2.1.
Thời gian: đề tài được thực hiện từ 05/03/2015 đến 15/08/2015
Địa điểm: đề tài được thực hiện tại Trung Tâm Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường
Vật liệu-hóa chất- dụng cụ thiết bị thí nghiệm 2.2.
2.2.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn phản nitrate Achomobacter xylosoxidans được kế thừa từ đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản” của Nguyễn Thị Hồng Đào- lớp 08DSH05, Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường, Trường đại học Công nghệ TP. HCM
2.2.2. Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy, tăng sinh vi sinh vật
Môi trường Giltay (Egorov NS , 1986)
Môi trường LB
Cồn 700 và 960
Các hóa chất dùng để định lượng nitrate, nitrite, amon 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Các dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu chính
2.3.
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
62
Hình 2.1. Quy trình tiến hành thí nghiệm 2.3.2. Nhân giống và tăng sinh
Giống Achomobacter xylosoxidans được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4
0C. Vì vậy, khi sử dụng cần hoạt giống bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng môi trường Giltay mới, đặt trong tủ ấm 300 C sau 24-48h. Chủng sau khi
Achomobacter xylosoxidans
Tăng sinh Giữ giống
Khảo sát nồng độ chlorine có thể tiêu diệt được Achomobacter xylosoxidan (trên môi
trường LB, Giltay và Giltay agar) (0, 10, 20, 30, 40, 100, 200)
Xây dựng mô hình bioreactor cho quá trình phản nitrate của chủng Achromotobacter xylosoxidans trên nước thải chế biến thủy sản
Phân tích mật độ, N-NO3-, N-NO2-,
N-NH4+, COD Xác định mật độ
(OD 600 nm)
Phân tích mật độ, N-NO3-, N-NO2-,
N-NH4+ Phân tích mật độ, N-NO3-, N-NO2-,
N-NH4+, COD
Phân tích N-NO3- , N-NO2-, N-
NH4+, COD Khảo sát nồng độ chlorine ảnh hưởng đến khả
năng phản nitrate của chủng Achromotobacter xylosoxidans trên môi trường Giltay
Kiểm tra khả năng chịu nồng độ muối của chủng Achromotobacter xylosoxidans trên
môi trường Giltay
Khảo sát ảnh hưởng của chlorine và muối đến khả năng phản nitrate của chủng Achromotobacter xylosoxidans trên môi
trường Giltay
63
phát triển tốt được cấy chuyền sang môi trường LB lỏng trong bình tam giác. Nuôi ở nhiệt độ phòng, lắc 120 vòng/phút trong 12-24h.
2.3.3. Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu có thể tiêt diệt được Achomobacter xylosoxidans
Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu có thể tiêu diệt được Achomobacter 2.3.3.1.
xylosoxidans trên môi trường LB
Do môi trường LB có thành phần tương tự như nước thải chế biến thủy sản giai đoạn đầu do đó khảo sát nồng độ chlorine trên môi trường LB nhằm mục đích xác định mức độ ảnh hưởng của chlorine đến quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học có bổ sung chủng vi khuẩn Achomobacter xylosoxidans.
Chlorine là một loại hóa chất được sử dụng phổ biến để khử trùng trong các ngành công nghiệp đặc biệt là ngành công nghiệp chế biến thủy sản. Hàm lượng chlorine sử dụng để khử trùng thiết bị, bể, và dụng cụ là 100 – 200 ppm (theo Chi cục Nuôi trồng thủy sản). Dựa trên cơ sở trên, thí nghiệm được tiến hành trên môi trường LB ở điều kiện lắc với các nồng độ chlorine khảo sát lần lượt là 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm (mẫu đối chứng không bổ sung chlorine). Nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn được xác định thông qua lượng sinh khối tự do được đo ở bước sóng 600 nm.
