Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp thực hướng dẫn khoa học ThS Huỳnh Quang Phước, Trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án tốt nghiệp hồn tồn khơng chép kết người khác hình thức Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm đồ án tốt nghiệp Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, người nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hôm Qua bốn năm học tập Trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh em thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian học tập trường suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, nhờ thầy cô trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS Huỳnh Quang Phước, thầy tận tình quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ em để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy phịng thí nghiệm bạn bè quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Tình hình nghiên cứu 4.1 Tình hình nghiên cứu nước 4.2 Tình hình nghiên cứu nước Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự chuyển hóa nitơ 1.1.1 Vai trò nitơ thực vật 1.1.2 Sự hấp thụ đạm thực vật 1.1.2.1 Sự dùng đạm khống thực vật có vài đặc tính đáng ý 1.1.2.2 Sự khử nitrate .10 1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid .10 1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein 12 1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp quang hợp 12 1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên 12 1.1.3.1 Q trình amon hóa 15 1.1.3.2 Quá trình nitrate hóa 16 1.1.3.3 Q trình phản nitrite hóa 17 1.1.3.4 Quá trình cố định nitơ phân tử 17 1.1.3.5 Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử 19 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 1.2 Vi khuẩn Paenibacillus 21 1.2.1 Phân loại 21 1.2.2 Đặc điểm hình thái 21 1.2.3 Sự phân bố Paenibacillus 23 1.2.4 Một số đặc tính khác Paenibacillus 23 1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm 23 1.3.1 Định nghĩa 23 1.3.2 Phân loại 24 1.3.3 Nguyên liệu sản xuất phân bón 25 1.3.3.1 Mật rỉ đường .25 1.3.3.2 Than bùn 27 1.3.4 Quy trình sản xuất 28 1.3.4.1 Quy trình sản xuất tổng quát 28 1.3.4.2 Thuyết minh .29 1.3.5 Các yêu cầu phân bón vi sinh cố định đạm 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu, thiết bị 31 2.1.1 Vật liệu 31 2.1.1.1 Mật rỉ 31 2.1.1.2 Than bùn 31 2.1.1.3 Nguồn phân lập vi sinh vật 31 2.1.2 Thiết bị 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp xác định số tiêu mật rỉ 31 2.2.1.1 Xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS 31 2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường tổng .32 2.2.1.3 Xác định hàm lượng chất khơ hịa tan phương pháp đo độ khúc xạ 32 2.2.2 Phương pháp xác định số tiêu than bùn 32 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 2.2.2.1 Xác định carbon hữu tổng số phương pháp Walkley – Black (TCVN 9294-2012) 32 2.2.2.2 Xác định acid humic acid fulvic (TCVN 8561-2010) 33 2.2.2.3 Xác định N tổng số (TCVN 8557-2010) 33 2.2.2.4 Xác định N hữu hiệu (TCVN 9295-2012) 33 2.2.2.5 Xác định P2O5 tổng số (TCVN 8563 – 2010) 34 2.2.2.6 Xác định P2O5 hữu hiệu (TCVN 8559-2010) 34 2.2.2.7 Xác định K2O tổng số (TCVN 8660-2011) .35 2.2.2.8 Xác định K2O hữu hiệu (TCVN 8662-2011) .35 2.2.2.9 Xác định pH (TCVN 5979-2007) 35 2.2.2.10 Xác định độ ẩm phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi 36 2.2.3 Phương pháp phân tích vi sinh 36 2.2.3.1 Phương pháp phân lập 36 2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 36 2.2.