Tách dòng và biểu hiện Cecropin trong các hệ Vector khác nhau

Tách dòng và biểu hiện Cecropin trong các hệ Vector khác nhau Tách dòng và biểu hiện Cecropin trong các hệ Vector khác nhau Tách dòng và biểu hiện Cecropin trong các hệ Vector khác nhau luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Ngô Thị Hà TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CECROPIN TRONG CÁC HỆ VECTOR KHÁC NHAU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình kháng kháng sinh 1.1.1 Thực trạng kháng kháng sinh 1.1.2 Nguyên nhân giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh 1.2 Peptide kháng khuẩn (AMPs) 1.2.1 Giới thiệu chung AMPs 1.2.1.1 Hoạt tính sinh học AMPs 1.2.1.2 Sự đa dạng AMPs 1.2.1.3 Tiềm ứng dụng AMPs 1.2.2 Peptide kháng khuẩ n tích điện dƣơng (CAMPs) cecropin 10 1.2.2.1 Giới thiệu chung CAMPs 10 1.2.2.2 Peptide kháng khuẩn cecropin 11 1.2.2.2.1 Các đặc trưng cấu trúc cecropin 11 1.2.2.2.2 Đặc điểm bật cecropin 13 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.2.2.3 Tiềm ứng dụng tình hình nghiên cứu cecropin 19 1.2.2.2.4 Các phương pháp thu nhận cecropin 20 1.3 Sản xuất cecropin theo đường tái tổ hợp 21 1.3.1 Lựa chọn hệ thống tế bào biể u hiêṇ 21 1.3.2 Lựa chọn hệ thống vector biểu 22 1.3.3 Tối ƣu hóa điều kiện biểu 25 1.3.4 Tinh cecropin tái tổ hợp 25 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên liệu 28 2.1.1 Các hệ vector 28 2.1.2 Các chủng vi khuẩn 28 2.1.3 Các cặp mồi 29 2.1.4 Gel sắc ký lực Glutathione Sepharose 4B, Ni-NTA agarose 29 2.1.5 Các hóa chất thiết bị 30 2.2 Phương pháp 31 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 31 2.2.1.1 Tách dòng (subclone) gen cecropin từ vector nhân dòng sang vector biểu 32 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 2.2.1.2 Biểu cecropin dạng protein dung hợp 33 2.2.1.3 Tinh cecropin dung hợp 34 2.2.1.4 Sử dụng protease để thu nhận cecropin 35 2.2.2 Tách chiết plasmid phƣơng pháp biến tính kiềm 35 2.2.3 Xử lý ADN với enzyme giới hạn 36 2.2.4 Biến nạp phƣơng pháp sốc nhiệt 37 2.2.5 Phƣơng pháp thẩm tách 37 2.2.6 Phƣơng pháp đo nồng độ protein 38 2.2.7 Phƣơng pháp điện di 38 CHƢƠNG - KẾT QUẢ 40 3.1 Tách dòng (subclone) chuyển gen cecropin vào vector biểu 40 3.1.1 Chuyển gen cecH cecN sang vector pBS 40 3.1.2 Thiết kế vector biểu pGEX-cecropin 42 3.1.3 Thiết kế vector biểu pET-28a-cecropin 44 3.1.4 Thiết kế vector biểu pET-32b-cecropin 45 3.2 Biểu cecropin tái tổ hợp 48 3.2.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu cecropin dung hợp 48 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 3.2.2 Xử lý cặn tế bào thu nhận cecropin dung hợp dạng tan 55 3.2.3 Kết tinh GST-cecropin, Trx-cecropin 57 3.2.4 Kết xử lý cecropin dung hợp GST-cecropin Trx-cecropin với protease 61 CHƢƠNG 4-THẢO LUẬN 65 4.1 Khả biểu cecropin dung hợp phụ thuộc vào hệ thống biểu 65 4.2 Trạng thái biểu cecropin phụ thuộc vào đuôi dung hợp 66 4.3 Phương pháp thu nhận cecropin dung hợp dạng hòa tan cách thức tinh ảnh hưởng tới hiệu suất tinh 68 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Các loại AMPs tương tự AMPs sản xuất thương mại Bảng Một số sản phẩm từ CAMPs công ty sản xuất phát triển phục vụ điều trị bệnh 10 Bảng Trình tự axit amin số cecropin 12 Bảng Đặc điểm hệ thống vector biểu 25 Bảng Thông tin mồi dùng nghiên cứu 29 Bảng Thành phầ n của mô ̣t phản ứng xử lý với enzyme giới ̣n 36 Bảng Điều kiện biểu cecropin tái tổ hợp 48 Bảng Điều kiện tối ưu biểu GST-cecropin 51 Bảng Điều kiện tối ưu biểu Trx-cecropin chủng E coli BL21 (DE3) 54 Bảng 10 Nồng độ protein Trx-cecH Trx-cecN 63 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Lịch sử phát thuốc kháng sinh Hình Cấu trúc cecropin A Hyalophora cecropia phân tích khối phổ cộng hưởng từ 13 Hình Một số mơ hình tương tác cecropin với màng tế bào vi sinh vật 15 Hình Các đích tác động khác cecropin ngồi