Các bước tiến hành
Pha dung dịch chlorine
Hòa tan Chlorine dạng bột vào nước cất vô trùng. Dung dịch chlorine gốc với nồng độ 4000 ppm. Pha loãng từ dung dịch gốc để được các dung dịch chlorine có các nồng độ 1000 ppm, 800 ppm, 600 ppm, 400 ppm, 200 ppm, 100 ppm.
64
Bảng 2.1. Cách pha dung dịch chlorine gốc các nồng độ khác nhau.
Chuẩn bị môi trường khảo sát thí nghiệm
+ Chuẩn bị môi trường LB và giltay lỏng có pH=6. Thể tích mỗi chai môi trường 8.5ml, hấp tiệt trùng sau đó bổ sung 0,5ml chlorine theo thứ tự như bảng như bảng 2.1 để đạt được các nồng độ chlorine 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm cần khảo sát.
Tăng sinh và cấy khuẩn vào môi trường đã bổ sung chlorine
+ Tiến hành tăng sinh Achomobacter xylosoxidans trong môi trường LB, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ, sau đó xác định sinh khối bằng cách đo OD bước sóng 600nm.
+ Cấy 1ml dịch tăng sinh vào môi trường đã bổ sung chlorine như trên, lắc 200 vòng/ phút. Tiến hành xác định sinh khối tại thời điểm 0 giờ và sau 24 giờ bằng cách đo OD 600nm.
Bố trí thí nghiệm
Số nghiệm thức: 7
Số lần lập lại: 3
Số mẫu thí nghiệm: 21
Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu có thể tiêu diệt được Achomobacter 2.3.3.2.
xylosoxidans trên môi trường Gitay
Môi trường Giltay là môi trường tương tự như nước thải chế biến thủy sản ở giai đoạn sau, thí nghiệm tiến hành trên môi trường Giltay nhằm mục đích xác định sự ảnh hưởng của chlorine đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn để từ kết quả thí
Thể tích dung dịch gốc (ml)
1 1 1 3 1 1 1
Thể tích nước cất(ml) 1 2 4 17 9 19 39
Nồng độ gốc (ppm) 2000 1000 800 600 400 200 100
65
nghiệm trên có thể xác định nồng độ chlorine thích hợp tiêu diệt vi khuẩn Achomobacter xylosoxidans sau xử lý.
Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Giltay ở điều kiện lắc với các nồng độ chlorine bổ sung là 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm (mẫu đối chứng không bổ sung chlorine). Nồng độ chlorine tối thiểu tiêu diệt vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn được xác định thông qua lượng sinh khối tự do được đo ở bước sóng 600 nm.
Khảo sát nồng độ Chlorine tối thiểu có thể tiêu diệt được Achomobacter 2.3.3.3.
xylosoxidans trên môi trường Giltay agar
Với mục đích khẳng định lại nồng độ chlorine có thể tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn ở nước thải đầu ra. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Giltay agar với các nồng độ chlorine sau khi bồ sung vào môi trường lần lượt là : 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm (mẫu đối chứng không bổ sung chlorine).
Quan sát và ghi nhận kết quả sau 48 giờ.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị môi trường khảo sát thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường Giltay có bổ sung 2% agar hấp vô trùng. Bổ sung dung dịch chlorine (tỷ lệ 5%) theo thứ tự như bảng 2.1 vào môi trường thạch ở nhiệt độ 50 – 55 0C để đạt các nồng độ chlorine 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm cần khảo sát. Tiến hành đổ đĩa (15ml/đĩa).
Tăng sinh và cấy khuẩn vào môi trường đã bổ sung chlorine
+ Tiến hành tăng sinh Achomobacter xylosoxidans trong môi trường LB để lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ, sau đó xác định sinh khối bằng cách đo OD bước sóng 600nm. Pha loãng dịch tăng sinh bằng nước muối sinh lý vô trùng đến mật độ 106 cfu/ml. Hút 0,1ml dịch tăng sinh đã pha loãng vào mỗi đĩa môi trường tiến hành cấy trang. Quan sát và đọc kết quả sau 24 giờ.
