Tổng quan về saponin và bước đầu tìm hiểu về saponin trong hạt trà lâm đồng

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến ĐẶT VẤN ĐỀ rCHƯƠNG 1: Trong xã hội đại ngày nay, mà sống người ngày nâng cao, mơi trường ngày nhiễm sản phẩm, hoạt chất có nguồn gốc sinh học, có lợi cho sức khỏe quan tâm phát triển Một số hoạt chất sinh học quan tâm, nghiên cứu ứng dụng nhiều y học nhóm hợp chất saponin Vậy saponin gì? Nguồn thu nhận saponin từ đâu? Có thể nói, nguồn thu nhận saponin phong phú đa dạng, ý, nhận thấy rằng, trang web giới đặc biệt Trung Quốc rao bán sơi sản phẩm saponin trích ly từ hạt trà Vậy sao, nước - nước trồng xuất trà tiếng giới - lại không nghiên cứu, khai thác sản phẩm Saponin trích ly từ hạt trà nhiều nước cơng nhận có ứng dụng nhiều ngành thực phẩm, lĩnh vực đồ uống khả tạo nhũ, tạo bọt tốt Hơn nữa, nay, biết rằng, hạt trà gần phế phẩm ngành công nghiệp trồng trà Kĩ thuật trồng trà hạt dần thay kỹ thuật trồng trà vô tính Do hạt trà thứ phế phẩm, không sử dụng Thời gian gần có cơng ty TNHH XD TM Huỳnh Gia, 37 Gị Cơng, phường 13, quận HCM, rao bán sản phẩm saponin từ trà theo tìm hiểu đơn giản bột xây từ loại hạt trà có nguồn gốc từ Trung Quốc, khơng phải saponin trích ly từ hạt trà Vậy nhà khoa học Việt Nam lại khơng quan tâm đến saponin trích ly từ hạt trà Phải điều kiện thổ nhưỡng mà hạt trà Việt Nam không chứa saponin saponin hạt trà Việt Nam khơng có tác dụng sinh học tốt saponin trích ly từ hạt trà nước khác Với lí đó, tơi định thực đề tài nhằm giải đáp phần thắc mắc Cụ thể đề tài : - Tìm hiểu nhóm hợp chất sinh học saponin - Tìm hiểu nghiên cứu saponin từ hạt trà xanh Lâm Đồng SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ SAPONIN 2.1 Tổng quan saponin [7], [13], [18], [15], [26] Saponin thuật ngữ L.Kofler, nhà hóa học người Áo, đề xuất từ năm 1927 ”Die Saponin”, dùng để nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp thực vật Tiền tố sapo có nghĩa xà phịng; thực tế thường gặp từ “saponification” có nghĩa xà phịng hóa tiếng Anh tiếng Pháp Theo đó, saponin glycosid có trọng lượng phân tử lớn (gồm sapogenin-mạch đường), thể rõ sơ đồ sau: Saponin + Glycon Aglycon Đường Sapogenin Glucose Arabinose Xylose Glucuronic acid Saponin trung tính Saponin axít Steroid Triterpenoids Hình 2.1: Thành phần saponin SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp a GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Một số tính chất saponin: Tạo nhiều bọt bền lắc với nước: có hoạt tính bề mặt cao phân tử saponin có đầu ưa nước đầu kỵ nước Tính chất làm cho saponin giống xà phịng: có tính nhũ hóa tẩy Tính phá huyết: làm vỡ hồng cầu nồng độ lỗng Người ta cho tính phá huyết có liên quan đến tạo phức saponin với cholesterol este cholesterol màng hồng cầu, có nhiều trường hợp số phá huyết khả tạo phức với cholesterol không tỷ lệ thuận với nên phải xét đến ảnh hưởng saponin thành phần khác màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy cấu trúc phần aglycone có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết cịn phần đường có ảnh hưởng đến mức độ phá huyết Hồng cầu động vật khác bị ảnh hưởng khác loại saponin Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt để tính số phá huyết, khơng có máu cừu dùng máu động vật có sừng khác Tính độc với cá số động vật máu lạnh, động vật thân mềm: Tính chất giải thích saponin làm tăng tính thấm biểu mơ đường hơ hấp làm chất điện giải cần thiết Tính tạo phức với cholesterol với chất 3-β-hydroxysteroid khác: Đôi người ta lợi dụng tính chất để tách saponin ngược lại, dùng