màng tế bào 16 Hình Hoạt tính cecropin B lên tế bào ung thư bàng quang 18 Hình Hình thái học tế bào BEL-7402 xử lý với cecropin nồng độ khác 18 Hình Các hệ thống biểu protein tái tổ hợp 21 Hình Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ (%) đuôi protein dung hợp (Tag) sử dụng để biểu AMPs E coli 24 Hình Sơ đồ nghiên cứu 32 Hình 10 Sơ đồ thiết kế hệ thống vector biểu cecropin 33 Hình 11 Sơ đồ bước tinh cecropin dung hợp 34 Hình 12 Điện di kết PCR nhân gen cecH cecN từ pJET1.2-cecH pJET1.2-cecN gel agarose 2% 40 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 13 Điện di kết tinh cecH, cecN gel agarose 2% (A) vector pBS gel agarose 1% (B) sau xử lý với XbaI XhoI 41 Hình 14 Điện di kết sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pBS-cecH pBS-cecN với cặp mồi vector gel agarose 2% (A), cắt sản phẩm PCR với enzyme XbaI gel polyacrylamide 12% (B C) 41 Hình 15 Điện di kết PCR nhân gen cecH, cecN từ pBS-cecH, pBS-cecN (A); cecT từ pCR2.1-cecT (B) gel agarose 2% 43 Hình 16 Điện di kết sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pGEX-cecropin với cặp mồi của vector (A) của gen cecropin (B) gel agarose 2% 44 Hình 17 Điện di kết sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET-28acecropin gel agarose 1% 45 Hình 18 Điện di kết tinh cecH, cecN (A) cecT (B) gel agarose 2% pET-32b (C) gel agarose 1% sau xử lý với NcoI EcoRI 46 Hình 19 Điện di kết sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET-32bcecropin với cặp mồi của vector gel agarose 1% (A, B, C) với cặp mồi của gen cecropin gel agarose 2% (D) 47 Hình 20 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-cecH gel SDS-PAGE 10% 49 Hình 21 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-cecN gel SDS-PAGE 10% 49 Hình 22 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli mang vector pGEXcecT gel SDS-PAGE 10% 50 Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 23 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-cecN gel SDS-PAGE 10% 50 Hình 24 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) (A) E coli JM109 (B) mang vector pGEX-cecropin điều kiện biểu tối ưu gel SDS-PAGE 10% 51 Hình 25 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pET-28a-cecH (A) pET-28a-cecN (B) điều kiện biểu tối ưu gel SDS-PAGE 10% 52 Hình 26 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pET-32b-cecH pET-32b-cecN gel SDS-PAGE 12% 53 Hình 27 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pET-32b-cecT gel SDS-PAGE 12% 54 Hình 28 Kết điện di protein tổng số tế bào E coli JM109 mang vector pET-32b-cecH pET-32b-cecN gel SDS-PAGE 12% 55 Hình 29 Kết điện di protein tổng số sau xử lý khơng biến tính protein dung hợp cecH: GST-cecH (A), His+GST-cecH (B) gel SDS-PAGE 10% TrxcecH (C) gel SDS-PAGE 12% 56 Hình 30 Kết điện di protein tổng số sau xử lý biến tính protein dung hợp GST-cecH với SDS (A), GST-cecH với ure (B), His+GST-cecH với ure (C) biểu chủng E coli BL21 (DE3) gel SDS-PAGE 10% 57 Hình 31 Kết điện di phân đoạn tinh protein dung hợp GST-cecH biểu chủng E coli BL21 (DE3) sau xử lý biến tính với SDS 0.5% (A) sau xử lý ure M (B) theo phương pháp tinh biến tính gel SDS-PAGE 10% Ngô Thị Hà 58 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 32 Kết điện di phân đoạn tinh protein dung hợp GST-cecH biểu chủng E coli BL21 (DE3) (A), chủng E coli JM109 (B) sau xử lý biến tính với ure M theo phương pháp tinh khơng biến tính gel SDS-PAGE 10% 59 Hình 33 Kết điện di phân đoạn tinh protein dung hợp Trx-cecH (A) Trx-cecN (B) biểu chủng E coli BL21 (DE3) gel SDS-PAGE 12% 60 Hình 34 Kết điện di phân đoạn tinh protein dung hợp Trx-cecT biểu chủng E coli BL21 (DE3) gel SDS-PAGE 12% 60 Hình 35 Kết điện di xử lý GST-cecH với thrombin gel SDS-PAGE 10% 62 Hình 36 Kết điện di kiểm tra khả trở trạng thái cặn Trx-cecH sau thẩm tách (A) sau xử lý với