Bố trí thí nghiệm:
Số nghiệm thức: 7
66
Số lần lập lại: 3
Số mẫu thí nghiệm: 21
2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chlorine đến khả năng phản nitrate của Achromobacter xylosoxidan
Từ kết quả các thí nghiệm trên nhằm xác định sự ảnh hưởng của chlorine đến khả năng phản nitrate của chủng vi khuẩn Achomobacter xylosoxidans tiến hành thí nghiệm trên môi trường Giltay với các nồng độ chlorine 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, ( mẫu đối chứng không bổ sung chlorine) tỷ lệ cấy giống 10% khảo sát ở điều kiện thiếu khí có bổ sung giá thể - điều kiện thích hợp nhất cho quá trình phản nitrate đạt hiệu quả cao (Lê Trần Ánh Tuyết – 2013). Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm: 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ và xác định các chỉ tiêu sau: mật độ vi khuẩn, COD, nồng độ N-NO3- , N-NO2- , N-NH4+. Hiệu quả xử lý được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không tích lũy nitrite và không sinh ra hoặc ít sinh NH+4 . Tốc độ chuyển hóa nitrơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo
Công thức (2.1) (Nguyễn Hoài Hương và cộng sự, 2013):
Vtrung bình = [(N-NO3- đầu+ N-NO2-
+đầu +NH+4 đầu) – (N-NO3- cuối+ N- NO2- cuối+ NH+4 cuối)] / T
Trong đó, N-NO3- cuối, N-NO2- cuối, NH+4 cuối lần lượt là các nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N- NO3- đầu, N-NO2- đầu- NH+4 đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu vào. KgN m-3, T = thời gian chuyển hóa, giờ. Hiệu quả xử lý được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không tích lũy nitrite và không sinh ra hoặc ít sinh NH+4 .
Bố trí thí nghiệm:
Số nghiệm thức: 6×3
Số lần lập lại: 3
Số mẫu thí nghiệm: 54
67
2.3.5. Kiểm tra khả năng chịu nồng độ muối của Achomobacter xylosoxidan trên môi trường Giltay
Dựa vào kết quả thí nghiệm của Lê Trần Ánh Tuyết - 2013, chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có thể tăng trưởng và chuyển hóa nitrate trong điều kiện môi trường có nồng độ muối 3 %, với mục đích kiểm tra khả năng chịu nồng độ muối của Achomobacter xylosoxidan thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Giltay với các nồng độ muối bổ sung 0.5 %, 1 %, 1.5 %, 2 %, 2.5 %, 3 % (mẫu đối chứng không bổ sung muối). Thể tích môi trường 90 ml, tỷ lệ cấy giống 10%, khảo sát ở điều kiện thiếu khí có bổ sung giá thể - điều kiện thích hợp nhất cho quá trình phản nitrate đạt hiệu quả cao (Lê Trần Ánh Tuyết – 2013). Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm: 0, 6, 12, 24, 36, 48 giờ và xác định các chỉ tiêu sau: mật độ vi khuẩn, COD, nồng độ N-NO3- , N-NO2- , N-NH4+. Hiệu quả xử lý được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không tích lũy nitrite và không sinh ra hoặc ít sinh NH+4 . Tốc độ chuyển hóa nitrơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo
Công thức (2.1) (Nguyễn Hoài Hương, 2013):
Vtrung bình = [(N-NO3- đầu+ N-NO2-
+đầu +NH+4 đầu) – (N-NO3- cuối+ N- NO2- cuối+ NH+4 cuối)] / T
Trong đó, N-NO3- cuối, N-NO2- cuối, NH+4 cuối lần lượt là các nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N- NO3- đầu, N-NO2- đầu- NH+4 đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu vào. KgN m-3, T = thời gian chuyển hóa, giờ. Hiệu quả xử lý được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không tích lũy nitrite và không sinh ra hoặc ít sinh NH+4 .
