Khảo sát ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải thủy sản nồng độ muối cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN/ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ỨNG DỤNG CHỦNG VI KHUẨN PHẢN NITRATE ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN NỒNG ĐỘ MUỐI CAO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ths Huỳnh Văn Thành Sinh viên thực MSSV: 1151110348 : Võ Thị Diệp Thúy Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn khoa học ThS Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp.Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn không chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn đồ án tốt nghiệp TP.HCM, ngày 20 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Võ Thị Diệp Thúy i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến ba mẹ gia đình tạo điều kiện tốt cho em cắp sách đến trường.theo đuổi đường học vấn mà em chọn suốt 16 năm qua Lời thứ hai, cho em gửi lời tri ân chân thành đến thầy Ths Huỳnh Văn Thành Ts Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, bảo suốt thời gian dài làm đồ án để em hồn thành đồ án tốt nghiệp với kết tốt Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh họccùng ban giám hiệu nhà trường tạo điều kiện thuận lợi từ điều kiện học tập, trang thiết bị máy móc em làm việc thực đề tài tốt nghiệp em đạt kết tốt Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Lê Trần Ánh Tuyết, chị Võ Phương Huỳnh bạn lớp 11DSH, người động viên giúp đỡ để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án TP.HCM, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên thực Võ Thị Diệp Thúy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN Chu trình nitơ q trình chuyển hóa nitơ nước thải 1.1.1 Nitơ hợp chất nitơ 1.1.2 Q trình chuyển hóa nitơ nước thải .5 1.1.2.1 Quá trình chuyển hóa nitơ mơi trường nước 1.1.2.2 Quá trình tự làm nguồn nước 1.1.3 1.2 Quá trình khử hợp chất nitơ phương pháp sinh học 1.1.3.1 Chu trình sinh địa hóa nitơ .8 1.1.3.2 Quá trình amon hóa 1.1.3.3 Q trình nitrate hóa 10 1.1.3.4 Quá trình phản nitrate hóa 10 1.1.3.5 Quá trình cố định nitơ 11 Tình hình gây nhiễm nguồn nước thải chứa nitơ .11 1.2.1 Nước sinh hoạt 11 1.2.2 Nước thải công nghiệp 13 1.2.2.1 Nước thải công nghiệp chế biến sữa 16 1.2.2.2 Nước thải công nghiệp sản xuất bia .17 1.2.2.3 Nước thải công nghiệp chế biến thủy sản 18 1.2.3 Nước thải nông nghiệp, chăn nuôi 31 1.2.4 Tác động nước thải chứa nitơ đến môi trường .34 1.2.4.1 Tác động đến môi trường nước 34 1.2.4.2 Tác động đến sức khỏe người 35 iii 1.3 Phương pháp khử nitơ nước thải 37 1.3.1 Phương pháp hóa lý 37 1.3.2 Phương pháp xử lý hóa học 38 1.3.2.1 Phương pháp trao đổi ion .38 1.3.2.2 Phương pháp oxy hóa khử .39 1.3.3 Phương pháp xử lý sinh học 39 1.3.4 Các vấn đề tồn 39 1.4 Các vi sinh vật xử lý nitơ .41 1.4.1 Vi khuẩn nitrate hóa 41 1.4.2 Vi khuẩn phản nitrate hóa .42 1.4.2.1 Pseudomonas stutzeri .44 1.4.2.2 Paracoccus denitrificans 45 1.4.2.3 Bacillus azotoformans 47 1.4.2.4 Thiobacillus denitrificans .48 1.4.2.5 Achromobacter xylosoxidans 49 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .61 2.1 Thời gian địa điểm 61 2.2 Vật liệu-hóa chất- dụng cụ thiết bị thí nghiệm 61 2.2.1 Vật liệu 61 2.2.2 Hóa chất 61 2.2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm .61 2.3 Nội dung nghiên cứu 61 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 61 2.3.2 Nhân giống tăng sinh .62 2.3.3 Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu tiêt diệt Achomobacter xylosoxidans .63 2.3.3.1 Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu tiêu diệt Achomobacter xylosoxidans môi trường LB 63 iv 2.3.3.2 Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu tiêu diệt Achomobacter xylosoxidans môi trường Gitay .64 2.3.3.3 Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu tiêu diệt