saponin để tách tinh chế chất 3β-hydroxy steroid khác Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn mửa, lỏng Tuy nhiên, người ta nhận thấy số saponin đủ tính chất trên, ví dụ: Các ginsenosid Nhân sâm Panax ginseng, Glycyrrhizin Cam thảo, soyasaponin có đậu nành lại khơng có tính phá huyết tính phá huyết Sarsaparillosid lồi Kim cang Smilax aristolochiaefolia Jurubin loài cà Solanum paniculatum lại khơng có tính phá huyết khơng có tính tạo phức với Cholesterol SVTH: Võ Ngơ Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Vì vậy, ngày để xác định chắn Saponin người ta dựa vào cấu trúc hóa học chúng (Các tính chất vừa nêu có tính chất sơ xác định) Saponin khó bị thẩm tích có phân tử lớn Các saponin chất quang hoạt, phần lớn sapogenin steroid tả truyền, sapogenin triterpenoid hữu truyền Điểm chảy sapogenin thường cao, từ 200 oC trở lên 300oC b Cảm quan Các saponin thường không màu Trừ trường hợp gluco-alkaloid, saponin khác cho phản ứng màu đặc trưng Các saponin thường dạng vơ định hình Đa số saponin có vị đắng c Tính tan Saponin tan dung mơi có nước Saponin tan chuyên biệt n-butanol bão hịa nước Saponin tan dung mơi hữu phân cực Saponin bị tủa dung dịch acetat chì kiềm, số saponin bị tủa dung dịch acetat chì trung tính Các saponin triterpen polycarboxylic cịn tủa mơi trường acid vô mạnh (HCl, H2SO4…) môi trường amoni sulfat d Phân loại saponin * Trước đây, dựa vào khả tạo tủa môi trường khác nhau, người ta chia saponin thành loại saponin trung tính saponin acid Theo cách chia thì: Saponin trung tính: cho tủa với dung dịch Ba(OH) chì acetat kiềm Saponin acid: tan dung dịch kiềm, cho tủa với dung dịch chì acetat, ammonium sulfat * Ngồi người ta chia saponin thành loại: SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Saponin acid: phân tử có nhóm –COOH Saponin kiềm: phân tử có N, khơng có nhóm –COOH Saponin trung tính * Hiện nay, dựa vào cấu trúc hóa học, người ta chia saponin thành loại chính: saponin triterpen saponin steroid Saponin Saponin Steroid (27C) Saponin Triterpen (30C) Triterpen vòng Triterpen vòng Oleanan Ursan Lupan Hopan Dammaran Lanostan Cucurbitan Spirostan furostan Glyco-alkaloid Spirosolan Solanidan Aminofurostan Hình 2.2: Phân loại saponin e Sự phân bố saponin tự nhiên * Saponin phân bố rộng thực vật (#500 loài/90 họ) Saponin triterpen thường gặp thuộc lớp mầm Saponin steroid thường gặp thuộc lớp mầm – Các họ thường chứa saponin triterpen: + Họ Nhân sâm (Araliaceae) + Họ Cà phê (Rubiaceae) + Họ Đậu (Fabaceae) SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến + Họ Viễn chí (Polygalaceae) + Họ Rau dền (Amaranthaceae) + Họ Bồ (Sapindaceae) + Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) + Họ Cải (Brassicaceae) – Các họ thường chứa saponin steroid: + Họ Hành tỏi ( Liliaceae) + Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) + Họ Cà (Solanaceae) + Họ Kim cang (Smilacaceae) + Họ Củ mài (Dioscoreacea) + Họ Dứa dại (Agavaceae) * Bên cạnh Saponin cịn có số động vật lồi: Hải sâm (Actinopyga agassizi, Holothuria vagabunda, H.polii, H scabra, H leucospilota, H librica, Stichopus japonicus, S chloronotus…) Sao biển, Hải quỳ (Acanthaster planci, Asterina pectinifera, A.forbesi, Patiria miniata, Pisaster ochraceus, P brevispinus, Pycnopodia helianthoides…) Mật vài lồi Bị có chứa saponin 2.2 Nguyên liệu giàu saponin [14], [10] a) Nhân sâm Saponin có mặt nhiều lồi thực vật, nhiên, nói, sâm nguồn nguyên liệu giàu saponin Sâm có chứa saponin mang dược tính cao hiệu Sâm Trung Quốc chứa 15 loại saponin, sâm Mỹ chứa 14 loại saponin, sâm Hình 2.3: Cây nhân sâm SVTH: Võ Ngơ Thu Vân Nhật chứa loại saponin, sâm Hàn Quốc chứa đến 30 loại Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến saponin Sự khác biệt lớn điều kiện địa hình, khí hậu đặc trưng Hàn Quốc, với thời gian trồng sâm Sâm Hàn Quốc nhờ mà có kết cấu tinh vi, giàu mùi vị đậm hương Hiện nay, rễ nhân sâm nhà khoa học xác định biết gần 30 saponin thuộc hai nhóm cấu trúc sau: Cấu trúc nhóm 1: Hình 2.4: Cấu trúc nhóm Cấu trúc phần đường tên saponin thuộc cấu trúc nhóm có rễ sâm: Bảng 2.1: Các saponin thuộc nhóm cấu trúc rễ sâm STT Saponin R1 R2 Gingsenosid-Ra1 -glc -glc -glc6-ara(p)4-xyl Gingsenosid- Ra2 -glc2-glc -glc6-ara(f)2-xyl Gingsenosid- Ra3 -glc2-glc -glc6-glc3-xyl Gingsenosid- Rb1 -glc2-glc -glc6-glc Gingsenosid- Rb2 -glc2-glc -glc6-ara(p) Gingsenosid- Rb3 -glc2-glc -glc6-xyl Gingsenosid- Rc -glc2-glc -glc6-ara(f) Gingsenosid- Rd -glc2-glc -glc Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc6-glc 10 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc6-ara(p) 11 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc6-ara(f) 12 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc 13 Gingsenosid-Rg3 (20 S) -glc2-glc -H 14 Gingsenosid-Rg3 (20 R) -glc2-glc -H 15 Gingsenosid-Rh2 -glc -H 16 Gingsenosid-Rs1 -glc2-glc6-Ac -glc6-ara(p) SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến 17 Gingsenosid-Rs2 -glc2-glc6-Ac -glc6-ara(f) 18 Gingsenosid-R1 -glc2-glc6-Ac -glc6-glc 19 Gingsenosid-R4 -glc2-glc -glc6-glc6-xyl (Ghi chú: glc: glucopyranosyl; Rha: rhamnopyranosyl; Xyl: xylopyranosyl; ara: arabinopyranosyl; Ac: acetyl; Ma: malonyl) Cấu trúc nhóm 2: Hình 2.5: Cấu trúc nhóm Cấu trúc phần đường tên saponin thuộc cấu trúc nhóm có rễ sâm: Bảng 2.2: Các saponin nhóm cấu trúc rễ sâm STT Saponin Gingsenosid Re -H -glc2-rha -glc Gingsenosid Rf -H -glc2-glc -H 20-gluco-gingsenosid Rf -H -glc2-glc -glc Gingsenosid Rg1 -H -glc -glc Gingsenosid Rg2 (20S) -H -glc2-rha -H Gingsenosid Rg2 (20R) -H -glc2-rha -H Gingsenosid Rh1 (20S) -H -glc -H Gingsenosid Rh1 (20R) -H -glc -H Gingsenosid R1 -H -glc2-xyl -glc R1 R2 R3 (Ghi chú: glc :glucopyranosyl; Rha: rhamnopyranosyl; Xyl: xylopyranosyl) SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Saponin thành phần tạo nên giá trị sâm Sự khác biệt mặt giá trị hồng sâm bạch sâm hàm lượng tính chất saponin chứa chúng định Hồng sâm có giá trị bạch sâm hồng sâm chứa nhiều loại saponin mới, thêm nữa, hoạt tính dược học tích cực Thế giới chứng minh nhờ thành phần saponin chứa chúng mà sâm có tác dụng sinh học: - Tăng cường hoạt động não - Chữa lành phòng bệnh tiểu đường - Chữa lành phòng bệnh ung thư máu - Chữa lành phòng bệnh xơ cứng động mạch b) Bồ kết Hiện nay, saponin thường chiết từ bồ kết bồ kết nguồn nguyên liệu giàu saponin Năm 1961 Đỗ Tất Lợi, G Herman I Ciulei chiết saponin từ bồ kết với hiệu suất 10% Năm 1966 tác giả công bố đặc điểm saponin sau: Chỉ số phá huyết 35.000; Sau thủy phân thu aglycon có điểm chảy 291-298oC, xác định thuộc dẫn chất β-amyrin Năm 1967, Nguyễn Đăng Tâm phân lập saponin bồ kết đặt tên boketosid xác định saponin có aglycon acid oleanolic có phần đường glucose + arabinose + xylose Một aglycon saponin thứ hai acid echynocystic Năm 1973, Ngơ Thị Bích Hải tách saponin đặt tên australosid có phần aglycon acid echynocystic, phần đường có hai mạch: mạch nối vào OH- C-3 gồm có D-xylose, Larabinose, D-glucose theo tỉ lệ 2:1:1 Cịn mạch C-28 theo dây nối ester gồm D-xylose, Dgalactose theo tỉ lệ 1:1 c) Tam thất SVTH: Võ Ngô Thu