Bố trí thí nghiệm:
Số nghiệm thức: 7 (nồng độ)×6 (khoảng thời gian)
Số lần lập lại: 3
Số mẫu thí nghiệm: 126
68
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chlorine và muối đến khả năng phản nitrate của Achomobacter xylosoxidans
Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Giltay với nồng độ muối và nồng độ chlorine được chọn ra từ kết quả các thí nghiệm trên, ( chlorine được bổ sung vào môi trường sau khi hấp tiệt trùng), mẫu đối chứng âm là môi trường không cấy khuẩn, mẫu đối chứng dương môi trường cơ bản có cấy khuẩn (tỷ lệ cấy giống 10%), khảo sát ở điều kiện thiếu khí có bổ sung giá thể. Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48 giờ và xác định các chỉ tiêu sau: mật độ vi khuẩn, COD, nồng độ N-NO3- , N-NO2- , N-NH4+ . Tốc độ chuyển hóa nitrơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo
Công thức (2.1) (Nguyễn Hoài Hương, 2013):
Vtrung bình = [(N-NO3- đầu+ N-NO2- +đầu +NH+4 đầu) – (N-NO3- cuối+ N- NO2- cuối+ NH+4 cuối)] / T
Trong đó, N-NO3- cuối, N-NO2- cuối, NH+4 cuối lần lượt là các nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N- NO3- đầu, N-NO2-
đầu- NH+4 đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu vào. KgN m-3, T = thời gian chuyển hóa, giờ. Hiệu quả xử lý được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không tích lũy nitrite và không sinh ra hoặc ít sinh NH+4 .
Bố trí thí nghiệm:
Số nghiệm thức: 2 (nồng độ)×5 (khoảng thời gian)
Số lần lập lại: 3
Số mẫu thí nghiệm: 30
2.3.7. Khảo sát khả năng xử lý nước thải nồng độ muối và chlorine cao trên mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm
Để ứng dụng vi khuẩn Achromobacter xylosoxydans vào xử lý nước thải thủy sản nồng độ muối và chlorine cao cần xây dựng mô hình bioreactor thích hợp.
Mô hình chọn dựa trên giá thể bám dính theo kiểu MBBR, các thông số được xây dựng trình bày ở bảng sau:
69
Bảng 2.2. Các thông số mô hình bioreactor xây dựng từ thí nghiệm (Huỳnh Văn Thành, 2013)
STT Tên thông số Thông số
bình thí nghiệm nhỏ
Mô hình bioreactor
1 Chiều cao(cm 6.5 H
2 Đường kính (cm) 4.0 D
3 Thể tích, cm3 (ml) 100 V
4 Giá thể Nhựa plastic từ ống Nhựa plastic từ ống
hút 5 Thể tích hình học (ml) 0.42
6 Chiều cao giá thể(cm) 1.5 1.5
7 Đường kính giá thể(cm) 0.6 0.6
8 Khối lượng giá thể (g) 0.0294 0.0294
9 Khối lượng giá thể thể/bình
5 M
10 Bề mặt bám dính giá thể (m2 /kg)
m2/m3
19.23 1177
19.23
Chọn bình hình trụ, có van lấy mẫu, có kích thước như sau làm mô hình bioreactor.
Thông số kỹ thuật:
H=30.7cm, D= 15.5cm, V= 5793cm3= 5.79l
Cần thính lượng giá thể.
Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường có tỷ lệ phối trộn giữa nước thải với muối ở các nồng độ thích hợp. Tỷ lệ cấy giống 10%, xác định mật độ,
70
hàm lượng COD, nồng độ N-NO3- , N-NO2- , N-NH4+ ở các khoảng thời gian 0, 6, 12, 24, 36, 48 giờ
Mẫu đối chứng không cấy giống, chỉ có môi trường nước thải có bổ sung muối với các nồng độ thích hợp xác định mật độ, hàm lượng COD, nồng độ N-NO3- , N-NO2- , N-NH4+ ở các khoảng thời gian 0, 6, 12, 24, 36, 48 giờ.
Phương pháp phân tích 2.4.
2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn
Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate 2.4.1.1.