Achomobacter xylosoxidans môi trường Giltay agar 65 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chlorine đến khả phản nitrate Achromobacter xylosoxidan 66 2.3.5 Kiểm tra khả chịu nồng độ muối Achomobacter xylosoxidan môi trường Giltay 67 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng chlorine muối đến khả phản nitrate Achomobacter xylosoxidans 68 2.3.7 Khảo sát khả xử lý nước thải nồng độ muối chlorine cao mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm 68 2.4 Phương pháp phân tích 70 2.4.1 Phương pháp dựng đường chuẩn 70 2.4.1.1 Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate 70 2.4.1.2 Phương pháp dụng đường chuẩn nitrite 71 2.4.1.3 Phương pháp dựng đường chuẩn amoni 72 2.4.2 Phương pháp định tính NH4+, NO3-, NO2- 73 2.4.2.1 Phản ứng định tính amoni (NH4+): 73 2.4.2.2 Phản ứng định tính nitrite (NO2-): 74 2.4.2.3 Phản ứng định tính nitrate (NO3-): 74 2.4.3 Phương pháp định lượng .76 2.4.3.1 Phương pháp định lượng nitrate (Nguyễn Văn Phước, 2005) .76 2.4.3.2 Phương pháp định lượng NO2- .78 2.4.3.3 Phương pháp định lượng NH4+ 78 2.4.4 Phương pháp xác định COD 79 CHƯƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .82 Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu tiêt diệt Achomobacter xylosoxidans 82 v 3.1.1 Khảo sát nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans môi trường LB Giltay 82 3.1.1.1 Khảo sát nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans môi trường LB 82 3.1.1.2 Khảo sát nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans môi trường Giltay 83 3.1.2 Khảo sát mật độ Chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans môi trường Giltay agar 84 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chlorine đến khả phản nitrate Achromobacter xylosoxidans 86 3.3 Kiểm tra khả chịu muối chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 93 3.4 Khảo sát ảnh hưởng chlorine muối đến khả phản nitrate Achromobacter xylosoxidans 98 3.5 Khảo sát khả xử lý nước thải nồng độ muối chlorine cao mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .110 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CBTS Chế biến thủy sản COD Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand) DO Oxy hòa tan (Dissolved Oxygen) LB Lysogeny broth MBBR Moving bed bioreactor MT Môi trường N2 Khí nitơ NH3 Amoniac NH4+ Amonium NO2- Nitrite NO3- Nitrate Tp Thành phố VSV Vi sinh vật vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần tính chất nước xám nước đen (Almeida nnk, 2000; Eilersen nnk, 1999, Henze, 1997;Sunberg, 1995) 12 Bảng 1.2 Thành phần, tính chất nồng độ chất nước thải sinh hoạt tòa nhà (Trần Ngọc Lân, 2012) 13 Bảng 1.3 Tính chất đặc trưng nước thải số ngành công nhiệp (Nguyễn Thị Lệ Diệu, 1997) 14 Bảng 1.4 Chất lượng nước thải đầu vào hệ thống xử lý nước thải tập trung khu cơng nghiệp (Phạm Đình Đơn, 2005) 15 Bảng 1.5 Thành phần nước thải công nghiệp chế biến sữa (Trần Văn Nhân, 1999) 17 Bảng 1.6 Tính chất đặc trưng nước thải ngành sản xuất Bia (Lương Đức Phẩm, 2005) 18 Bảng 1.7 Thành phần nước thải chế biến thủy sản (Tổng cục mơi trường, 2009) 23 Bảng 1.8 Đặc tính nước thải nhà máy cá khô (Nguyễn Phước Dân, 2008) 25 Bảng 1.9 Thành phần phân tươi số lồi vật ni (Lê Văn Cát, 11/2007) 33 Bảng 1.10 Mức độ ô nhiễm trung bình khoảng nhiễm ao ni cá da trơn phụ thuộc vào mùa ni (Phạm Đình Đơn, 2014) 34 Bảng 1.11 Mức độ ô nhiễm ao nuôi tôm phụ thuộc vào mật độ nuôi (con/m2) (Lê Văn Cát, 11/2007) 34 Bảng 1.12 Tiêu chuẩn hàm lượng nitrate nitrite nước uống số tổ chức (http://www.genome.jp) .37 Bảng 1.13 Các phương pháp xử lý nitơ nước thải 40 Bảng 1.14 Phân loại Achromobacter xylosoxidans 49 Bảng 1.15 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012) 50 Bảng 1.16 Quá trình khử nitrate dị hóa khử nitrate đồng hóa chu trình N vi khuẩn nhân thực ( Walter G Zumft, 1997) 54 viii