Vân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Ngoài ra, Tam thất nguồn nguyên liệu giàu saponin, thành phần tam thất saponin thuộc nhóm dammaran mà phần aglycon chất protopanaxadiol protopanaxatriol nhân sâm Sau saponin có rễ củ: a) Các saponin có phần aglycon protopanaxadiol: G-Rb1; G-Rb2; G-Rd; Gy-XVII, N-R4; N-Fa b) Các saponin có phần aglycon protopanaxatriol: Hình 2.6: Cây tam thất G-Re; G-Rg1; G-Rg2; G-Rh1; 20Glc-G-Rf; N-R1; N-R2; NR1; NR6 Trong số saponin trên, G-Rb1 có hàm lượng 1,8% G-Rg 1,9% cịn G-Rb2 G-Rc thấp (Chú thích: G= Gingsenosid, Gy: gypenosid, N=notoginsenosid) Các phận khác rễ con, hoa có saponin nhóm dammaran nghiên cứu 2.3 Cấu tạo tính chất số saponin [18], [13], [7] 2.3.1 Saponin triterpen Phần aglycon saponin triterpenoid có khung hydrocarbon với 30 carbon Khung hydrocarbon chia thành nhóm hemiterpen xắp xếp theo qui tắc đầu (trừ vịng C phân nhóm Oleanan; trừ vịng C E phân nhóm Ursan…) Hình 2.7: Phần aglycon saponin triterpen SVTH: Võ Ngô Thu Vân 10 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Chuyển chất cần chiết từ lớp biên vô pha lỏng vào dung mơi cần chiết d Giải thích hướng lựa chọn quy trình [12] Vì theo Khupera Bakhotatze, thành phần hạt trà có hàm lượng dầu tương đối cao: 22,9% → phải tách béo Đồng thời giai đoạn loại bỏ bớt tạp chất tan dung mơi hữu Những dung mơi dùng giai đoạn này: hexan C 4H14; methanol CH4O, Butanol C4H9OH, cloroform CHCl3 Ở dung mơi lựa chọn ether  Saponin tan Methanol butanol dẫn đến saponin bị → không sử dụng hai dung môi  Không dùng hexan chlorofom so với ether hai chất độc nhiều Sau loại chất béo loại tạp, tiến hành trích ly saponin từ bột hạt trà methanol Ở sử dụng methanol mà không sử dụng ethanol saponin tan hai dung mơi nhiệt độ sơi methanol (64,7oC) nhỏ nhiệt độ sôi ethanol (78,3oC) dẫn đến tiết kiệm Dung dịch methanol thu sau trích ly bay methanol để thu lớp cắn có chứa saponin Lớp cắn hòa vào nước chiết với ether để loại tạp Ở sử dụng dung dịch ether giai đoạn loại béo sử dụng dung môi này, nên việc sử dụng ether để loại tạp cho giai đoạn thuận lợi khơng cần phải có thêm loại hóa chất khác Dịch nước chiết thu lắc với butanol bão hòa nước để tiếp tục loại tạp Pha butanol thu sau trình chiết bay dung môi, thu lớp cắn Đem lớp cắn định tính 3.2.3 Khảo sát số thơng số q trình Các thí nghiệm trình khảo sát tiến hành lượng bột hạt trà nặng 80gram SVTH: Võ Ngô Thu Vân 59 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến a Khảo sát ảnh hưởng thông số nhiệt độ đến q trình trích ly: Q trình trích ly loại dầu ether: Vì cấu tạo ống sinh hàn soxhlet ngắn lại không cấu tạo theo kiểu ruột gà, soxhlet lại đặc tủ hút nên lượng ether dễ bị bay Dẫn đến tiến hành trích ly phải kiểm sốt khơng nhiệt độ nước nồi cách thủy đun nóng bình cầu mà cịn kiểm sốt nhiệt độ nước bình làm lạnh ống sinh hàn Chú ý: Ở ta khảo sát nhiệt độ cho lượng nhiệt sử dụng nhất, hạn chế tổn thất dung mơi, đảm bảo chu kì hồn lưu cho thiết bị (5-8 lần/giờ) Vì thiết bị gia nhiệt bếp điện dẫn đến nhiệt độ không ổn định, dao động * Tiến hành: Tiến hành khảo sát nhiệt độ cách ổn định cho nhiệt độ dao động khoảng Tính số lần hoàn lưu thiết bị Cứ lần hoàn lưu tiến hành ghi nhận lại nhiệt độ Nhiệt độ nước để ether chứa bình cầu bắt đầu sơi 50 oC, nhiệt độ sôi ether 34oC Dẫn đến ta tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly bậc nhiệt độ sau Bảng 3.5 Kết khảo sát nhiệt độ trình loại chất béo ether Số lần thí nghiệm Lần Lần Lần 50 – 55 (oC) 55-60 (oC) 60-66 (oC) Số vịng hồn lưu (lần/giờ) 6,5 Nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh (oC) 18-20 Nhiệt độ nước để ether bắt đầu sôi (oC) Khoảng nhiệt độ nước nồi cách o thủy cần khảo sát ( C) 50 Trong trình tiến hành khảo sát, nhiệt độ nước nồi đun lớn 65 oC nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh lớn 20 oC, có tượng bay ether nhận biết mùi thấy có dung dịch ether động thành ống giảm áp nối thơng ngồi SVTH: Võ Ngơ Thu Vân 60 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Ở trì nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh nhỏ 18 oC tốt, nhiên đây, thiết bị làm lạnh thủ công nên tốn đá thời gian * Kết luận: Chọn chế độ nhiệt lần khảo sát thứ 55-60oC  Nhiệt độ nước nồi cách thủy:  Nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh: 18-20oC Q trình trích ly saponin methanol Nhiệt độ sôi methanol 65oC Trong trình trích ly saponin thơ methanol phải ý đảm bảo không bay methanol, tiết kiệm nhiệt, số lần hoàn lưu * Tiến hành Tiến hành tương tự khảo sát nhiệt độ với ether Nhiệt độ nước nồi cách thủy để methanol bắt đầu sôi 73oC Bảng 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ q trình trích ly saponin methanol Số lần thí nghiệm Lần o Lần Lần Lần Nhiệt độ nước methanol bắt đầu sôi ( C) 73 Nhiệt độ nước nồi cách thủy (oC) 73 - 82 83 - 87 89 - 92 92 - 100 Số vịng hồn lưu (lần/giờ) Mất dung môi Nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh (oC) 18-20 * Kết luận: Từ bảng kết ta chọn chế độ nhiệt lần khảo sát thứ Tuy nhiên, đây, chọn chế độ nhiệt lần khảo sát thứ Vì với chênh lệch nhiệt độ nhỏ hai lần thử nghiệm chọn chế độ nhiệt lần lượng nhiệt tiết kiệm so với lần nhỏ Nhưng số vịng hồn lưu vịng/giờ hiệu trích ly cao so với vịng/giờ Vậy chọn chế độ nhiệt lần khảo sát thứ 3: 89-92oC  Nhiệt độ nước nồi cách thủy:  Nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh: 18-20oC SVTH: Võ Ngô Thu Vân 61 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Chú ý: Ở ta trì nhiệt độ nước thiết bị làm lạnh 18-20 oC nhiên, phải lượng đá nhiều trình loại béo ether để trì khoảng nhiệt độ mong muốn b .Khảo sát ảnh hưởng thơng số thời gian đến q trình trích ly: * Phương pháp tiến hành khảo sát: Tiến hành trích ly bình thường với nhiệt độ tối ưu khảo sát trên.Nhưng sau tiếng thay dung môi để khảo sát xem dung môi có đổi màu khơng Nếu dung mơi đổi màu tức q trình chiết chưa kết thúc Nếu dung mơi không đổi màu tức cấu tử cần chiết khơng cịn, kết thúc q trình chiết Q trình trích ly loại dầu ether: Bảng 3.7 Kết khảo sát thời gian trình loại dầu ether Thời gian (giờ) 12 18 Màu dung môi Màu vàng Màu vàng Không màu Từ bảng ta thấy thời gian trích ly tối ưu nằm khoảng 13-18h Tiếp tục tiến hành khảo sát thời gian tối ưu Tiến hành trích ly với nhiệt độ tối ưu, sau 13 giờ, tiến hành thay dung môi lần nhận xét dung môi trước lần thay để tìm thời gian tối ưu Bảng 3.8 Kết khảo sát thời gian tối ưu trình loại dầu ether Thời gian (giờ) 13 14 15 Màu dung môi Màu vàng Màu vàng Không màu * Kết luận: Vậy thời gian tối ưu để kết thúc q trình trích ly loại béo 14h Q trình trích ly saponin từ bột hạt trà methanol: Tiến hành tương tự trình loại chất béo ether Tuy nhiên theo dự đốn hàm lượng saponin hạt trà nhiều so với hàm lượng lipit, nên thời gian trích ly dự đoán ngắn Bảng 3.9: Kết khảo sát thời gian q trình trích ly saponin methanol SVTH: Võ Ngô Thu Vân 62 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Thời gian (giờ) Màu dung môi Màu vàng 12 Màu vàng 18 Không màu Tiếp tục từ khoảng thời gian trên, tiến hành tương tự tìm thời gian tối ưu trình loại dầu ether để tìm điểm thời gian tối ưu cho trình Bảng 3.10: Kết khảo sát