (d) B (e) 2 (a) 3 Hình 34 Xác định độ bền nhiệt enzyme α-amylase Toruzyme phương pháp DNS nhiệt độ (a) 40 °C, (b) 45 °C, (c) 50 °C, (d) 55 °C, (e) 60 °C B Mẫu đối chứng Ủ thời gian phút Ủ thời gian 20 phút Ủ thời gian 40 phút Ủ thời gian 60 phút Ủ thời gian 80 phút Ủ thời gian 100 phút Ủ thời gian 120 phút pc4 B B B B (a) (b) (c) (d) 3 Hình 35 Xác định độ bền nhiệt enzyme α-amylase Toruzyme phương pháp DNS nhiệt độ (a) 30 °C, (b) 35 °C, (c) 40 °C, (d) 45 °C B Mẫu đối chứng Ủ thời gian phút Ủ thời gian 20 phút Ủ thời gian 40 phút Ủ thời gian 60 phút Ủ thời gian 80 phút Ủ thời gian 100 phút Ủ thời gian 120 phút pc5 PHỤ LỤC B PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP JULIANO Phương pháp Juliano hay gọi phương pháp Lugol Nguyên lý phương pháp dựa vào khả hình thành phức màu tinh bột iodine dung dịch Lugol (Juliano, 1971) Tinh bột có phân tử amylose có cấu trúc mạch xoắn polymer glucose, vòng xoắn giữ vững nhờ có liên kết hydrogen nhóm OH Khi cho dung dịch Lugol vào dung dịch tinh bột, ion I3- trượt vào chuỗi amylose tạo thành hợp chất có màu xanh tím Ngồi ra, amylopectin cịn có khả hấp thu iodine bề mặt mạch nhánh theo tương tác vật lý Trong nghiên cứu phương pháp Lugol sử dụng để xác định lượng tinh bột lại hỗn hợp phản ứng enzyme Dung dịch Lugol hỗn hợp gồm 2.0 g potassium iodine 0.2 g iodine 1000 mL nước cất Dung dịch Lugol trữ bình màu tránh tiếp xúc với ánh sáng Mẫu phân tích pha lỗng đến nồng độ thích hợp Lấy 100 μL mẫu hòa với 1000 μL dung dịch Lugol Sau mẫu đo độ hấp thụ (Abs) bước sóng 620 nm Hàm lượng tinh bột hịa tan cịn lại tính dựa phương trình đường chuẩn Lugol Để xây dựng đường chuẩn Lugol, sử dung dịch tinh bột hịa tan có nồng độ 2%, hịa tan dung mơi dimethyl sulfoxide (DMSO) có nồng độ cuối 90% Chuẩn bị mẫu cho xây dựng đường chuẩn Lugol trình bày Bảng13, với tổng thể tích 1100 μL; dung dịch Lugol 1000 μL Bảng 13 Chuẩn bị mẫu lập đường chuẩn Lugol Mẫu (μL) 10 Amylose 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lugol 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Nước cất 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Kết đo độ hấp thụ mẫu có nồng độ tinh bột hịa tan khác trình bày Bảng 14 Từ kết xây dựng độ thị đường chuẩn (Hình 36) suy phương trình đường chuẩn Lugol là: y = 0,5297x - 0,0172 với R2 = 0,9962 pc6 Bảng 14: Kết đo độ hấp thụ mẫu dung dịch tinh bột có nồng độ khác để xây dựng đường chuẩn Lugol Nhiệt độ (oC) Độ hấp thu (620 nm) Δ Độ hấp thu (620 nm) 0,0 0,091 0,000 0,1 0,161 0,070 0,2 0,230 0,139 0,3 0,267 0,176 0,4 0,338 0,247 0,5 0,362 0,271 0,6 0,427 0,336 0,7 0,473 0,382 0,8 0,521 0,430 0,9 0,589 0,498 1,0 0,635 0,544 Độ hấp thu (620 nm) 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Nồng độ tinh bột (mg.mL−1) Hình 36 Đồ thị đường chuẩn Lugol PHƯƠNG PHÁP DINITROSALICYLIC ACID (DNS) Phương pháp DNS sử dung để xác định hàm lượng đường khử sinh dung dịch phản ứng enzyme, dựa nguyên tắc hình thành màu cam đỏ nhóm carbonyl tự đường khử chuyển 3,5-dinitrosalicylic acid từ màu vàng dung dịch alkaline DNS thành 3-amino-5-nitro salicylic acid (Hanashiro, Abe & Hizukuri, 1996) pc7 Dung dịch DNS gồm 10,6 g DNS, 19,8 g NaOH, 306 g potassium, sodium tartrate, 7,6 mL phenol (được làm tan 68 oC bể điều