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử 36 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính vi sinh vật 37 2.2.4.1 Định tính nitơ dịch ni cấy phương pháp so màu với thuốc thử Nessler 37 2.2.4.2 Định lượng nitơ dịch nuôi cấy phương pháp Kjeldahl .37 2.2.4.3 Xác định khả tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) vi khuẩn phương pháp Salkowski (Glickmann Dessaux, 1995) .38 2.2.5 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 39 2.2.5.1 Đếm khuẩn lạc 39 2.2.5.2 Xác định mật độ vi sinh vật phương pháp đo mật độ quang 39 2.2.6 Định danh vi sinh vật 39 2.3 Bố trí thí nghiệm 41 2.3.1 Xác số tiêu mật rỉ 42 2.3.2 Xác định số tiêu than bùn 42 2.3.3 Phân lập vi sinh vật 43 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 2.3.4 Xác định hoạt tính vi sinh vật 43 2.3.5 Khảo sát điều kiện lên men 43 2.3.5.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng 44 2.3.5.2 Xác định hàm lượng mật rỉ bổ sung 45 2.3.5.3 Xác định hàm lượng khoáng bổ sung 45 2.3.6 Khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 46 2.3.7 Phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm 47 2.3.7.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật 47 2.3.7.2 Kiểm tra tiêu than bùn 47 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 49 3.1 Kết khảo sát tiêu nguyên liệu 49 3.1.1 Mật rỉ 49 3.1.2 Than bùn 49 3.2 Kết phân lập đặc điểm hình thái, sinh hóa 50 3.2.1 Kết phân lập đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 3.2.2 Tuyển chọn chủng cố định nitơ mạnh 53 3.2.3 Khả tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) vi sinh vật 54 3.2.4 Định danh sinh học phân tử chủng P2 55 3.3 Khảo sát thời gian môi trường tối ưu để lên men thu sinh khối 55 3.3.1 Khảo sát thời gian lên men 55 3.3.2 Khảo sát tỉ lệ mật rỉ bổ sung 56 3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng bổ sung 58 3.4 Kết khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 59 3.5 Kết kiểm tra chế phẩm phân bón sau phối trộn với than bùn 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC A: CÁC CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 35 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt q trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 20 Bảng 1.2 Phân loại vi khuẩn Paenibacillus 21 Bảng 1.3 Ưu nhược điểm chất mang khử trùng không khử trùng 25 Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng rỉ mật mía 26 Bảng 1.5 Thành phần hóa học rỉ đường mía 27 Bảng 1.6 Thành phần hóa học than bùn vùng khác 28 Bảng 2.1 Tên loại thiết bị sử dụng thí nghiệm 32 Bảng 2.2 Các tiêu mật rỉ 42 Bảng 2.3 Các tiêu than bùn 42 Bảng 2.4 Xác định hoạt tính vi sinh vật 43 Bảng 2.5 Xây dựng đường cong tăng trưởng vi sinh vật 44 Bảng 2.6 Mật độ vi sinh vật môi trường bổ sung mật rỉ qua mốc thời gian 45 Bảng 2.7 Mật độ vi sinh vậttrên mơi trường bổ sung khống qua mốc thời gian 46 Bảng 2.8 Mật độ tế bào thay đổi theo độ ẩm 47 Bảng 3.1 Một số tiêu mật rỉ 49 Bảng 3.2 Các tiêu than bùn trước ủ với vi sinh vật 50 Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi sinh vật 51 Bảng 3.4 Kết nhuộm Gram nhuộm bào tử 52 Bảng 3.5 Hàm lượng nitơ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật 54 Bảng 3.6 Khả sinh IAA chủng vi sinh vật 54 Bảng 3.7 Mật độ vi sinh vật mốc thời gian khác môi trường bổ sung mật rỉ 57 Bảng 3.8 Mật độ vi sinh vật mốc thời gian khác mơi trường bổ sung khống 58 Bảng 3.9 Ảnh hưởng độ ẩm đến phát triển vi sinh vật 60 Bảng 3.10 Các tiêu phân bón 61 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Con đường glutamin (sự gia nhập NH3 glutamin) 11 Hình 1.2 Vịng tuần hồn nitơ tự nhiên 14 Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử q trình khử oxy hóa nitơ 19 Hình 1.4 Liên kết bào tử P stellifer trưởng thành với 22 Hình 1.5 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh 29 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành 41 Hình 3.1 Phản ứng màu với thuốc thử Nessler 53 Hình 3.2 Khả tăng trưởng chủng P2 môi trường NB 56 Hình 3.3 Biến đổi mật độ tế bào chủng P2 môi trường qua mốc thời gian môi