thời gian tối ưu trình chiết saponin methanol Thời gian (giờ) 13 14 Màu dung môi Màu vàng Không màu * Kết luận: Vậy thời gian tối ưu để kết thúc q trình trích ly saponin 13 c Khảo sát ảnh hưởng thơng số dung mơi trích ly đến q trình trích ly: Ngun tắc cho dung môi vào thiết bị phải đảm bảo cho lượng dung mơi chảy xuống bình cầu lượng phễu chiết cịn đủ ngập mẫu Q trình trích ly loại dầu ether: Khi tiến hành cho dung mơi vào thiết bị soxhlet thấy để đáp ứng nguyên tắc phải cho khoảng 200ml ether Tuy nhiên ether dễ bay nên cần thêm lượng trừ hao Rót thêm 50ml ether để trừ hao Sau tiến hành chạy soxhlet, khoảng dung môi bị hao hụt nhiều cần phải tiến hành bổ sung thêm 50ml ether, kết sau 14h phải châm thêm lần dung môi Như lượng ether cần cho lần loại béo khoảng 350ml Tiến hành sử dụng lượng dung môi cho trình sau thấy thỏa yêu cầu Kết luận: lượng dung môi ether sử dụng cho lần loại béo 350ml Q trình trích ly saponin methanol Cũng tiến hành tương tự trích ly dầu ether thấy cần cho thêm 50ml methanol trừ hao vào đủ đáp ứng cho trình Vậy lượng methanol tối ưu cho trình 250ml SVTH: Võ Ngơ Thu Vân 63 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Nhận xét: Q trình loại béo ether khơng ổn định Chỉ cần sơ suất nhỏ khiến cho thơng số khơng Vì cấu tạo ống sinh hàn thiết bị sử dụng làm ngưng tụ hết lượng ether bay lên Luôn có thất dung mơi 3.2.4 Kết nghiên cứu a) Kết thu được: Bột hạt trà (80g) + ether Loại béo Chiết soxhlet với MeOH (80g) Bã dược liệu Dịch MeOH Cắn methanol 15,32 (g) Tinh chế Cắn saponin tồn phần 10,87 (g)  Hình 3.15 Kết thực nghiệm Hiệu suất q trình Cắn saponin tồn phần H (%) = = Bột hạt trà 10.87 80 x 100 x 100 = 13.59 % (Với H: hiệu suất q trình trích ly (%) ) SVTH: Võ Ngơ Thu Vân 64 Luận văn tốt nghiệp  GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Mơ tả sản phẩm cuối: Cắn saponin tồn phần thu có màu nâu, cứng Hình 3.16 Cắn saponin thơ tồn phần b) Định tính saponin thơ: 1) Sự tạo bọt [8], [18], [14], [4] Thực nghiệm Cắn saponin thơ thu từ nghiên cứu pha lỗng với gấp đôi lượng nước cất thu dung dịch mẫu Nhỏ giọt dung dịch mẫu vào ống nghiệm có chứa sẵn ml nước cất, lắc mạnh theo chiều dài ống nghiệm phút Kết quả: Có tạo bọt Và cột bọt bền, sau 15 phút mà cột bọt gần không thay đổi Hình 3.17 Cột bọt sau lắc SVTH: Võ Ngơ Thu Vân Hình 3.18 Cột bọt sau lắc 15 phút 65 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Kết luận: Kết chứng tỏ cắn thu có diện hợp chất saponin 2) Xác định loại saponin [18], [14], [4] Thực nghiệm Cho giọt dung dịch saponin thơ hịa nước cất vào ống nghiệm, ống chứa ml HCl 0,1N (có pH=1) ống chứa 5ml NaOH 0,1N (có pH = 13) Lắc mạnh phút để yên quan sát cột bọt Kết quả: Khi cho dung dịch saponin thô vào ống thấy ống có chứa HCl dung dịch ống chuyển sang màu trắng đục Cịn ống nghiệm có chứa dung dịch NaOH chuyển sang màu vàng Sau lắc, xuất ống nghiệm cột bọt cao gần Để lúc sau thấy cột bọt ống có chứa HCl bền Hình 3.19 Chiều cao hai cột bọt sau lắc Kết luận: Saponin cắn thơ thu thuộc nhóm saponin triterpen 3) Sự phá huyết [18], [14], [4] Thực nghiệm Chuẩn bị  Mẫu thí nghiệm máu heo loại firbin  Cách chuẩn bị mẫu tương tự thí nghiệm định tính bột hạt trà SVTH: Võ Ngô Thu Vân 66 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Tiến hành thí nghiệm Nhỏ giọt máu loại firbin lên lam kính quan sát hồng cầu có giọt máu kính hiển vi Sau nhỏ tiếp giọt dung dịch mẫu lên giọt máu lam, dùng đũa khuấy, trộn lẫn hai dịch với Quan sát thay đổi hồng cầu Kết quả: Lượng hồng cầu giảm rõ rệt Sơ kết luận: Có phá hủy hồng cầu