nhiệt trước sử dụng), 8,3 g sodium-meta bisulfate hòa tan 1416 mL nước cất Dung dịch DNS trữ bình màu tránh tiếp xúc với ánh sáng Mẫu phân tích pha lỗng đến nồng độ thích hợp Lấy 300 μL mẫu hịa với 900 μL dung dịch DNS Sau đó, mẫu đun 100 oC phút làm nguội đến nhiệt độ phòng trước tiến hành đo mẫu độ hấp thu có bước sóng 575 nm Hàm lượng đường khử sinh tính dựa phương trình đường chuẩn DNS Để xây dựng đường chuẩn DNS, sử dung dịch glucose mM làm chất Chuẩn bị mẫu cho đường chuẩn Lugol trình bày Bảng 15, với tổng thể tích 1200 μL; dung dịch DNS 900 μL, hay tỷ lệ mẫu : DNS = 1:3 Bảng 15 Chuẩn bị mẫu lập đường chuẩn DNS Mẫu (μL) 10 Glucose 10 20 30 40 50 60 70 80 90 DNS 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900 Nước cất 300 290 280 270 260 250 240 230 220 210 Kết đo độ hấp thụ mẫu có nồng độ tinh bột hịa tan khác trình bày Bảng 16 Từ kết xây dựng độ thị đường chuẩn (Hình 37) suy phương trình đường chuẩn DNS là: y = 3,595x - 0,0130 với R2 = 0,9990 Bảng 16 Kết đo độ hấp thụ mẫu dung dịch glucose có nồng độ khác để xây dựng đường chuẩn DNS Nhiệt độ Độ hấp thu Δ Độ hấp thu o ( C) (575 nm) (575 nm) 0,00 0116 0,000 0,04 0,259 0,143 0,08 0,391 0,275 0,12 0,529 0,413 0,16 0,661 0,545 0,20 0,801 0,685 0,24 0,952 0,836 0,28 1,120 1,004 0,32 1,259 1,143 0,36 1,413 1,297 pc8 Độ hấp thu (575 nm) 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ glucose (mM) Hình 37 Đồ thị đường chuẩn DNS PHƯƠNG PHÁP BRADFORD Phương pháp Bradford dùng để xác định nồng độ enzyme, dựa nguyên tắc nhuộm màu Coomassive Blue G250 protein qua tương tác kỵ nước ion Chất nhuộm màu tồn bốn hình thức ion với giá trị pKa 1,15, 1,82 12,4 Coomassive Blue G250 pH 0, có hai nhóm sulfate có điện tích âm tất ba nitrogen mang điện tích dương, cho lưới điện tích +1, nên chất nhuộm có màu đỏ Coomassive Blue G250 pH1,5 có màu xanh Coomassive Blue G250 pH trung tính hình thành màu xanh dương Khi trước tiến hành đo nồng độ protein, mẫu enzyme cần pha loãng đến nồng độ khoảng thích hợp Cho 100 μL mẫu kết hợp với 900 μL dung dịch Bradford, để yên nhiệt độ phịng phút Sau tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 595 nm Hàm lượng protein có mẫu enzyme tính dựa đường chuẩn Bradford Đường chuẩn Bradford xây dựng với bovine serum albumin (BSA) 0,2% trình bày Bảng 17 Bảng 17 Chuẩn bị mẫu lập đường chuẩn Bradford Mẫu (μL) BSA 10 20 30 40 50 60 Bradford 900 900 900 900 900 900 900 Nước cất 100 90 80 70 60 50 40 Kết đo độ hấp thụ mẫu BSA có nồng độ khác trình bày Bảng 18 Từ kết xây dựng độ thị đường chuẩn (Hình 38) suy phương trình đường chuẩn Bradford là: y = 1,0318x - 0,13940 với R2 = 0,9970 pc9 Bảng 18 Kết đo độ hấp thụ mẫu dung dịch BSA có nồng độ khác để xây dựng đường chuẩn Bradford Nhiệt độ (oC) Độ hấp thu (595 nm) Δ Độ hấp thu (595 nm) 0,0 0,400 0,000 0,1 0,632 0,234 0,2 0,746 0,346 0,3 0,860 0,460 0,4 0,952 0,552 0,5 1,055 0,655 0,6 1,152 0,752 Độ hấp thu (595 nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0.2 0.3 Nồng độ BSA 0.4 0.5 (mg.mL−1) Hình 38 Đồ thị đường chuẩn Bradford pc10 0.6 PHỤ LỤC C SỐ LIỆU ĐO QUANG PHỔ Bảng 19 Độ hấp thu* chất lại (620 nm) lượng đường khử sinh (575 nm) theo nhiệt độ phản ứng enzyme α-amylase Toruzyme với tinh bột hòa tan Nhiệt độ (oC) Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) 30 0,327 ± 0,005 0,531 ± 0,049 35 0,316 ± 0,013 0,607 ± 0,043 40 0,244 ± 0,009 0,628 ± 0,110 45 0,213 ± 0,016 0,665 ± 0,036 50 0,199 ± 0,008 0,755 ± 0,062 55 0,226 ± 0,011 0,683 ±0,030 60 0,261 ± 0,007 0,645 ± 0,053 65 0,336 ± 0,017 0,616 ± 0,054 70 0,450 ±0,005 0,545 ± 0,034 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại Bảng 20 Độ hấp thu* chất lại (620 nm) lượng đường khử sinh (575 nm) theo nhiệt độ phản ứng enzyme glucoamylase Toruzyme với tinh bột hòa tan Nhiệt độ (oC) Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) 30 0,330 ± 0,009 0,757 ± 0,049 35 0,315 ± 0,006 0,830 ± 0,014 40 0,338 ± 0,023 0,800 ± 0,011 45 0,363 ± 0,015 0,785 ± 0,034 50 0,408 ± 0,018 0,754 ± 0,062 55 0,418 ± 0,004 0,734 ± 0,023 60 0,438 ± 0,008 0,695 ± 0,053 65 0,485 ± 0,006 0,587 ± 0,040 70 0,626 ± 0,013 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại pc11 0,253 ±0,043 Bảng 21 Độ hấp thu* chất lại (620 nm) lượng đường khử sinh (575 nm) theo pH phản ứng enzyme α-amylase Toruzyme với tinh bột hòa tan pH Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) 4,0 0,437 ± 0,010 0,251 ± 0,013 4,5 0,269 ± 0,006 0,461 ± 0,047 5,0 0,130 ± 0,014 0,937 ± 0,064 5,5 0,116 ± 0,007 1,032 ± 0,042 6,0 0,187 ± 0,021 0,821 ± 0,05 6,5 0,309 ± 0,013 0,456 ± 0,017 7,0 0,431 ± 0,009 0,368 ± 0,017 7,5 0,433 ± 0,011 0,354 ± 0,008 8,0 0,538 ±0,010 0,349 ± 0,014 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại Bảng 22 Độ hấp thu* chất lại (620 nm) lượng đường khử sinh (575 mn) theo pH phản ứng enzyme glucoamylase Toruzyme với tinh bột hòa tan pH Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) 2,0 0,135 ± 0,015 1,044 ± 0,002 2,5 0,121 ± 0,019 1,147 ± 0,056 3,0 0,058 ± 0,003 1,197 ± 0,017 3,5 0,064 ± 0,007 1,155 ± 0,022 4,0 0,076 ± 0,004 1,115 ± 0,005 4,5 0,074 ± 0,009 1,104 ± 0,003 5,0 0,101 ± 0,014 1,072 ± 0,038 5,5 0,147 ± 0,011 1,030 ± 0,016 6,0 0,414 ± 0,020 0,770 ± 0,024 6,5 0,480 ± 0,030 0,501 ± 0,019 7,0 0,500 ± 0,018 0,255 ± 0,043 7,5 0,518 ± 0,007 0,122 ± 0,004 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại pc12 Bảng 23 Độ hấp thu* chất lại (620 nm) lượng đường khử sinh (575 nm) theo dung dịch đệm phản ứng enzyme α-amylase Toruzyme với tinh bột hòa tan Dung dịch đệm Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) NaP 0,393 ± 0,008 0,344 ± 0,008 NaOAC 0,130 ± 0,003 0,853 ± 0,013 NaCHO 0,201 ± 0,006 0,712 ± 0,017 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại Bảng 24 Độ hấp thu* chất lại lượng đường khử sinh theo dung dịch đệm phản ứng enzyme glucoamylase Toruzyme với tinh bột hòa tan Dung dịch đệm Độ hấp thu* (620 nm) Độ hấp thu* (575 nm) HCOONa 0,206 ± 0,006 1,047 ± 0,014 NaOAC 0,189 ± 0,003 1,080 ± 0,016 NaCHO 0,180 ± 0,001 1,106 ± 0,021 Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại Bảng 25 Độ hấp thu* (575 nm) lượng đường khử sinh theo nhiệt độ thời gian ủ enzyme α-amylase Toruzyme Thời gian ủ enzyme (phút) 40 45 50 55 60 0,858 ± 0,064 0,793 ± 0,040 0,963 ± 0,006 0,943 ± 0,012 0,947 ± 0,011 20 0,816 ± 0,005 0,761 ± 0,011 0,906 ± 0,013 0,874 ± 0,015 0,917 ± 0,012 40 0,805 ± 0,036 0,713 ± 0,017 0,865 ± 0,015 0,806 ±0,015 0,860 ± 0,020 60 0,773 ± 0,013 0,666 ± 0,018 0,788 ± 0,011 