Bảng 1.17 Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate nitrite hoàn toàn (A) (Michael H Gerardi, 2002) 58 Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chlorine gốc nồng độ khác 64 Bảng 2.2 Các thơng số mơ hình bioreactor xây dựng từ thí nghiệm (Huỳnh Văn Thành, 2013) 69 Bảng 2.3 Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrate 71 Bảng 2.4 Tiến trình dựng đường chuẩn nitrite 72 Bảng 2.5 Tiến trình dựng đường chuẩn amoni 73 Bảng 2.6 Cường độ màu NH4+ - NO2- & NO3- với thuốc thử tương ứng phản ứng định tính 75 Bảng 2.7 Các bước định lượng nitrate .77 Bảng 2.8 Các bước tiến hành định lượng nitrite 78 Bảng 2.9 bước tiến hành định lượng NH4+ 79 Bảng 2.10 bước tiến hành chuẩn bị mẫu COD 80 ix Đồ án tốt nghiệp  Analysis of Variance for nitrite - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares F- P- Square Ratio Value 0.2751 MAIN EFFECTS A:mau khao sat 34.8413 34.8413 1.25 B:thoi gian 49029.4 12257.3 438.93 0.0000 RESIDUAL 670.21 24 27.9254 TOTAL 49734.4 29 mau khao sat Count LS LS Homogeneous Sigma Groups (CORRECTED) Mean doi chung 15 20.7954 1.36444 X duong thi nghiem 15 22.9508 1.36444 X Contrast Sig Differen +/ce doi chung duong - thi Limits -2.15534 3.98252 nghiem  Analysis of Variance for amoni - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Squares Mean F- P- Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:mau khao sat 16.9844 16.9844 0.36 B:thoi gian 15801.1 3950.26 83.25 0.0000 38 0.5553 Đồ án tốt nghiệp RESIDUAL 1138.86 24 TOTAL 16956.9 29 47.4526 (CORRECTED)  Multiple Range Tests for amoni by mau khao sat mau khao sat Count LS Mean thi nghiem doi LS Homogeneous Sigma Groups 15 31.6223 1.77862 X chung 15 33.1272 1.77862 X duong Contrast Sig Differen +/ce doi chung duong - thi Limits 1.50486 5.19145 nghiem  Analysis of Variance for COD - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares F- P- Square Ratio Value 4.48 0.0449 MAIN EFFECTS A:mau khao sat 225333 225333 B:thoi gian 6.04347E7 1.51087E7 300.17 0.0000 RESIDUAL 1.208E6 24 50333.3 TOTAL 6.1868E7 29 (CORRECTED) 39 Đồ án tốt nghiệp mau khao sat Count LS Mean doi chung 15 LS Homogeneous Sigma Groups 3400.0 57.9272 X duong thi nghiem 15 3573.33 57.9272 X Contrast Sig Differenc +/e doi chung duong - thi * Limits -173.333 169.078 nghiem Xây dựng mơ hình bioreactor cho trình phản nitrate chủng Achromotobacter xylosoxidans nước thải chế biến thủy sản  Analysis of Variance for nitrate - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares F- P- Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:mau ks 23285.6 11642.8 16.50 0.0000 B:thoigian 125277 62638.5 88.75 0.0000 RESIDUAL 15528.1 22 705.825 TOTAL 164091 26 Co LS LS Homogeneous unt Mean Sigma Groups (CORRECTED) mau ks thi nghiem doi 38.936 8.85579 X chung 40.1601 8.85579 X duong doi chung am 101.836 8.85579 X 40 Đồ án tốt nghiệp Contrast Sig Differen +/ce doi chung am - doi * Limits 61.6761 25.9732 chung duong doi chung am - thi * 62.9002 25.9732 nghiem doi chung duong - thi 1.22411 25.9732 nghiem  Analysis of Variance for nitrite - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares F- P- Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:mau ks 34.8405 17.4203 0.73 0.4923 B:thoigian 191.676 95.838 4.03 0.0323 RESIDUAL 523.492 22 23.7951 TOTAL 750.008 26 Count LS LS Homogeneous Sigma Groups (CORRECTED) mau ks Mean thi nghiem doi 4.47547 1.62601 X chung 5.98047 1.62601 X chung 7.25478 1.62601 X duong doi am 41 Đồ án tốt nghiệp Contrast Sig Differen +/ce doi chung am - doi Limits 1.27431 4.76892 chung duong doi chung am - thi 2.77932 4.76892 nghiem doi chung duong - thi 1.505 4.76892 nghiem  Analysis of Variance for amon - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Squares Mean F- P- Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:mau ks 1849.75 924.873 19.75 0.0000 B:thoigian 