enterokinase (B) gel SDS-PAGE 12% 63 MỞ ĐẦU Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa chủ đề “Chống kháng kháng sinh: khơng hành động hơm nay, khơng cịn thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đe dọa toàn cầu Chống kháng Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bondos S E., Bicknell A (2003), “Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification”, Analytical Biochemistry, 316, pp 223-231 Breithaupt H (1999), “The new antibiotics”, Nature Biotechnology, 17, pp 11651169 Brogden K A (1992), “Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum”, Infection and Immunity, 60, pp 5182-5189 Brogden K A (2005), “Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?”, Nature, 3, pp 238-250 10 Brogden K A., Ackermann M., McCray P B., Jr., Tack B F (2003), “Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences”, International Journal of Antimicrobial Agents, 22, pp 465-478 11 Brown K L., Hancock R E W (2006), “Cationic host defense (antimicrobial) peptides”, Current Opinion in Immunology, 18, pp 24-30 12 Bulet P., Charlet M., Hetru C (2003), Innate Immunity, Humana Press, Totowa, pp 89-107 13 Bulet P., Stöcklin R (2005), “Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation”, Protein and Peptide Letters, 12, pp 3-11 14 Bulet P., Stöcklin R., Menin L (2004), “Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates”, Immunological Reviews, 198, pp 169-184 15 Callaway J E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S P (1993), “Modification of the C terminus of cecropin is essential for broad-spectrum antimicrobial activity”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 37(8), pp 1614-1619 Ngô Thị Hà 84 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 16 Chen Y Q., Zhang S Q., Li B C., Qiu W., Jiao B., Zhang J., Diao Z Y (2008), “Expression of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using two fusion partners”, Protein Expression and Purification, 57, pp 303-311 17 Cromwell M E M., Hilario E., Jacobson F (2006), “Protein aggregation and bioprocessing”, The AAPS Journal, 8(3), pp E572-E579 18 Fei D., Wei X., Xueyin D., Xianxiu X (1999), “The terminal structure plays an important role in the biological activity of cecropin CMIV”, Science in China, 42(5), pp 494-500 19 Ganz T (1999), “Defensins and host defense”, Science, 286, pp 420-421 20 Ganz T (2003), “The role of antimicrobial peptides in innate immunity”, Integrative and Comparative Biology, 43, pp 300-304 21 Hancock R E W (1997), “Peptide antibiotics”, Lancet, 349, pp 418-422 22 Hancock R E W., Sahl H G (2006), “Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies”, Nature Biotechnology, 24(12), pp 15511557 23 Holak T A., Engstrom A., Kraulis P J., Lindeberg G., Bennich H., Jones T A., Gronenborn A M., Clore G M (1988), “The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study”, Biochemistry, 27(20), pp.7620-7676 24 Hong R W., Shchepetov M., Weiser J N., Axelsen P H (2003) “Transcriptional profile of the Escherichia coli response to the antimicrobial insect peptide Cecropin A”, Antimicrobia agents and Chemotherapy, 47(1), pp 1-6 Ngô Thị Hà 85 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 25 Hongbiao W., Baolong N., Mengkui X., Lihua H., Weifeng S., Zhiqi M (2005), “Biological activities of cecropin B-thanatin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 66(6), pp 382-386 26 Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman H G (1982), “Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and fourminor antibacterial components from cecropia pupae”, European Journal Biochemistry, 127, pp 207-217 27 Jan P S., Huang H Y., Chen H M (2010), “Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide Cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases”, Applied and Environmental