rõ rệt 4) Phản ứng màu Liberman-Burchard Thực nghiệm Hóa chất sử dụng  Anhydric acetic Ac2O  Cloroform CHCl3  Acid sulfuric đậm đặc (d=1,84) Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm Cho 1ml Ac2O, CHCl3, dung dịch cắn saponin hòa nước cất vào ống nghiệm thật khô Đặt ống nghiệm nằm nghiêng cố định sau nhẹ nhàng nhỏ acid sulfuric đậm đặc vào chảy theo thành ống nghiệm xuống đáy Kết quả: Khi acid chảy xuống đáy ống nghiệm tạo nên vùng dung dịch màu đỏ gạch đáy ống nghiệm Khoảng 30 giây sau dung dịch ống nghiệm sôi, màu đáy ống nghiệm bị pha lỗng với dung dịch ống nghiệm Hình 3.20 Kết acid sulfuric chảy xuống đáy ống nghiệm SVTH: Võ Ngô Thu Vân 67 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Thí nghiệm  Chuẩn bị cắn saponin thơ thu sau q trình trích ly cốc thủy tinh 100 ml  Lần lượt cho vào cắn 1ml anhydric acetic 1ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan  Nhẹ nhàng nhỏ giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc Nhận xét kết Kết quả: Nhận thấy xuất màu từ nâu đỏ đến tím Hình 3.21 Kết nhỏ acid sulfuric Kết luận: phản ứng dương tính, sơ kết luận saponin thơ thu có saponin triterpen 5) Phản ứng màu với axit sunfuric đậm đặc: Saponin triterpen có khả tạo màu tím tiếp xúc acid sunfuric đậm đặc Thực nghiệm Lấy 2ml dung dịch saponin nước cất cho vào đĩa petri Tiến hành nhỏ giọt acid sulfuric đậm đặc vào Kết quả: acid sulfuric cho vào làm xuất đốm màu đỏ gạch vị trí acid nhỏ xuống Kéo lỗng đốm màu thấy thực chất màu tím SVTH: Võ Ngơ HìnhThu 3.22Vân Đĩa petri chứa dd saponin nhỏ acid sulfuric Hình 3.23 Kéo lỗng đốm màu để nhận xét màu 68 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Kết luận: Trong cắn thô thu có mặt saponin triterpen 6) Phản ứng làm chết cá saponin Thực nghiệm Cho vào cốc thủy tinh lượng nước ngang nhau, sau thả vào cốc cá thuộc loài khác Mã hóa cốc mẫu chuẩn cốc mẫu thí nghiệm Nhỏ giọt dung dịch cắn saponin hịa tan nước cất vào mẫu thí nghiệm Kết quả: Ngay nhỏ saponin vào, thấy cá phản ứng ngay, bơi loạn xạ, có nhảy khỏi cốc Sau phút thấy cá bên cốc thí nghiệm chết, cịn mẫu chuẩn cá khơng Hình 3.24 Cá chết mẫu thí nghiệm Hình 3.25 Cá sống mẫu chuẩn Kết luận: cắn thơ có chứa saponin, saponin có khả làm chết cá 7) Phân tích saponin phổ tử ngoại Từ kết nghiên cứu ta sơ kết luận cắn thơ thu có saponin saponin thuốc nhóm triterpen Tuy nhiên để kết có tính thuyết phục hơn, chúng tơi tiến hành gởi mẫu phân tích trung tâm Dịch Vụ Và Phân Tích Thí Nghiệm số 02 Nguyễn Văn Thủ nhờ Th.S Nguyễn Ngọc Hân phân tích phổ tử ngoại (Vì trung tâm khơng nhận mẫu phân tích nên không nhận phiếu kết quả) Tuy nhiên kết Th.S Nguyễn Ngọc Hân thông báo: chất đem đo có điểm hấp thu cực đại λmax = 310 nm Điều chứng tỏ saponin trà thuộc nhóm saponin triterpenoid SVTH: Võ Ngô Thu Vân 69 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Cơ sở lý thuyết Đa số saponin khơng có nhóm mang màu (chromophore) nên không cho đỉnh hấp thu vùng UV Ngoại trừ số hợp chất có dây nối đôi cho băng hấp thu vùng 205-210 nm Tuy Khi cho tác dụng với tác nhân khử nước mạnh (H 2SO4 đđ), cấu trúc saponin xuất nối đơi Khi chúng tạo màu; đo phổ hấp thu UV Có thể vào phổ UV để phân biệt saponin triterpen với saponin steroid saponin triterpen H2SO4 đậm đặc ln ln có λmax = 310 nm Phổ tử ngoại dùng để định lượng saponin Tham khảo thêm phụ lục D *) Kết luận: Các phản ứng định tính saponin sản phẩm cắn thơ tóm tắt thành bảng sau: Bảng 3.11 Tóm tắt kết định tính saponin cắn thu Phản ứng Tạo bọt Xác định loại saponin Tiến hành giọt cắn saponin hòa tan nước