3982.0 1991.0 42.51 0.0000 RESIDUAL 1030.37 22 46.835 TOTAL 6862.12 26 (CORRECTED) mau ks Count LS Mean doi chung LS Homogeneous Sigma Groups 30.3344 2.2812 X duong thi nghiem doi chung 30.6055 2.2812 X 48.0266 2.2812 am 42 X Đồ án tốt nghiệp Contrast Sig Differen +/ce doi chung am - doi * Limits 17.6922 6.69055 chung duong doi chung am - thi * 17.4211 6.69055 nghiem doi chung duong - thi - 6.69055 nghiem 0.27114  Analysis of Variance for cod - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares Square F- P- Ratio Value MAIN EFFECTS A:mau ks 2.63407E6 1.31704E6 14.98 0.0001 B:thoigian 2.52119E7 1.26059E7 143.34 0.0000 RESIDUAL 1.93481E6 22 87946.1 TOTAL 2.97807E7 26 (CORRECTED)  Multiple Range Tests for cod by mau ks mau ks Count LS Mean thi nghiem doi LS Homogeneous Sigma Groups 1244.44 98.8524 X chung 1355.56 98.8524 X chung 1955.56 98.8524 X duong doi 43 Đồ án tốt nghiệp am Contrast Sig Differen +/- doi chung am - doi * ce Limits 600.0 289.925 chung duong doi chung am - thi * 711.111 289.925 nghiem doi chung duong - thi nghiem 44 111.111 289.925 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C Khảo sát nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans môi trường LB Thời gian chlorine (ppm) 10 20 30 40 45 24 Đồ án tốt nghiệp 50 100 200 Khảo sát nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt Achromobacter xylosoxidans mơi trường Giltay Thời gian Chlorine (ppm) 46 Đồ án tốt nghiệp 10 20 50 100 47 Đồ án tốt nghiệp 200 Khảo sát khả xử lý nước thải nồng độ muối chlorine cao mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm Hàm lượng Nitrite Nitrate Thời gian 48 Amoni Đồ án tốt nghiệp (giờ) 24 48 49 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D Giá trị thông số ô nhiễm sở tính tốn giá trị tối đa cho phép nước thải CBTS (QCVN11:2008/BTNMT) TT Thông số Đơn vị Giá trị C A B pH - 6–9 5,5 – BOD5 200C mg/l 30 50 COD mg/l 50 80 Tổng chất rắn lơ lững (TSS) mg/l 50 100 Amoni (tính theo N) mg/l 10 20 Tổng dầu mỡ động, thực vật mg/l 30 60 Clo dư mg/l 10 20 Tổng Coliforms mg/l BOD5 200C mg/l 3.000 5.000 Dụng cụ thiết bị mơi trường thí nghiệm  Dụng cụ:  Chai thủy tinh 100ml  Ống nghiệm  Đèn cồn  Bình định mức 100ml  Ống đong 100ml, 250ml, 500ml  Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml  Bình tam giác: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml  Pipet loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml  Bóp cao su  Đũa thủy tinh  Giá đỡ ống nghiệm 50 Đồ án tốt nghiệp  Đĩa petri: đĩa thủy tinh đĩa nhựa  Micropipet: 100µl, 1000µl  Cuvet thủy tinh  Bông không thấm  Giấy lọc  Giấy đo pH, giấy đo chlorine  Parafine  Thiết bị máy móc:  Máy đo quang phổ  Máy lắc  Tủ cấy vô trùng  Máy nước cất  Tủ hút  Bếp từ, bếp đun  Nồi hấp Autoclave  Tủ sấy  Tủ lạnh  Cân phân tích  Môi trường Giltay (Egorov NS , 1986) Dung dịch A: Asparagine (C4H8N2O3.H2O) 1g KNO3(NaNO3 thay thế) 1g Nước máy 0,25l Dung dịch B: Citric acid 1g KH2PO4 5g MgSO4.7H2O 1g CaCl2.6H2O 0.2g 51 Đồ án tốt nghiệp FeCl2.4H2O vết Nước máy 0,25l Hòa 0.25l dung dịch A vào 0.25l dung dịch B chỉnh pH =7 KOH 10%, định mức 1l  Môi trường LB Trypton 10g/l Yeast 5g/l NaCl KÍCH THƯỚC BỂ, CHIỀU CAO 1g/l 52 ... Achromobacter xylosoxidans xử lý nước thải thủy sản nồng độ muối cao? ?? Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát nồng độ muối chlorine thích hợp để q trình xử lý nitrate chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans nước thải. .. xylosoxidans nước thải thủy sản nồng độ muối cao diễn thuận lợi đạt hiệu cao Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý nước thải thủy sản nồng độ muối cao quy mơ phịng... đến tăng trưởng khả phản nitrate chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans nước thải chế biến thủy sản nồng độ muối, nồng độ chlorine thích hợp để đạt hiệu xử lý nitrate cao khơng tích lũy nitrite