Microbiology, 76(3), pp 769-775 28 Jenssen H., Hamill P., Hancock R E W (2006), “Peptide antimicrobial agents”, Clinical microbiology reviews, pp 491-511 29 Jin F., Xu X., Zhang W., Gu D (2006), “Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 49(1), pp 39-46 30 Kamysz W., Okrój M., Lukasiak J (2003), “Novel properties of antimicrobial peptides”, Acta Biochimica Polonica, 50(2), pp 461-469 31 Kang C S., Son S Y., Bang I S (2008), “Biologically active and C-Amidated HinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli”, The Journal of Microbiology, 46(6), pp 656-661 32 Li L., Wang J X., Zhao X F., Kang C J., Liu N., Xiang J H., Li F H., Sueda S., Kondo H (2005), “High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 39, pp 144-151 Ngô Thị Hà 86 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 33 Li Y (2009), “MINIREVIEW Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 54, pp 1-9 34 Liang Y., Wang J X., Zhao X F., Du X J., Xue J F (2006), “Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly (Musca domestica), and its expression in Escherichia coli”, Developmental and Comparative Immunology, 30, pp 249-257 35 Liu Z., Zhang F., Cai L., Zhao G., Wang B (2003), “Studies on the properties of Cecropin-XJ expressed in yeast from Xinjiang silkworm”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 43(5), pp 635-641 36 Lu X M., Jin X B., Zhu J Y., Mei H F., Chu F J., Wang Y., Li X B (2010), “Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(6), pp 2169-2178 37 McDermott A M (2004), “Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface”, Ocul Surf., 2(4), pp 229-247 38 Mookherjee N., Hancock R E W (2007), “Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections”, Cellular and molecular life sciences, 64(7-8), pp 922-933 39 Melo M N., Ferre R., Castanho M A (2009), “Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concentrations”, Nature Reviews, Microbiology, 7, pp 245-250 40 Mercado-Pimentel M E., Jordan N C., Aisemberg G O (2002), “Affinity purification of GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression”, Protein Expression and Purification, 26, pp 260-265 Ngô Thị Hà 87 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 41 Moore A J., Beazley W D., Bibby M C., Devine D A (1996), “Antimicrobial activity of cecropins”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 37, pp 1077-1089 42 Moore A J., Devine D A., Bibby M C (1994), “Preliminary experimental anticancer activity of cecropins”, Peptide research, 7(5), pp 265-269 43 Nakajima Y., Qu X.M., Natori S (1987), “Interaction between liposomes and sarcotoxin IA, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, The Journal of Biological Chemistry, 262, pp 1665-1669 44 Pryor K D., Leiting B (1997), “High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein double-affinity fusion system”, Protein Expression and Purification, 10, pp 309-319 45 Sallum U W., Chen T T (2008), “Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the AMPs Cecropin B”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 52(9), pp 3006-3012 46 Sambrook J., Russel D W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Habor laboratory Press, New York 47 Sarmasik A., Warr G., Chen T T (2002), “Production of transgenic Medaka with increased resistance to bacterial pathogens”, Marine Biotechnology, 4, pp 310-322 48 Sato H., Feix J B (2006), “Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides”, Biochimica et Biophysica Acta, 1758, pp 1245-1256 49 Schmitt P., Mercado L., Díaz M., Guzmán F., Arenas G., Marshall S H (2008), “Characterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide (CECdir-CECret) from inclusion bodies after expression in Escherichia coli”, Peptides, 29, pp 512-519 Ngô Thị Hà 88 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 