trường bổ sung mật rỉ 57 Hình 3.4 Biến đổi mật độ tế bào chủng P2 mơi trường bổ sung khống qua mốc thời gian 59 viii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong kinh tế nước ta nay, nơng nghiệp chiếm vị trí quan trọng Một biện pháp hàng đầu để đẩy mạnh sản xuất nơng nghiệp sử dụng phân bón Do nhu cầu xã hội ngày phát triển cao đòi hỏi người sử dụng nhiều biện pháp khác để tăng suất sản lượng sản phẩm Tuy nhiên, đa số nông dân cung cấp nitơ cho trồng dạng phân bón hóa học với hiệu suất thấp, dư lượng chất hóa học loại phân gây ô nhiễm môi trường đất làm đất bị thối hóa, chua hóa, làm cho mơi trường nước mặt nước ngầm tích lũy nhiều NO3-, NO2-, gây tượng phì hóa nước,…Ngồi ra, bón nhiều phân đạm vào thời kỳ thu hoạch làm tăng đáng kể lượng nitơ có sản phẩm mà người sử dụng hàng ngày có hại cho sức khỏe Đồng thời, nồng độ nitrate nước cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe người, đặc biệt trẻ em tháng tuổi Trong đường ruột, nitrate bị khử thành nitrite, nitrite tạo hấp thụ vào máu kết hợp với hemoglobin làm khả chuyên chở oxy máu bị giảm Nitrite nguyên nhân gây ung thư tiềm tàng Vì vậy, việc tìm nguồn phân bón hữu vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học vấn đề cấp thiết Đó lý để sinh viên thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm chất mang than bùn Tình hình nghiên cứu 4.1 Tình hình nghiên cứu nước ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Năm 1896 phân bón vi sinh Noble Hiltner sản xuất Đức đặt tên Nitragin Nitragin loại phân chế tạo vi khuẩn Rhizolium Beijerink phân lập năm 1888 Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho loại thích hợp họ đậu Ở Mỹ sản xuất chế phẩm Nitroculture, Anh sản xuất loại phân Nitrbacterin Tới hầu sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho đậu đặc biệt đậu tương Khả cố định đạm vi khuẩn đạm cố định hội sinh Azospirillum phát từ 1922, vai trị hoạt động cố định đạm vùng rễ hòa thảo biết đến vào năm thập kỷ 70 nhờ việc tìm nơi trú ngụ chúng Năm 1976 phát Azospirillum bên bên bề mặt mô rễ, tạo mối quan hệ cộng sinh với cây, chúng tồn đất vùng rễ, bề mặt rễ Đây lồi vi khuẩn có khả cố định đạm lớn, chúng nhận chất hữu pectin, acid hữu làm nguồn dinh dưỡng để phát triển cố định đạm, đồng thời cung cấp hợp chất nitơ cho chủ Nghiên cứu Puneet (1998) cho thấy phối hợp Azotobacter sp với chủng phân giải phosphate Aspergillus niger làm tăng suất lúa mì tăng 17,7%, Azotobacter tăng 9% Kapoor cho kết tương tự phối hợp chủng Azotobacter sp với chủng phân giải phosphate Bacillus sp., Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng suất lúa, vải lên 10 – 20% Năm 2008, Anelise Beneduzi cộng phân lập số chủng Bacillus Paenibacillus từ cánh đồng lúa miền nam Brazil Việc phân lập vi khuẩn từ đất ôn đới cận nhiệt đới, kết hợp khả cố định đạm với việc sản xuất chất có khả kích thích tăng trưởng thực vật, làm tăng đáng kể suất trồng ngũ cốc Brazil Năm 2013, chế phẩm sinh học Nano-Gro sản xuất công ty Custom Biologicals, Inc Hoa Kỳ độc quyền phân phối Việt Nam công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn MBT Chế phẩm có chứa nhiều loại vi sinh vật có tác dụng tăng cường hệ vi sinh vật có ích đất có lợi cho cây, ức chế lập ... Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm chất mang than bùn Tình hình nghiên. .. vậy, vi? ??c tìm nguồn phân bón hữu vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học vấn đề cấp thiết Đó lý để sinh vi? ?n thực đề tài ? ?Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm? ?? Mục đích nghiên cứu Nghiên. .. 2.3.3 Phân lập vi sinh vật Nhằm tìm chủng vi sinh vật có hoạt tính cố định đạm tốt để sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm, ta tiến hành phân lập vi sinh vật môi trường Ashby Từ phương pháp xác định