0,778 ± 0,09 0,798 ± 0,007 80 0,759 ± 0,019 0,640 ± 0,007 0,758 ± 0,009 0,758 ± 0,011 0,721 ± 0,013 100 0,711 ± 0,040 0,587 ± 0,012 0,723 ± 0,012 0,651 ± 0,010 0,627 ± 0,011 120 0,696 ± 0,017 0,545 ± 0,012 0,702 ± 0,015 0,592 ± 0,08 0,556 ± 0,010 Nhiệt độ ủ enzyme (ºC) Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại pc13 Bảng 26 Độ hấp thu* (575 nm) lượng đường khử sinh theo nhiệt độ thời gian ủ enzyme glucoamylase Toruzyme Thời gian ủ enzyme (phút) 30 35 40 45 0,691 ± 0,017 0,756 ± 0,020 0,653 ± 0,011 0,409 ± 0,036 20 0,648 ± 0,020 0,706 ± 0,011 0,606 ± 0,011 0,374 ± 0,010 40 0,644 ± 0,006 0,701 ± 0,009 0,595 ± 0,007 0,366 ± 0,021 60 0,633 ± 0,004 0,693 ± 0,022 0,555 ± 0,004 0,323 ± 0,009 80 0,626 ± 0,007 0,685 ± 0,032 0,557 ± 0,007 0,318 ± 0,005 100 0,610 ± 0,003 0,674 ± 0,09 0,547 ± 0,019 0,309 ± 0,010 120 0,604 ± 0,003 0,675 ± 0,003 0,524 ± 0,023 0,304 ± 0,009 Nhiệt độ ủ enzyme (ºC) Ghi chú: (*) kết trung bình lần lặp lại Bảng 27 Độ hấp thu (575 nm) lượng đường khử sinh theo nồng độ thời gian phản ứng động học enzyme α-amylase Toruzyme Thời Nồng độ chất (%) gian ủ enzyme 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 (phút) 0,262 0,256 0,260 0,252 0,256 0,320 0,374 0,398 0,430 0,452 0,374 0,464 0,525 0,593 0,635 0,442 0,558 0,672 0,794 0,852 0,490 0,653 0,786 0,918 0,998 0,574 0,767 0,927 1,058 1,174 pc14 Bảng 28 Lượng đường khử sinh (mM) theo nồng độ thời gian phản ứng động học enzyme α-amylase Toruzyme Thời Nồng độ chất (%) gian ủ enzyme 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 (phút) 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,197 0,348 0,419 0,531 0,582 0,348 0,598 0,786 0,985 1,090 0,537 0,860 1,177 1,516 1,677 0,670 1,141 1,494 1,889 2,083 0,904 1,458 1,891 2,250 2,573 Bảng 4.14 Độ hấp thu (575 nm) lượng đường khử sinh theo nồng độ thời gian phản ứng động học enzyme glucoamylase Toruzyme Thời gian ủ enzyme (phút) Nồng độ chất (%) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,256 0,260 0,262 0,254 0,256 0,308 0,378 0,364 0,448 0,572 0,374 0,474 0,484 0,572 0,606 0,450 0,598 0,612 0,696 0,764 0,509 0,672 0,746 0,836 0,898 0,626 0,754 0,840 0,956 1,042 Bảng 4.14 Lượng đường khử sinh (mM) theo nồng độ thời gian phản ứng động học enzyme glucoamylase Toruzyme Thời Nồng độ chất (%) gian ủ enzyme 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 (phút) 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,181 0,364 0,320 0,471 0,23 0,364 0,631 0,654 0,921 1,010 0,576 0,976 1,010 1,266 1,449 0,740 1,182 1,382 1,655 1,822 0,921 1,410 1,644 1,989 2,223 pc15 ... nghiệm Xác định nhiệt độ tối ưu enzyme α- amylase glucoamylase Toruzyme Thí nghiệm Xác định pH tối ưu enzyme α- amylase glucoamylase Toruzyme Thí nghiệm Xác định khả hoạt động enzyme ? ?amylase glucoamylase. .. tài xác định điều kiện hoạt động tối ưu động học enzyme α- amylase glucoamylase Toruzyme để làm sở cho nghiên cứu ứng dụng 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài ? ?Xác định điều kiện hoạt động tối ưu động. .. glucoamylase Toruzyme - Thí nghiệm 5: xác định giá trị động học enzyme α- amylase glucoamylase Toruzyme 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu ? ?Xác định điều kiện hoạt động tối ưu động học enzyme αamylase