50 Serón J M., Contreras-Moreno J., Puertollano E., Cienfuegos G A., Puertollano M A., Pablo M A (2010), “The antimicrobial peptide cecropin A induces caspase-independent cell death in human promyelocytic leukemia cells”, Peptides, 31, pp 1494-1503 51 Shahravan S H., Qu X., Chan I., Shin J A (2008), “Enhancing the specificity of the enterokinase cleavage reaction to promote efficient cleavage of a fusion tag”, Protein Expression and Purification, 59(2), pp 314-319 52 Shen L., Ding M., Zhang L., Jin F., Zhang W., Li D (2010), “Expression of Acc-Royalisin gene from Royal Jelly of Chinese Honeybee in Escherichia coli and its antibacterial activity”, Journal of agricultural and food chemistry, 58, pp 2266-2273 53 Shen Y., Lao X G., Chen Y., Zhang H Z., Xu X X (2007), “High-level expression of cecropin X in Escherichia coli”, International Journal of Molecular Sciences, 8, pp 478-491 54 Shin S Y., Kang J H., Hahm K S (1999), “Structure-antibacterial, antitumor and hemolytic activity relationships of cecropin A-magainin and cecropin A-melittin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 53(1), pp 82-90 55 Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H G (1981), “Sequencec and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity”, Nature, 292, pp 246-248 56 Steinmetz E (2011), “Expresso® Cloning and Expression Systems: Expressioneering™ Technology streamlines recombinant protein expression”, Nature methods, 8(6), pp iii-iv 57 Strominger J L (2009), “Animal Antimicrobial Peptides: Ancient Players in Innate Immunity”, Journal of Immunol, 182, pp 6633-6634 Ngô Thị Hà 89 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 58 Suttmann H., Retz M., Paulsen F., Harder J., Zwergel U., Kamradt J., Wullich B., Unteregger G., Stöckle M., Lehmann J (2008), “Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells”, BioMed Central Urology, pp 1-7 59 Tian Y., Zhang J., Chen Z., Peng T., Xu X., Jiang W., An J (2006), “Expression, purification of DENV-2 nonstructural protein (NS3) and production of the polyclonal antibody for NS3”, Dengue Bulletin, 30, pp 146-156 60 Ueno S., Kusaka K., Tamada Y., Minaba M., Zhang H., Wang P C., Kato Y (2008), “Anionic C-terminal proregion of Nematode antimicrobial peptide Cecropin P4 precursor inhibits antimicrobial activity of the mature peptide”, Bioscience Biotechnology Biochemistry, 72(12), pp 3281-3284 61 Wachinger M., Kleinschmidt A., Winder D., Pechmann N.V., Ludvigsen A., Neumann M., Holle R., Salmons B., Erfle V (1998), “Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus by suppressing viral gene expression”, Journal of General Virology, 4, pp 731-740 62 Wakabayashi H., Takase M., Tomita M (2003), “Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin”, Current Pharmaceutical Design, 9(16), pp 1277- 1287 63 Wilcox S (2004), “The new antimicrobials: Cationic peptides”, BioTeach Journal, 2, pp 88-91 64 Xiaobao J., Hanfang M., Xiaobo L., YanMa, Ai-hua Z., Yan W., Xuemei L., Fujiang C., Qiang W., Jiayong Z (2010), “Apoptosis-inducing activity of the antimicrobial peptide cecropin of Musca domestica in human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 and the possible mechanism”, Acta Biochim Biophys Sin, pp 259-265 Ngô Thị Hà 90 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Xie W., Qiu Q., Wu H., Xu X (1996), “Expression of cecropin CMIV fusion 65 protein in E coli under T7 promoter”, Biochemistry and molecular biology international, 39(3), pp 487-492 66 Xu X., Jin F., Yu X., Ji S., Wang J., Cheng H., Wang C., Zhang W (2007), “Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide, cecropin, from Escherichia coli”, Protein Expression and Purification, 53, pp 293-301 67 Yamada K., Nakajima Y., Natori S (1990), “Production of recombinant sarcotoxin UA in Bombyx mori cells”, Biochemistry