Sử dụng dung dịch Nitrate chuẩn để tiến hành dựng đường chuẩn. Dung dịch Nitrate chuẩn (100 àg/ml): hũa tan 0,163 g KNO3 khan (hoặc 0,137 g NaNO3 khan) trong nước cất và định mức đến 1 lít. Cho dung dịch Nitrate chuẩn theo từng thể tích khác nhau vào các cốc 100 ml và cô cạn. Cô cạn đến khi vừa khô nhưng không được cháy vì phản ứng tạo thành nitrophenoldisulfonic acid chỉ xảy ra với muối nitrate ở thể rắn. Khi mẫu đã cô cạn và nguội thì cho vào 1 ml dung dịch PDA (phenol disulfonic acid) và lắc đều cho tan mẫu. Cho thêm 25 ml nước cất và lắc đều. Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính (thử bằng giấy đo pH) cho đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng thì dừng lại. Chuyển dung dịch màu vàng sang bình định mức 100 ml, định mức tới vạch và tiến hành đo độ hấp thu của phức tạo thành ớ bước sóng 410 nm trên máy đo quang.Ghi nhận lại độ hấp thu của mẫu. Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay mẫu thử bằng nước cất.
71
Bảng 2.3. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrate
Hóa chất Các bình định mức số
0 1 2 3 4 5
Thể tích dung dịch Nitrate chuẩn (ml) 0 5 10 15 20 25 Cô cạn mẫu đến khi khô, để nguội
Thể tích dung dịch PDA (ml) 1 1 1 1 1 1
Thể tích nước cất (ml) 25 25 25 25 25 25
Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính Chuyển vào bình định mức 100 ml – định mức tới vạch
Đo độ hấp thu các mẫu chuẩn ở bước sóng 410 nm Độ hấp thu
Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính y = ax +b (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi quy tuyến tính đạt yêu cầu.
Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp.
Phương pháp dụng đường chuẩn nitrite 2.4.1.2.
Sử dụng dung dịch N-NO2 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NO2 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ. Dung dịch N-NO2 lưu trữ (1 ml
= 250 àg N-NO2): hũa tan 1,232 g N-NO2 trong nước cất và định mức đến 1 lớt.
Dung dịch N-NO2 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ, sử dụng 2ml dung dịch N-NO2 lưu trữ rồi thêm nước cất cho đến 1 lít. Cho dung dịch chuẩn N- NO2 theo từng thể tích khác nhau và bổ sung lượng nước cất cho đủ 25 ml vào các cốc 100 ml. Thêm vào mỗi cốc 0,5 ml dung dịch EDTA và 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic. Sau đó đợi khoảng 10 phút rồi cho vào mỗi cốc 0,5 ml dung dịch naphthylamine và 0,5 ml đệm acetate. Đợi khoảng 20 phút rồi tiến hành đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 520 nm. Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính
72
đến độ hấp thu của mẫu trắng chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay mẫu thử bằng nước cất.
Bảng 2.4. Tiến trình dựng đường chuẩn nitrite
Hóa chất Các cốc mẫu
0 1 2 3 4 5
Thể tích dung dịch N-NO2 chuẩn (ml) 0 2,5 5 7,5 10 12,5
Thể tích nước cất (ml) 25 22,5 20 17,5 15 12,5
Thể tích dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thể tích dung dịch acid sulfanilic
(ml)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Đợi 10 phút
Thể tích dung dịch naphthylamine 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thể tích dung dịch đệm acetate 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Đợi 20 phút
Đo độ hấp thu các mẫu chuẩn ở bước sóng 410 nm Đo hấp thu
Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp.
Phương pháp dựng đường chuẩn amoni 2.4.1.3.
Sử dụng dung dịch N-NH3 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NH3 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NH3 lưu trữ.
Dung dịch lưu trữ N-NH3 (1 ml = 1 mg = 1000 àg N-NH3). Hũa tan 3,819 g NH4Cl trong nước cất và định mức lên đến 1 lít.