cất + 5ml nước cất Bọt bền 15 phút - giọt dịch cắn saponin hòa tan cột bọt cao nhau, nước cất + 5ml dd HCl 0,1 N SVTH: Võ Ngô Thu Vân Kết cột bọt ống nghiệm 70 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến - giọt dịch cắn saponin hòa tan Phá huyết nước cất + 5ml dd NaOH 0,1 N giọt máu + giọt dịch cắn saponin hòa tan nước cất ml Anhydric acetic Tạo màu 1ml CHCl3 (Liebermann – burchard) Cắn saponin trích ly chứa HCl bền Hồng cầu giảm rõ rệt Màu tím đến nâu đỏ Vài giọt H2SO4 ml dung dịch cắn saponin Tạo màu với acid sulfuric nước cất Màu tím Vài giọt acid sulfuric đậm đặc Cá sống Phản ứng làm chết cá giọt dung dịch cắn saponin hòa tan phút sau cá chết nước cất Phân tích saponin phổ tử ngoại Gởi cắn phân tích λmax = 310 nm Tóm lại, với kết định tính bảng trên, khẳng định: trích ly saponin thơ từ bột hạt trà nhiên có lẽ hiệu suất khơng cao, cịn lẫn nhiều tạp SVTH: Võ Ngô Thu Vân 71 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận kết nghiên cứu saponin hạt trà Saponin hạt chè thuộc loại triterpen thể qua phản ứng đặc trưng phương pháp so màu Khả tạo bọt tốt ứng dụng thực tế y học, thực phẩm, hóa mỹ phẩm… Hiệu suất q trình trích ly 13,59% Kết chấp nhận so với lý thuyết 4.2 Kiến nghị: Do thời gian làm đồ án có hạn, đề tài dừng việc trích ly định tính saponin có mặt hạt trà Nếu đề tài tiếp tục tiến hành tinh chế saponin, đồng thời tiến hành nghiên cứu số tác dụng saponin hạt trà thực phẩm, đặc biệt ứng dụng khả tạo bọt cơng nghệ đồ uống Sau đó, điều kiện cho phép, tiếp tục nghiên cứu tác dụng lâm sàn saponin hạt trà y học: - Tác dụng nhũ hóa, long đàm - Kích thích tuyến nước bọt, tăng khả hấp thục chất - Tác dụng ức chế tế bào ung thư - Kháng viêm Nếu thu kết tốt từ khảo sát tiến hành nghiên cứu ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học vào lĩnh vực y học (thuốc) thực phẩm (thức ăn chức năng) Trong q trình trích ly, ngồi sản phẩm cắn saponin thơ cịn thu lượng dầu béo khoảng 15% bột hạt trà, bã bột hạt trà sau trích ly saponin, vỏ vỏ hạt Nếu có điều kiện, tơi muốn nghiên cứu tận dụng sản phẩm phụ trên: SVTH: Võ Ngô Thu Vân 72 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Thị Ngọc Yến Dầu béo hạt trà nguồn dầu béo quý với hàm lượng chất béo cần thiết cho thể cao, nói dầu béo hạt trà có chất lượng tương đương dầu olive Nên tinh chế, sử dụng loại dầu thực phẩm mỹ phẩm Bã bột hạt trà sau trích ly vỏ hạt trà dùng làm chất đốt Vỏ quả: Trong q trình bảo quản thấy có xuất men, mốc, dẫn đến nghiên cứu ứng dụng làm phân vi sinh Có thể nói quan tâm nghiên cứu mức, hội để hạt trà nước ta sản xuất sản phẩm saponin có hoạt tính sinh học cao hợp chất saponin trích ly từ hạt trà rao bán giới lớn Với giá trị sinh học này, không tận dụng nguồn phế phẩm bị vứt bỏ cách lãng phí mà cịn giúp cho người dân trồng trà có thêm nguồn thu nhập mới, đồng thời nghiên cứu tạo nhiều chất có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe người SVTH: Võ Ngô Thu Vân 73 ... khoảng 11 đến 15% saponin trà, saponin hạt trà trích ly từ bã dầu hạt trà camellia thô bột hạt trà dung môi hữu -Các tiêu saponin hạt trà dạng bột Bảng 3.1: Mô tả tiêu saponin hạt trà dạng bột Chỉ... CHƯƠNG 3: TÌM HIỂU VÀ NGHIÊN CỨU SAPONIN TỪ HẠT TRÀ 3.1 Tình hình nghiên cứu saponin từ hạt trà giới a) Tình hình nghiên cứu saponin từ hạt trà giới [22], [23], [24] Hiện việc nghiên cứu saponin. .. Yến Công thức cấu tạo saponin từ hạt trà Hình 3.5: Cơng thức cấu tạo saponin hạt trà c) Ứng dụng saponin trích ly từ hạt trà [28] - Chất nhũ hóa: chất tạo nhũ saponin hạt trà (TS-80 emulsifier)