Jounal, 272, pp 633-636 68 Yang W., Cheng T., Ye M., Deng X., Yi H., Huang Y., Tan X., Han D., Wang B., Xiang Z., Cao Y., Xia Q (2011), “Functional Divergence among Silkworm Antimicrobial Peptide Paralogs by the Activities of Recombinant Proteins and the Induced Expression Profiles”, PloS One, 6(3), pp e18109 Yu F., Wang J., Zhang P., Hong Y., Liu W (2010), “Fusion expression of 69 cecropin B-like antibacterial peptide in Escherichia coli and preparation of its antiserum”, Biotechnology Letters, 32, pp 669-673 Zasloff M (2002), “Antimicrobial peptides of multicellular organisms”, 70 Nature, 415, pp 389-395 Trang Web 71 http://cancer.med.unc.edu/vandykelab/protocols/miscellaneous/dialysis_tubing_ preparation.pdf 72 http://history1900s.about.com/od/medicaladvancesissues/a/penicillin.htm 73 http://www.blueskybiotech.com/cellCulture-insectExp.html 74 http://www.globeimmune.com/technology/ Ngô Thị Hà 91 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 75 http://www.historylearningsite.co.uk/alexander_fleming_and_penicillin.htm 76 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Protein-Expression-Systems-andVectors/Protein-Expression-Systems.html 77 http://www.nhandan.com.vn/cmlink/nhandandientu/thoisu/khoa-hoc/khoa-hc/bao-ng-tinh-tr-ng-khang-thu-c-khang-sinh-1.292643#y2iCFxHSBTzz 78 http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols- and-applications-guide/protein-expression/ 79 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ 80 www.who.int/world-health-day/2011/presskit/WHD2011-QA-EN.pdf PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ vector sử dụng Ngô Thị Hà 92 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Ngô Thị Hà 93 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Ngô Thị Hà 94 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Ngô Thị Hà 95 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Phụ lục Thông tin chủng vi khuẩn E coli sử dụng DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYAargF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ– BL21 (DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene ind1 sam7 nin5]) JM109 Ngô Thị Hà 96 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK+) Phụ lục Thành phần gel cô 5% gel tách 10%, 12% dùng điện di protein SDS-PAGE Thể tích (ml) Thành phần Gel 5% Gel tách 10% Gel tách 12% H2O 0.680 1.52 1.28 Tris-HCl M, pH 6.8 0.130 0 Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8 1.04 1.04 Bis-acrylamide 30% 0.170 1.36 1.6 SDS 10% 0.010 0.040 0.040 APS 10% 0.010 0.040 0.040 TEMED 0.002 0.005 0.005 Tổ ng số 4 Phụ lục Các cơng trình cơng bố có liên quan đến luận văn N T Ha, P A T Duong, N T T Huong, V T T Lan (2010), “Expression and antibacterial activities of recombinant cecropin”, VNU Journal of Science, 26 (4S), pp 512-517 Ngô Thị Hà 97 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 N T Ha, N T T Huong, P A T Duong, V T T Lan (2011), “Expression and purification of fusion His-cecropin H and His-cecropin N in Escherichia coli”, VNU Journal of Science, 27 (2S), pp 151-156 N T T Huong, N T Ha, V T T Lan (2011), “Cloning and expression of cecropin cDNA isolated from Bombyx mori”, VNU Journal of Science, 27 (2S), pp 181-186 Ngô Thị Hà 98 K18 Sinh học ... sang vector pBS 40 3.1.2 Thiết kế vector biểu pGEX -cecropin 42 3.1.3 Thiết kế vector biểu pET-28a -cecropin 44 3.1.4 Thiết kế vector biểu pET-32b -cecropin 45 3.2 Biểu cecropin. .. 3.1 Tách dòng (subclone) chuyển gen cecropin vào vector biểu 3.1.1 Chuyển gen cecH cecN sang vector pBS Để có vị trí tương ứng vector tách dịng vector biểu hiện, cecH cecN phải chuyển từ vector. .. từ vector nhân dịng sang vector biểu chuyển thơng qua vector nhân dòng trung gian pBS Cụ thể bước chuyển trình bày Hình 10 Hình 10 Sơ đồ thiết kế hệ thống vector biểu cecropin 2.2.1.2 Biểu cecropin